이 작업은 쓰촨성 건강위원회(120025)의 지원을 받았습니다.

본 연구에 사용된 MCF-7 세포는 상업적 출처에서 얻은 것입니다( 재료 표 참조).
1. 세포 배양
<ol><li>10% FBS 및 1% 페니실린(10,000U/mL)/스트렙토마이신(10,000μg/mL)을 함유한 DMEM을 사용하여 37°C에서 가습된 5%CO2 분위기에서 MCF-7 세포를 배양합니다( 재료 표 참조). 참고: 접시 바닥의 90%를 차지하는 세포를 실험에 사용하고 대조군, 독소루비신 염산염 그룹(DXR, 5μM) 및 Sal 그룹(20μM, 40μM 및 80μM) 또는 대조군, LY294002(10μM, PI3K 억제제) 그룹, Sal(80μM) 그룹 및 LY294002(10μM) + Sal(80μM) 그룹( 재료 표 참조).</li>
</ol>2. 세포 생존율 분석
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서27을 참조하십시오.
<ol><li>96웰 플레이트에 8 x 104 세포/웰 밀도의 MCF-7 세포를 파종하고 세포가 부착될 때까지 Sal(10μM, 20μM, 40μM, 80μM, 160μM 및 320μM)로 24시간 동안 또는 Sal(20, 40, 80μM)로 12시간/24시간/36시간/48시간 동안 배양합니다.</li>
	<li>처리 후 MCF-7 세포를 10μL/웰의 CCK-8 용액( 재료 표 참조)과 2시간 동안 공동 배양합니다. 그런 다음 자동 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm(OD450)에서 광학 밀도를 측정합니다.</li>
</ol>3. 세포 이동 및 침입
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서35를 참조하십시오.
<ol><li>접시 바닥의 90%를 덮도록 6웰 플레이트에 파종한 5 x 106 cells/mL 세포 2mL를 배양합니다.</li>
	<li>멸균 피펫 팁으로 세포 단층의 중심을 따라 선형 스크래치 감기를 수행합니다. 광학 현미경을 사용하여 0시간, 24시간, 48시간에서 이미지를 획득합니다.</li>
	<li>Image J 소프트웨어를 사용하여 긁힌 상처의 너비를 측정합니다.</li>
	<li>트랜스웰 분석의 경우, 혈청 배지 없이 MCF-7 세포를 현탁시키고 Matrigel을 사용하거나 사용하지 않고 사전 코팅된 상부 트랜스웰 챔버에 파종합니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>transwell 약실의 바닥에서는, 화학 유도자로 DMEM 완전한 매체를 이용하십시오. 24시간 후, 상부 챔버에서 세포를 제거하고, 메탄올35에 잔류하는 침습성 및 이주성 세포를 고정시킨다.</li>
	<li>MCF-7 세포를 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색합니다( 재료 표 참조). 광학 현미경을 사용하여 이미지를 캡처합니다.</li>
</ol>4. Na+-K+-ATPase 및 Ca 2+-Mg2+-ATPase의 활성 평가
<ol><li>비신코닌산(BCA) 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 용해된 MCF-7 세포의 단백질 농도를 측정합니다( 재료 표 참조).<ol><li>용해된 세포의 샘플을 해당 그룹에 96웰 플레이트에 추가합니다. 그 후, 작업 용액을 추가하여 37 °C에서 5 분 동안 추가로 배양합니다. 마지막으로 다기능 마이크로플레이트 리더로 OD636 의 값을 측정합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>5. 세포사멸 및 세포주기의 유세포 분석
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서31을 참조하십시오.
<ol><li>세포를 분해하고 인산염 완충 식염수(PBS)에서 20분 동안 annexin V-FITC 및 propidium iodide(PI)로 염색한 다음( 재료 표 참조) 유세포 분석기를 사용하여 자가사멸 세포의 수를 측정합니다.</li>
	<li>재현탁된 샘플 용액을 PI 용액과 혼합하여 30분 동안 배양한 후 유세포 분석기로 검출합니다.</li>
</ol>6. DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 형광 염색
참고: 이 절차에 대한 자세한 내용은 이전 보고서29를 참조하십시오.
<ol><li>37°C에서 10μM DCFH-DA 형광 프로브( 재료 표 참조)를 사용하여 MCF-7 세포를 20분 동안 배양합니다. PBS로 3회 세척하여 잉여 DCFH-DA를 완전히 제거한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 525nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도를 테스트합니다.</li>
	<li>MCF-7 세포를 5μM Fluo-4 AM 형광 프로브 용액( 재료 표 참조)으로 37°C에서 45분 동안 배양합니다. PBS로 세 번 세척한 후 형광 현미경을 사용하여 각각 488nm 및 516nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 강도 값을 결정합니다.</li>
</ol>7. 웨스턴 블롯
<ol><li>다양한 약물이 포함된 2mL의 5 x 10 6 cells/mL 세포 현탁액을6 웰 플레이트에 추가하고 37°C, 5%CO2 인큐베이터에서 24시간 동안 배양합니다. 참고: 웨스턴 블롯 분석을 위한 그룹은 대조군, LY294002(10μM)군, Sal(80μM)군 및 LY294002(10μM)+Sal(80μM)군으로 설정되었습니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>세포와 상층액을 수집하고 4°C에서 560× g 에서 3분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 미리 냉각된 PBS로 두 번 세척하십시오. 세척할 때마다 4°C에서 560× g 으로 3분 동안 세포를 원심분리합니다.</li>
	<li>7.2단계의 세포 샘플에 50μL 용해 완충액을 추가하여 15분 동안 얼음 목욕을 합니다. 4°C에서 8550× g 으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 단백질 샘플을 수집합니다.</li>
	<li>BCA 방법을 사용하여 단백질 농도를 검출한 후 7.3단계의 단백질 샘플을 로딩 버퍼와 4:1의 비율로 혼합하고 금속 수조에서 100°C에서 10분 동안 변성시킨 후 실온으로 냉각합니다.</li>
	<li>단계 7.4에서 단백질 표본의 20 μg를 추가하고, 10% SDS-PAGE를 사용하여 다른 분자량35를 가진 단백질을 분리하고십시오 ( 물자의 표 보십시오), 그 후에 0.22 μm PVDF 막으로 옮깁니다. 5% BSA로 막힌 후 4°C에서 하룻밤 동안 해당 1차 항체로 멤브레인을 배양합니다. 참고: 절단된 카스파제-9/7/3 (CC-9/7/3), Bim, Bax, Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α, FoxO1 및 β-actin과 같은 1차 항체의 희석 농도는 1:1,000입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>다음날 37°C에서 2시간 동안 염소 항토끼 IgG 2차 항체로 막을 배양합니다. ECL 화학발광 용액을 사용하여 멤브레인을 개발하고 비접촉식 정량적 웨스턴 블롯 이미징 시스템을 사용하여 이미지를 캡처합니다( 재료 표 참조).</li>
</ol>8. qRT-PCR (영문)
<ol><li>원심분리를 수행하여 4°C에서 560 x g 에서 3분 동안 MCF-7 세포를 수집하고 500μL 완충액 RL1을 5 × 106 세포에 추가합니다. 세포 덩어리가 보이지 않을 때까지 피펫으로 불고 반복적으로 혼합합니다. 참고: Buffer RL1은 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>8.1 단계의 세포 균질액을 수집 튜브에 내장된 DNA 세척 컬럼으로 옮기고 4°C에서 8,550× g 으로 2분 동안 원심분리합니다. DNA 세척 컬럼을 제거하고 상층액을 수집 튜브에 보관합니다. 참고: DNA 세척 컬럼과 수집 튜브는 전체 RNA 분리 키트의 두 가지 구성 요소입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>8.2단계에서 상층액 500μL에 800μL 완충액 RL2를 첨가하고 부드럽게 혼합합니다. 참고: Buffer RL2는 total RNA isolation kit의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조). 사용하기 전에 120mL의 무수 에탄올을 60mL의 완충액 RL2에 첨가합니다.</li>
	<li>단계 8.3에서 혼합물 700μL를 수집 튜브에 내장된 RNA 전용 컬럼으로 옮기고 4°C에서 1분 동안 8,550× g 으로 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오. 참고: RNA 전용 컬럼은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>8.4단계를 반복하여 8.3단계에서 나머지 혼합물을 처리합니다.</li>
	<li>RNA 전용 컬럼에 500μL의 완충액 RW1을 추가하고 4°C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오. 참고: 버퍼 RW1은 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>RNA 전용 컬럼에 700μL의 완충액 RW2를 추가하고 4 ◦C에서 8,550× g 으로 1분 동안 원심분리합니다. 수집 튜브에 있는 폐액을 버리십시오. 8.7단계를 한 번 반복합니다. 참고: 완충액 RW2는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>RNA 전용 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣고 4°C에서 8550× g 으로 2분 동안 원심분리하여 나머지 완충액 RW2를 제거합니다.</li>
	<li>RNA 전용 컬럼을 새 수집 튜브로 옮기고 65°C에서 예열된 100μL의 RNase-free ddH2O를 RNA 전용 컬럼용 멤브레인 중앙으로 떨어뜨립니다. 25°C에서 2분간 방치하고, 4°C에서 8,550× g 에서 1분간 원심분리하여 RNA 용액을 채취합니다. 참고: RNase-free ddH2O는 전체 RNA 분리 키트의 구성 요소 중 하나입니다( 재료 표 참조).</li>
	<li>4 μL의 5x 반응 완충액, 1 μL의 올리고(dT)18 프라이머, 1 μL의 무작위 헥사머 프라이머, 1 μL의 유전자 특이적 프라이머(표 1 참조), 1 μL의 효소 혼합물 및 8.9단계의 RNA 용액 5 μg을 100 μL 8-튜브 스트립에 추가합니다. RNase가 없는 물로 반응 시스템을 20μL까지 보충합니다.</li>
	<li>시스템의 반응 조건을 다음과 같이 설정하십시오 : (1) : 95 °C, 30 s, 1 사이클; (2): 95°C, 5초, 50주기, 60°C, 34초; (3): 95°C, 5초, 1주기, 65°C, 60초, 97°C, 1초; 및 (4): 42°C, 30초, 1사이클. qRT-PCR 프로시저를 실행합니다. 참고: 표적 유전자의 상대적 발현 수준은 2−ΔΔCT 방법36,37에 의해 정량적으로 분석되었습니다. qRT-PCR 분석에 사용되는 각 유전자의 프라이머 정보는 표 1에 기재되어 있다.</li>
</ol>9. 통계 분석
<ol><li>데이터를 세 개의 독립적인 실험의 평균 ± 표준 편차로 표현합니다.</li>
	<li>그래프 및 분석 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 단방향 분산 분석(ANOVA)과 Tukey의 검정을 사용하여 여러 그룹 간의 비교를 분석합니다. 이 연구에서 P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 정의되었습니다.</li>
</ol>

Salidroside의 MCF-7 세포 이동 및 증식 억제 메커니즘

저자는 공개할 것이 없습니다.

유방암은 모든 연령대의 개인에게 영향을 미치며 헤아릴 수 없는 신체적, 정신적 부담과 큰 경제적 압박을 유발합니다1. 매년 이환율과 사망률이 증가하는 유방암은 기존 치료법을 넘어 효과적인 한방 기반 복합 요법을 찾는 측면에서 전 세계적으로 주목을 받고 있습니다 4,5. 유망하게도, Sal24,25,38<sup class="xre...

가장 흔하게 진단되는 암 및 가장 흔한 악성 종양 중 하나인 유방암은 최신 통계에 따르면 2020년까지 전 세계적으로 230만 건의 유방암이 발생하여 전체암 사례의 11.7%를 차지합니다1. 유방암의 일반적인 증상으로는 유방 압통과 따끔거림, 유방 덩어리 및 통증, 유두 분비물, 미란 또는 함몰된 피부, 겨드랑이 림프절 비대증등이 있다 1,2. 더욱 우려스러운 것은 유방암의 신규 발병 건수와 전체 발병률이 매년 압도적인 비율로 계속 증가하여 암 관련 사망의 6.9%를 차지한다는 것입니다1. 현재 유방암 중재는 여전히 주로 화학 요법, 수술, 방사선 요법 및 포괄적 인 치료를 포함합니다. 치료는 환자의 재발률과 사망률을 효과적으로 낮출 수 있지만, 장기간의 치료는 종종 다제내성, 대면적 탈모, 메스꺼움 및 구토, 심각한 정신적, 심리적 부담을 유발한다 2,3. 특히, 유방암으로 인한 다발성 장기 전이의 잠재적 위험으로 인해 사람들은 약물 요법의 새로운 약초 공급원을 찾게 된다 4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K) 매개 신호전달은 여러 유전자의 발현에 영향을 미치는 스플라이싱을 통해 유방암의 성장, 증식 및 생존에 관여한다6. PI3K의 다운스트림 신호 감지 단백질인 단백질 키나아제 B(AKT)가 포유류 표적인 라파마이신(mTOR) 단백질과 결합하여 유방암을 더욱 증가시킬 수 있다는 수많은 증거가 있습니다 7,8,9. 또한, PI3K/AKT/mTOR 신호전달의 비활성화는 유방암에서 악성 증식을 억제하고 세포사멸을 자극하는 약물의 핵심 성분이라고 주장되어 왔다10,11,12. 종양 미세환경에서의 극심한 저산소증은 저산소증 유발 인자 1 알파(HIF-1α)의 급증을 강요하며, 이는 유방암의 진행을 더욱 악화시킨다는 것은 잘 알려져 있다13,14,15. 동시에, AKT 자극은 또한 HIF-1α의 과도한 축적을 유도하여, 유방암 샘플에서 세포사멸을 제한한다16,17. 흥미롭게도, PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 활성화는 폐암18, 대장암19, 난소암20, 전립선암21을 포함한 다양한 암에서 병리학적 진행 및 전이에 관여하는 것으로 확인되었다. HIF-1α에 의해 조율되는 것 외에도 갈래 머리 전사 인자 1(FoxO1) 과발현은 AKT 신호 자극에 의해 유발되며, 이는 주기 정지 및 유방암 세포의 세포 사멸 억제를 촉진합니다22,23. 위의 확실한 증거는 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달의 캐스케이드 억제가 유방암에서 약물 요법을 위한 잠재적인 새로운 표적이 될 수 있음을 시사합니다.
Salidroside (Sal)는 항암 24,25, 항 저산소증26,27,28,29 및 면역 강화 약리 활성30을 발휘하는 것으로 널리 입증되었습니다. 물에 쉽게 용해되는 밝은 갈색 또는 갈색 분말이며 페닐에탄노이드 배당체의 일종이며 화학 구조식은 C14H 20 O7이고 분자량은300.331,32입니다. 현대의 약리학적 연구는 Sal이 PI3K-AKT-mTOR 신호전달을 억제함으로써 위암 세포의 세포사멸을 촉진할 수 있음을 입증했다24. 추가 증거는 또한 Sal 치료에 의한 PI3K-AKT-HIF-1α 신호전달의 억제가 화학요법제에 대한 암세포의 감수성을 향상시킴으로써 암세포의 세포사멸에 기여할 수 있음을 시사한다25. 증거는 또한 Sal이 세포 이동 및 침입을 제한하고 인간 유방암 MCF-7 세포33,34에서 세포 사멸을 촉진하여 주기 정지를 유발한다는 것을 시사합니다. 그러나 Sal이 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 신호전달을 조절하고 MCF-7 세포의 악성 증식을 억제할 수 있는지는 아직 밝혀지지 않았습니다. 따라서 이 프로토콜은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 통해 MCF-7 세포 이동, 침입, 세포 주기 및 세포 사멸에 대한 Sal의 효과를 탐색하는 것을 목표로 했습니다. 세포 이동 및 침습 평가, 유세포 분석에 의한 세포 사멸 및 세포 주기 검출, 활성 산소 종(ROS) 및 Ca2+ 형광 측정 등과 같은 기존의 저비용 및 독립적인 실험으로 구성된 통합 연구 전략은 전통 한약을 사용한 항암 연구를 위한 전반적인 실험 설계에 대한 참고 자료를 제공할 수 있습니다. 이 연구의 실험 과정은 그림 1에 나와 있습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1% penicillin/streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT0185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Annexin V-FITC/PI kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>AP101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax iD5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bax antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#5023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA kit</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL521A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bcl-2 antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#15071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bim antibody</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#2933</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-4-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counting kit-8</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BS350B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell cycle staining kit</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>CCS012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-3</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#9661</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-7</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#8438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cleaved caspase-9</td>
			<td>Cell Signaling Technology, Inc.</td>
			<td>#20750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet solution</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>C0121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose culture medium</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G4510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-15142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ECL chemiluminescent solution</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL520B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>164210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD</td>
			<td>FACSCanto <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/65634/65634eq01.jpg" style="margin: auto;" /></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluo-4 AM</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FoxO1 antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YT1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG secondary antibody</td>
			<td>MultiSciences Biotech Co., Ltd.</td>
			<td>70-GAR0072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism software</td>
			<td>La Jolla</td>
			<td>Version 6.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HIF-1&#945; antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>BF8002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human breast cancer cell line MCF-7</td>
			<td>Procell Life Science &#38; Technology Co., Ltd.</td>
			<td>CL-0149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loading buffer</td>
			<td>Biosharp Life Sciences</td>
			<td>BL502B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LY294002</td>
			<td>MedChemExpress</td>
			<td>HY-10108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel</td>
			<td>Thermo&#160;</td>
			<td>356234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTOR antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na+&#8211;K+&#8211;ATPase assay kit</td>
			<td>Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute</td>
			<td>A070-2-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX71PH</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-AKT antibody</td>
			<td>ImmunoWay Biotechnology Company</td>
			<td>YP0006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PI3K antibody</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>GB11525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-PI3K antibody</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF3241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantitative western blot imaging system</td>
			<td>Touch Image Pro</td>
			<td>eBlot</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reverse transcription first strand cDNA synthesis kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G3330-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROS assay kit</td>
			<td>Beyotime Biotechnology</td>
			<td>S0033S</td>
			<td>DCFH-DA fluorescence probe is included here</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salidroside</td>
			<td>Chengdu Herbpurify Co., Ltd.</td>
			<td>H-040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Servicebio Technology Co., Ltd.</td>
			<td>G2003-50T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Total RNA isolation kit</td>
			<td>Foregene</td>
			<td>RE-03014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30042.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-actin</td>
			<td>Affinity Biosciences</td>
			<td>AF7018</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

exploring the pharmacological action and molecular mechanism of salidroside in inhibiting mcf-7 cell proliferation and migration

Salidroside (Sal)는 항 발암성, 항 저산소 및 항 염증 약리 활성을 포함합니다. 그러나, 그것의 근본적인 반대로 유방암 기계장치는 단지 불완전하게 해명되었다. 따라서 이 프로토콜은 인간 유방암 MCF-7 세포의 악성 증식에서 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 조절하는 Sal의 잠재력을 해독하기 위한 것입니다. 먼저, MCF-7에 대한 Sal의 약리활성을 CCK-8 및 세포 스크래치 분석으로 평가하였다. 또한, MCF-7 세포의 내성은 이동 및 Matrigel 침습 분석에 의해 측정되었습니다. 세포 사멸 및 주기 분석을 위해 MCF-7 세포는 각각 유세포 분석을 위해 annexin V-FITC/PI 및 세포 주기 염색 검출 키트를 사용하여 단계적으로 처리되었습니다. 활성 산소종(ROS) 및 Ca2+의 수준은 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 면역형광 염색으로 검사되었습니다. Na+-K+-ATPase 및 Ca2+-ATPase의 활성은 해당 상용 키트를 사용하여 측정하였다. 세포사멸 및 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로의 단백질 및 유전자 발현 수준은 각각 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석을 사용하여 추가로 측정되었습니다. Sal 치료는 용량 의존적 효과로 MCF-7 세포의 증식, 이동 및 침입을 유의하게 제한한다는 것을 발견했습니다. 한편, Sal 투여는 MCF-7 세포가 세포사멸(apoptosis)과 세포주기 정지(cell cycle arrest)를 겪도록 극적으로 강제했다. 면역형광 검사는 Sal이 MCF-7 세포에서 ROS 및 Ca2+ 생산을 관찰할 수 있게 자극하는 것으로 나타났습니다. 추가 데이터는 Sal이 pro-apoptotic 단백질, Bax, Bim, 절단된 caspase-9/7/3 및 해당 유전자의 발현 수준을 촉진한다는 것을 확인했습니다. 일관되게 Sal 중재는 Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1α 및 FoxO1 단백질과 해당 유전자의 발현을 현저하게 감소시켰습니다. 결론적으로, Sal은 PI3K-AKT-HIF-1α-FoxO1 경로를 억제하여 MCF-7 세포의 악성 증식, 이동 및 침입을 줄일 수 있기 때문에 유방암 치료를 위한 잠재적인 허브 유래 화합물로 사용할 수 있습니다.

As one of the most commonly diagnosed cancers and most common malignancies, the latest statistics indicate that 2.3 million cases of breast cancer emerged around the world by 2020, accounting for 11.7% of all cancer cases1. Common symptoms of breast cancer include breast tenderness and tingling, breast lumps and pain, nipple discharge, erosion or sunken skin, and enlarged axillary lymph nodes1,2. Even more alarming, the number of new cases and the overall incidence of breast cancer continues to increase at an overwhelming rate each year, accounting for 6.9% of cancer-related deaths1. At present, breast cancer intervention still mainly involves chemotherapy, surgery, radiotherapy, and comprehensive treatment. Although treatment can effectively reduce the recurrence rate and mortality rate of patients, long-term treatment application often causes produce multidrug resistance, large-area hair loss, nausea and vomiting, and serious mental and psychological burden2,3. Notably, the potential risk of multiple organ metastases from breast cancer also forces people to seek novel herbal sources of drug therapy4,5.
Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)-mediated signaling is implicated in the growth, proliferation, and survival of breast cancer through splicing that affects the expression of multiple genes6. As a downstream signal-sensing protein of PI3K, numerous evidence suggests that protein kinase B (AKT) could couple with the mammalian target of rapamycin (mTOR) protein to further increase breast cancer7,8,9. Moreover, the deactivation of PI3K/AKT/mTOR signaling has also been claimed to be a key component in drugs inhibiting malignant proliferation and stimulating apoptosis in breast cancer10,11,12. It is well known that extreme hypoxia in the tumor microenvironment forces a massive surge in hypoxia-inducible factor 1 alpha (HIF-1&#945;), which further worsens the progression of breast cancer13,14,15. In parallel, AKT stimulation also leads to excessive accumulation of HIF-1&#945;, limiting apoptosis in breast cancer samples16,17. Interestingly, the activation of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling has been confirmed to be involved in pathologic progression and metastasis in a variety of cancers, including lung cancer18, colorectal cancer19, ovarian cancer20, and prostate cancer21. In addition to being orchestrated by HIF-1&#945;, forked head transcription factor 1 (FoxO1) overexpression is also triggered by AKT signaling stimulation, which promotes cycle arrest and the inhibition of apoptosis in breast cancer cells22,23. Together, the above solid evidence suggests that the inhibition of the cascade of PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling may be a potential novel target for drug therapy in breast cancer.
Salidroside (Sal) has been widely demonstrated to exert anti-cancer24,25, anti-hypoxia26,27,28,29, and immune-enhancing pharmacological activities30. It is a light brown or brown powder that is easily soluble in water, is a type of phenylethanoid glycoside, and has a chemical structure formula of C14H20O7 and a molecular weight of 300.331,32. Modern pharmacological investigations have demonstrated that Sal can promote the apoptosis of gastric cancer cells by restraining PI3K-AKT-mTOR signaling24. Further evidence also suggests that the suppression of PI3K-AKT-HIF-1&#945; signaling by Sal treatment may contribute to the apoptosis of cancer cells by enhancing their sensitivity to chemotherapeutic agents25. Evidence also suggests that Sal restricts cell migration and invasion and causes cycle arrest by promoting apoptosis in the human breast cancer MCF-7 cells33,34. However, it remains to be seen whether Sal can regulate PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 signaling and inhibit the malignant proliferation of MCF-7 cells. Therefore, this protocol aimed to explore the effects of Sal on MCF-7 cell migration, invasion, cell cycle, and apoptosis via the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway. The integrated research strategies comprising conventional, low-cost, and independent experiments, such as cell migration and invasion assessments, apoptosis and cell cycle detection by flow cytometry, reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ fluorescence determination, etc., can provide a reference for the overall design of experiments for anti-cancer research with traditional herbal medicine. The experimental process of this study is shown in Figure 1.

저자 스포트라이트: 유방암 치료에서 Salidroside의 분자 메커니즘 탐구 

MCF-7 세포 증식 및 이동 억제에서 Salidroside의 약리학적 작용 및 분자 메커니즘 탐구

We focus on exploring active compounds derived from natural products and their potential in treating breast cancer. So specifically we aim to elucidate the pharmacologic effects of salidroside and its molecular mechanisms in combining breast cancer. Currently, reliable experimental techniques are lacking to validate salidroside's molecular targets in treating breast cancer.One significant finding in the field is a potential molecular mechanism of salidroside in enhancing the proliferation and migration of MCF7 cells through the regulation of PI3K/AKT/HIF-1 alpha/FoxO1 signaling. The laboratory's future research directly is to explore the pathophysiological mechanisms underlying breast cancer onset, development, prognosis and outcome. Additionally, we screen for active small molecular drugs derived from natural sources that may add in breast cancer prevention and treatment.

MCF-7 세포의 과잉 증식 억제 및 상처 치유 지연에 대한 Sal의 효과 유방암에 대한 Sal의 잠재력을 조사하기 위해 먼저 인간 유방암 MCF-7 세포주의 세포 증식 독성 및 스크래치 분석을 사용하여 항암 특성을 테스트했습니다. 이들 세포를 24시간 동안 일련의 Sal(5-320μM) 농도와 함께 공동 배양하고, CCK-8 분석을 사용하여 세포 증식을 평가하였다. 세포 증식에 대한 Sal의 용량 의존적 억제 효...

Watch this Scientific Journal Video about Exploring Salidroside's Molecular Mechanisms in Breast Cancer Treatment at JoVE.com

본 프로토콜은 MCF-7 세포 증식 및 이동을 억제하는 살리드로사이드의 약리학적 작용 및 기전을 평가하기 위한 포괄적인 전략을 설명합니다.

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer ...

우리는 천연 제품에서 파생된 활성 화합물과 유방암 치료에 대한 잠재력을 탐구하는 데 중점을 둡니다. 그래서 구체적으로 우리는 유방암을 결합하는 데 있어 살리드로사이드와 그 분자 메커니즘의 약리학적 효과를 해명하는 것을 목표로 합니다. 현재, 유방암 대우에 있는 salidroside의 분자 표적을 유효하게 하는 믿을 수 있는 실험 기술은 결여되어 있습니다.이 분야에서 한 가지 중요한 발견은 PI3K/AKT/HIF-1 알파/FoxO1 신호의 조절을 통해 MCF7 세포의 증식 및 이동을 향상시키는 살리드로사이드의 잠재적인 분자 메커니즘입니다. 이 실험실의 향후 연구는 유방암의 발병, 발병, 예후 및 결과의 기저에 있는 병태생리학적 메커니즘을 탐구하는 것입니다. 또한, 유방암 예방 및 치료에 도움이 될 수 있는 천연 원료에서 추출한 활성 저분자 약물을 선별합니다.

exploring-pharmacological-action-molecular-mechanism-salidroside

Research

JoVE Journal

Medicine

Exploring the Pharmacological Action and Molecular Mechanism of Salidroside in Inhibiting MCF-7 Cell Proliferation and Migration

898 조회수.  Suining Central Hospital. 우리는 천연 제품에서 파생된 활성 화합물과 유방암 치료에 대한 잠재력을 탐구하는 데 중점을 둡니다. 그래서 구체적으로 우리는 유방암을 결합하는 데 있어 살리드로사이드와 그 분자 메커니즘의 약리학적 효과를 해명하는 것을 목표로 합니다. 현재, 유방암 대우에 있는 salidroside의 분자 표적을 유효하게 하는 믿을 수 있는 실험 기술은 결여되어 있습니다.이 분야에?...

비디오: 저자 스포트라이트: 유방암 치료에서 Salidroside의 분자 메커니즘 탐구 

Salidroside (Sal) contains anti-carcinogenic, anti-hypoxic, and anti-inflammatory pharmacological activities. However, its underlying anti-breast cancer mechanisms have been only incompletely elucidated. Hence, this protocol intended to decode the potential of Sal in regulating the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway in the malignant proliferation of human breast cancer MCF-7 cells. First, the pharmacological activity of Sal against MCF-7 was evaluated by CCK-8 and cell scratch assays. Moreover, the resistance of MCF-7 cells was measured by migration and Matrigel invasion assays. For cell apoptosis and cycle assays, MCF-7 cells were processed in steps with annexin V-FITC/PI and cell cycle-staining detection kits for flow cytometry analyses, respectively. The levels of reactive oxygen species (ROS) and Ca2+ were examined by DCFH-DA and Fluo-4 AM immunofluorescence staining. The activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were determined using the corresponding commercial kits. The protein and gene expression levels in apoptosis and the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway were further determined using western blot and qRT-PCR analyses, respectively. We found that Sal treatment significantly restricted the proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells with dose-dependent effects. Meanwhile, Sal administration also dramatically forced MCF-7 cells to undergo apoptosis and cell cycle arrest. The immunofluorescence tests showed that Sal observably stimulated ROS and Ca2+ production in MCF-7 cells. Further data confirmed that Sal promoted the expression levels of pro-apoptotic proteins, Bax, Bim, cleaved caspase-9/7/3, and their corresponding genes. Consistently, Sal intervention prominently reduced the expression of the Bcl-2, p-PI3K/PI3K, p-AKT/AKT, mTOR, HIF-1&#945;, and FoxO1 proteins and their corresponding genes. In conclusion, Sal can be used as a potential herb-derived compound for treating breast cancer, as it may reduce the malignant proliferation, migration, and invasion of MCF-7 cells by inhibiting the PI3K-AKT-HIF-1&#945;-FoxO1 pathway.

The present protocol describesa comprehensive strategy for evaluating the pharmacological action and mechanism of salidroside in inhibiting MCF-7 cell proliferation and migration.

연구

의학

Evaluating the Migration and Invasion of Salidroside Treated MCF-7 Cells in a Wound Scratch Assay

To begin, incubate two milliliters of the cultured MCF-7 cells in a six-well plate until 90%confluency. In the grown cell monolayer, create a linear scratch wound down the center using a sterile pipette tip. Then capture the images with an optical microscope at different time intervals.For the transwell assay, suspend MCF-7 cells in a serum-free medium. Then see the cells in the upper transwell chamber, either pre-coded or non-coded with Matrigel. Add DMEM complete medium at the bottom of the transwell chamber to act as a chemical inducer.After 24 hours, remove the cells in the upper chamber and fix the remaining invasive and migrant cells using methanol. Stain the MCF-7 cells using crystal violet solution. Next, image the stained cells with an optical microscope.A dose dependent inhibitory effect of salidroside on cell proliferation was observed, with a 50%decline in cell vitality at 40 micromolar. Further, salidroside could inhibit the vitality of MCF-7 cells over time, with a 50%decrease in MCF-7 cell vitality after 24 hours of co-incubation. The wound-scratch assay showed an inhibitory effect for salidroside treatment on MCF-7 cells.Further, salidroside treatment significantly reduced the undesirable migration and invasion of MCF-7 cells.

상처 스크래치 분석에서 Salidroside 처리된 MCF-7 세포의 이동 및 침입 평가

Determining Na+-K+-ATPase and Ca2+-Mg2+-ATPase Activity in Salidroside Treated MCF-7 Cells

Using a bicinchoninic acid kit, measure the protein concentration of lysed MCF-7 cells following the manufacturer's instructions. Add the lysed cell samples into the corresponding groups in a 96-well plate. Then, add the working solution and incubate at 37 degrees Celsius for five minutes.Finally, measure the optical density values at 636 nanometers in a functional microplate reader. Salidroside restricted the enzyme vitalities of sodium potassium ATPases and calcium ATPase, indicating its potential role in promoting mitochondrial dysfunction.

Salidroside 처리된 MCF-7 세포에서 Na+-K+-ATPase 및 Ca 2+-Mg2+-ATPase 활성 측정

Flow Cytometry Analysis of Apoptosis and the Cell Cycle in Salidroside Treated MCF-7 Cells

To begin, harvest the trypsinized MCF7 cells. Next, stain the PBS suspended cells with an X in five of ITC, and propidium iodide, for 20 minutes. Then determine the number of apoptotic cells using a flow cytometer.For cell cycle analysis, mix the re-suspended cells with propidium iodide solution in a fresh tube, and incubate the mixture for 30 minutes. Then detect the sample using a flow cytometer. Salidroside increased the number of MCF7 cells in the early and late apoptotic stages.Meanwhile, compared with the control group, salidroside treatment also sharply increased the number of cells in the G0 G1 phase, while reducing the proportion of S phase cells.

Salidroside 처리된 MCF-7 세포의 세포사멸 및 세포주기에 대한 유세포 분석 분석

DCFH-DA and Fluo-4 AM Fluorescence Staining of Salidroside Treated MCF-7 Cells

Add 10 micromolar of Dcfh-DA fluorescence probe to MCF7 cells and incubate at 37 degrees Celsius for 20 minutes. After incubation, remove the excess Dcfh-DA by washing the cells three times with PBS. Next, test the fluorescence intensity using a fluorescence microscope and an excitation wavelength of 488 nanometers, and an emission wavelength of 525 nanometers.Incubate the MC7 cells with a five micromolar Fluo-4 AM fluorescent probe solution for 45 minutes at 37 degrees Celsius. After washing the cells three times with PBS, determine the fluorescence intensity using a fluorescence microscope with excitation at 488 nanometers and emission at 516 nanometers. Salidroside significantly enhanced ROS fluorescence signals shown by Dcfh-DA immunofluorescent staining.Consistently, Salidroside intervention also distinctly elevated calcium production, evidenced by Fluo-4 AM immunofluorescent staining.

Salidroside 처리된 MCF-7 세포의 DCFH-DA 및 Fluo-4 AM 형광 염색

Analyzing Protein Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells by Western Blotting

Begin by adding two milliliters of MCF-7 cells containing different drugs into the wells of a six-well plate. Incubate the cell cultures for 24 hours at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide. Harvest the cells by centrifugation at 560 x g for three minutes at four degrees Celsius.Then wash the cells twice with pre-cool PBS, centrifuging at 560 x g for three minutes between the washes. Add 50 microliters of lysis buffer to the washed cells and place the sample in an ice bath for 15 minutes. Then centrifuge the sample at 8, 550 x g for 10 minutes at four degrees Celsius, and collect the supernatant protein sample.Combine the protein sample with the loading buffer in a four to one ratio. Next, denature the mixture at 100 degrees Celsius for 10 minutes in a metal bath. Then cool the mixture at room temperature.Separate the protein sample using 10%SDS polyacrylamide gel electrophoresis. Transfer the proteins onto a 0.22 micrometer PVDF membrane. After blocking the membrane with 5%BSA, incubate it with the corresponding primary antibodies overnight at four degrees Celsius.The following day, incubate the membrane with goat anti-rabbit IgG secondary antibody at 37 degrees Celsius for two hours. Then develop the membranes using an ECL chemiluminescence solution and capture the images using a contactless quantitative Western blot imaging system. Western blot showed that salidroside treatment promoted the protein expression of the pro-apoptotic factors CC-9, CC-7, CC-3, Bim, and Bax while it inhibited the protein expression of anti-apoptotic BCL-2.Salidroside prominently limited the ratios of p-PI3K to PI3K and p-AKT to AKT. Meanwhile, the protein expression of mTOR, HIF-1 alpha, and Fox01 was also notably suppressed.

Western Blotting에 의한 Salidroside 처리된 MCF-7 세포의 단백질 발현 분석

Determining Gene Expression in Salidroside Treated MCF-7 Cells Using qRT-PCR

Harvest the MCF-7 cells by centrifugalization at 560-G for three minutes, at four degrees Celsius. Add 500 microliters of buffered RL-1 to five times 10 to the six cells and mix thoroughly until no cell masses are visible. Next, transfer the cell homogenates to a DNA cleaning column embedded in the collection tube.Centrifuge the samples at 85-50-G for two minutes, at four degrees Celsius. After centrifuging, remove the DNA cleaning column, retaining the supernatant in the collection tube. Add 800 microliters of buffer RL-2 and 500 microliters of the supernatant, and mix gently.Next, transfer 700 microliters of the mixture into an RNA-only column embedded in the collection tube. Centrifuge the tube at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius. Then discard the flow-through in the collection tube.Wash the RNA-only column first with 500 milliliters of buffer RW-1, and then with 700 milliliters of buffer RW-2, by centrifuging for one minute at 8, 550-G, and four degrees Celsius at each wash. After removing the residual RW-2 by centrifuging again, transfer the RNA only column to a new collection tube. Add 100 microliters of RNAs-free deionized water, preheated at 65 degrees Celsius to the center of the membrane in the RNA-only column, and wait for two minutes.Then centrifuge at 8, 550-G for one minute, at four degrees Celsius to collect the RNA solution. Set up the reaction mixture for PCR and then set the PCR reaction conditions of the system. Execute the QRT PCR procedure.QRT PCR showed that cylindricity treatment promoted the gene expression of the pro-apoptotic factors, CC-9, CC-7, CC-3, vim, and vax, while it inhibited the gene expression of anti-apoptotic BCL-2. Further, cylindricide administration reduced the gene expression levels of PI-3K, AKT, M-tor, HIF1-Alpha and Fox-01.