A.S와 J.K는 자금 지원을 해주신 Cancer Research UK와 OHSU에 감사의 뜻을 전합니다(CRUK-OHSU Project Award C65925/A26986). A.S는 MRC 경력 개발 상(MR/N024028/1)의 지원을 받습니다. AA는 박사 장학금(장학금 참조 1078107040)으로 자금을 지원합니다. JK는 MRF New Investigator Grant(GCNCR1042A)와 Knight CEDAR Grant(68182-933-000, 68182-939-000)의 자금 지원을 받습니다. 재프로그래밍 벡터 pSIN4-EF1a-O2S 및 pSIN4-CMV-K2M을 제공해 주신 Keisuke Kaji 교수님께 감사드립니다. 오픈 액세스를 위해 저자는 이 제출물에서 발생하는 모든 저자 수락 원고 버전에 크리에이티브 커먼즈 저작자표시(CC BY) 라이선스를 적용했습니다.

PDAC 및 췌장 세포를 유도 만능 줄기 세포로 재프로그래밍

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

암 진행을 연구하기 위한 iPSC 재프로그래밍의 사용을 용이하게 하기 위해 췌장암 세포를 재프로그래밍하기 위한 강력한 프로토콜이 확립되었습니다. 암세포를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 지금까지 매우 어려운 것으로 입증되었는데, 이는 암세포로부터 iPSC를 성공적으로 생성한 연구가 소수에 불과하기 때문이다 32,36,37,38,39,40,41,42,43,44,45,46<...

췌관 선암(PDAC)은 가장 치명적인 악성 종양 중 하나이며, 질병의 무증상 특성으로 인해 조기 진단이 여전히 어렵습니다. PDAC 환자의 대다수는 매우 제한된 치료 옵션을 이용할 수 있는 진행성 전이성 단계에서 진단됩니다 1,2. 이는 주로 혈류로 방출되는 단백질로 편리하게 검출될 수 있는 것과 같은 초기 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문입니다.
PDAC는 진행 중 매우 초기에 퍼질 수 있으며, PDAC가 췌장에 국한되어 있을 때 더 나은 예후가 암 조기 발견과 관련이 있다3. 그러나 PDAC 환자의 10분의 1 미만이 예후가 양호하여 외과적 절제가 가능하다는 진단을 받습니다. 그럼에도 불구하고 절제 가능한 종양이 있는 소수의 종양은 12개월 이내에 재발하기 쉽다4.
지난 50년 동안 수술 기법, 환자 치료 및 치료 방식에서 괄목할 만한 개선이 이루어졌다 5,6. 그러나 수술로 절제된 PDAC 환자의 5년 생존율은 17%로 거의 증가하지 않았습니다. 그럼에도 불구하고 이는 거의 변하지 않은 비절제 환자(0.9%)보다 여전히 양호합니다4,7. 화학 요법은 유일한 대체 PDAC 치료법입니다. 그러나 대다수의 PDAC 환자가 젬시타빈 7,8과 같은 화학요법 약물에 강한 내성을 보이기 때문에 이 옵션은 매우 제한적입니다. 엘로티닙(Erlotinib)과 같은 다른 약물은 특정 돌연변이를 가진 소수의 PDAC 환자에게만 제공되며, 이들 중 대부분은 엘로티닙 내성을 보인다9. 대부분의 PDAC 환자에서 화학요법과 관련된 부작용은 이 치료법의 또 다른 단점이다10. 최근에는 면역관문억제제(ICI)와 저분자 키나아제 억제제(SMKI)가 PDAC 치료에 효과적일 수 있다는 유망한 전략이 제시되었지만, 이러한 표적 치료제에 대한 지속적인 반응은 여전히 소수의 환자로 제한되어 있다11,12. 전반적으로, PDAC 특이적 초기 바이오마커의 발견은 조기 진단 및 치료를 위한 새로운 길을 열 수 있습니다.
PDAC는 비침습적 췌관 상피 증식(non-invasive pancreatic tulatial epithelial proliferations)으로 인한 췌장 상피내 신생물(panIN) 전구체 병변에서 발생한다13,14. PanIN의 형성은 KRAS와 같은 종양유전자 돌연변이에 의해 시작되지만, PDAC로 진행되기 위해서는 추가적인 유전적 및 후성유전학적 변형이 필요합니다. PanIN이 여러 단계를 거쳐 침습적 PDAC로 진행되는 데는 약 10년이 걸릴 것으로 예상됩니다 13,15,16,17. 이 기간은 조기 PDAC 진단의 이점을 누릴 수 있는 좋은 기회를 제공합니다. 따라서 PDAC 진행을 연구하기 위해 종양 이종이식 동물 모델 및 오가노이드 배양을 확립하기 위한 광범위한 연구가 수행되었습니다 18,19,20,21. 이러한 모델은 PDAC의 침습 단계를 연구하는 데 매우 유용하지만 초기 PanIN 단계로부터의 전환은 아닙니다. 따라서 조기 검출 바이오마커를 발견할 수 있도록 PanIN 단계의 초기 진행을 재현할 수 있는 실험 모델을 개발하는 것이 중요합니다.
4개의 전사 인자 OCT4, SOX2, KLF4 및 c-MYC(OSKM)를 사용하여 체세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 것은 세포 가소성의 정도를 보여줍니다22. 암세포 가소성은 잘 문서화되어 있으며, 인간 암세포를 iPSC로 재프로그래밍하는 것은 세포를 원래의 세포 상태로 재설정하는 데 성공적으로 사용되어 암 진행 중에 축적된 많은 후성유전학적 모욕을 제거했습니다 23,24,25,26,27,28,29. 따라서 암세포 정체성을 조작하기 위해 이 재프로그래밍 전략을 사용할 수 있는 가능성은 암 치료에 큰 가능성을 제시했다30,31. 실제로, PDAC에서 유래한 iPSC의 분화가 초기 PanIN 단계(32)를 통해 PDAC 진행을 재현할 수 있음을 이전에 보여주었습니다. PDAC의 초기에서 중간 단계에 특이적인 유전자 및 경로를 식별함으로써 조기 PDAC 진단에 임상적으로 사용할 수 있는 후보 바이오마커를 식별했습니다32,33. 그러나, 단일 iPSC 라인을 사용하여 발견된 바이오마커는 PDAC 환자의 대다수에서 제한된 커버리지를 보였다32. 다른 PDAC 환자로부터 iPSC 세포주를 생성하는 데 따르는 어려움으로 인해 보다 신뢰할 수 있는 바이오마커를 발견하는 능력이 중단되었습니다. 이는 OSKM 전달의 이질성을 포함한 많은 기술적 요인 때문인데, 인간 1차 PDAC 세포의 극히 일부만이 4가지 요인을 모두 포함하고 재프로그래밍에 성공적으로 반응했기 때문입니다. 여기에서는 OSKM의 보다 효율적이고 일관된 이중 렌티바이러스 전달을 사용하여 1차 PDAC 세포를 재프로그래밍하기 위한 자세한 프로토콜을 제시합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2-Mercaptoethanol (50 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31350010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 anti- human TRA-1-60-R</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>330613</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Pituitary Extract (BPE)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13028014</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BxPc3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1687</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholera Toxin from Vibrio cholerae</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C8052-1MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen, Type I solution from rat tail</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>C3867</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Completed Defined K-SFM</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>&#160;10744-019</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plates</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS3516</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning syringe filters</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS431231</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>CLS430599</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Day Impex&#160;Virkon Disinfectant Virucidal Tablets</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12328667</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8242;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>D8537</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10270-106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fugene HD Transfection Reagent&#160;</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>&#160;E2312</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin solution, Type B, 2% in H2O</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G1393-100ML</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glasgow Minimum Essential Media (GMEM)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>G5154</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human EGF Recombinant Protein</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHG0311</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human FGF-basic (FGF-2/bFGF) (154 aa) Recombinant Protein, PeproTech</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>100-18B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Pancreatic Duct Epithelial Cell Line (H6c7)</td>
			<td>Kerafast</td>
			<td>ECA001-FP</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iMEF feeder cells&#160;</td>
			<td>iXcells Biotechnologies</td>
			<td>10MU-001-1V</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte Serum Free Media (KSFM)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>17005-042</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut DMEM&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10829018</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KnockOut serum Replacement&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>10828028</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25030-024</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11140050</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millex-HP 0.45 &#956;M syringe Filter Unit (Sterile)</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>SLHP033RS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM Reduced Serum Medium&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>31985062</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pMDG&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>187440</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybrene (Hexadimethrine bromide)&#160;</td>
			<td>Merck&#160;</td>
			<td>H9268-5G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-CMV-K2M&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21164</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pSIN4-EF2-O2S&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>21162</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>psPAX2</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12260</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pWPT-GFP&#160;</td>
			<td>AddGene</td>
			<td>12255</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 Medium (ATCC modification)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>A1049101</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodym Pyruvate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>11360-039</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Syringes for Single Use (60 mL)&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15899152</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express Enzyme (1x), phenol red</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12605036</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15575020</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y-27632 (Dihydrochloride)</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>72304</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

reprogramming pancreatic ductal adenocarcinoma to pluripotency

전사 인자를 사용한 유도만능줄기세포(iPSC)의 생성은 거의 모든 분화된 세포 유형에서 이루어졌으며 연구 및 임상 응용 분야에서 매우 가치 있는 것으로 입증되었습니다. 흥미롭게도, 췌관 선암종(pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC)과 같은 암세포의 iPSC 재프로그래밍은 침습성 PDAC 표현형을 되돌리고 암 후성유전체를 무시하는 것으로 나타났습니다. PDAC 유래 iPSC의 분화는 초기 췌장 상피내 종양(PanIN) 전구체에서 PDAC 진행을 재현하여 PDAC 진행 초기에 발생하는 분자 및 세포 변화를 밝힐 수 있습니다. 따라서 PDAC에서 파생된 iPSC는 조기 검출 진단 마커를 발견하기 위해 PDAC의 초기 단계를 모델링하는 데 사용할 수 있습니다. 이는 초기 PanIN 단계에 대한 신뢰할 수 있는 바이오마커가 부족하기 때문에 일반적으로 후기 전이성 단계에서 진단되는 PDAC 환자에게 특히 중요합니다. 그러나 PDAC를 포함한 암 세포주를 다능성으로 재프로그래밍하는 것은 여전히 어렵고 노동 집약적이며 서로 다른 세포 주 간에 매우 가변적입니다. 여기서는 bicistronic 렌티바이러스 벡터를 사용하여 다양한 인간 PDAC 세포주에서 iPSC를 생성하기 위한 보다 일관된 프로토콜에 대해 설명합니다. 그 결과 iPSC 라인은 안정적이며, 재프로그래밍 인자 또는 유도성 약물의 외인성 발현에 의존하지 않습니다. 전반적으로, 이 프로토콜은 광범위한 PDAC 유래 iPSC의 생성을 용이하게 하며, 이는 PDAC 사례를 보다 구체적이고 대표하는 초기 바이오마커를 발견하는 데 필수적입니다.

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most fatal malignancies, and early diagnosis remains challenging due to the asymptomatic nature of the disease. The majority of PDAC patients are diagnosed at the advanced metastatic stage when very limited treatment options are available1,2. This is mainly due to the lack of reliable biomarkers for the earlier stages, such as those that could be conveniently detected as proteins released into the bloodstream.
PDAC can disseminate very early during its progression, and a better prognosis has been linked to early cancer detection when PDAC is localized in the pancreas3. However, less than a tenth of PDAC patients are diagnosed with a favorable prognosis, allowing for surgical resection. Nonetheless, those few with resectable tumors are also prone to tumor recurrence within 12 months4.
In the past five decades, remarkable improvements have been made in surgical techniques, patient care, and treatment modalities5,6. However, the 5-year survival rate in surgically resected PDAC patients has barely risen to 17%. Nonetheless, this is still better than that in non-resected patients, which has remained almost unchanged (0.9%)4,7. Chemotherapy is the only other alternative PDAC treatment. Yet, this option is very limited as the great majority of PDAC patients exhibit strong resistance to chemotherapy medications such as Gemcitabine7,8. Other drugs, such as Erlotinib, are only available to a small group of PDAC patients with specific mutations, most of whom show Erlotinib resistance9. The adverse side effects associated with chemotherapy in most PDAC patients are yet another disadvantage of this treatment10. Recently, promising strategies have shown that immune checkpoint inhibitors (ICIs) and small molecule kinase inhibitors (SMKIs) can be effective in treating PDAC, but durable responses to these targeted therapies remain limited to a minority of patients11,12. Overall, the discovery of PDAC-specific early biomarkers can pave new avenues for early diagnosis and treatment.
PDAC develops from pancreatic intraepithelial neoplasms (PanIN) precursor lesions that result from non-invasive pancreatic duct epithelial proliferations13,14. While the formation of PanIN is initiated by oncogene mutations such as KRAS, additional genetic and epigenetic alterations are required for the progression to PDAC. It has been projected that the progression of PanIN through the different stages into invasive PDAC takes about 10 years13,15,16,17. This timeframe provides a great opportunity to benefit from early PDAC diagnosis. Therefore, extensive research has been carried out to establish tumor xenograft animal models and organoid cultures to study PDAC progression18,19,20,21. These models have been very useful for studying the invasive stages of PDAC, although not the transition from the early PanIN phases. It is, therefore, important to develop experimental models that can recapitulate the early progression of PanIN stages to enable the discovery of early detection biomarkers.
Reprogramming somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs) using the four transcription factors OCT4, SOX2, KLF4, and c-MYC (OSKM) has illustrated the extent of cellular plasticity22. Cancer cell plasticity has been well-documented, and reprogramming human cancer cells into iPSCs has been successfully used to reset cells to their original cellular state, removing many of the epigenetic insults that have accumulated during cancer progression23,24,25,26,27,28,29. The possibility of using this reprogramming strategy to manipulate cancer cell identity has, therefore, presented great promise in treating cancer30,31. Indeed, we have previously shown that the differentiation of iPSCs derived from PDACs can recapitulate PDAC progression through the early PanIN stages32. By identifying genes and pathways specific to the early-to-intermediate stages of PDAC, candidate biomarkers were identified that can be clinically used for early PDAC diagnosis32,33. However, the biomarkers discovered using a single iPSC line showed limited coverage in the majority of PDAC patients32. The challenges of generating iPSC lines from other PDAC patients have halted the ability to discover more reliable biomarkers. This is due to many technical factors, including the heterogeneity of OSKM delivery, as only a small portion of human primary PDAC cells contained all four factors and responded successfully to reprogramming. Here, a detailed protocol is presented for reprogramming primary PDAC cells using a more efficient and consistent dual lentiviral delivery of OSKM.

저자 스포트라이트: 질병 진행 및 치료 표적을 연구하기 위해 암세포를 iPSC로 재프로그래밍

췌관 선암을 다능성으로 재프로그래밍

1 One of the most challenging aspects of studying PDAC<v>2 or pancreatic cancer is the availability 3 of an experimental model 4 that can recapitulate the progression 5 of PDAC from the early proline stages 6 to the aggressive state. 7 The other challenge is to experimentally capture 8 the plasticity and heterogeneity of PDAC. 9 So using PDAC IPS cells will help us tackle 10 some of these challenges 11 and expand our experimental tools to study this disease.12 We have established a robust protocol 13 to reprogram PDACs to iPS cells. 14 By generating more iPS lines from many more PDAC patients, 15 we can study the transition of pancreatic cancer 16 from early to advanced stages and see the commonalities 17 and differences between these lines. 18 This will help us discover early diagnostic markers 19 that cover more patients, 20 and generate drugs that target 21 the different states of the disease.22 The interesting question that came out of reprogramming 23 PDAC to iPS cells is what makes this cancer 24 so resistant to sulfate conversion compared to normal cells? 25 Is this due to specific genes or genetic mutations 26 that tell us something about cancer cell identity?

PDAC, BXPc3, H6C7 및 hFib 세포에서 유래한 iPSC 콜로니의 형태를 보여주는 대표적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다. PDAC-iPSC 콜로니는 재프로그래밍의 25일째에 형성되기 시작했다. 보다 확립된 ESC 유사 형태를 가진 견고한 iPSC 콜로니는 재프로그래밍 40일째에 확인되었습니다(그림 1). 마찬가지로, BxPc3-iPSC의 형성은 23일째에 시작되...

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본 프로토콜은 췌관 선암종(PDAC)과 정상 췌관 상피세포를 유도만능줄기세포(iPSC)로 재프로그래밍하는 방법을 설명합니다. 당사는 렌티바이러스 준비부터 안정적인 iPSC 라인 구축에 이르기까지 최적화되고 상세한 단계별 절차를 제공합니다.

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has ...

reprogramming-pancreatic-ductal-adenocarcinoma-to-pluripotency

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Reprogramming Pancreatic Ductal Adenocarcinoma to Pluripotency

513 조회수.  The University of Edinburgh. 1 PDAC2 또는 췌장암을 연구하는 데 있어 가장 어려운 측면 중 하나는PDAC의 초기 프롤린 병기6에서 공격적인 상태까지의 PDAC5의 진행을 요약할 수 있는 실험 모델4의 가용성이다. 7 또 다른 과제는 PDAC의 가소성과 이질성을 실험적으로 포착하는 것이다. 9 따라서 PDAC IPS 셀을 사용하면 이러한 문제 중 10을 해결하고 11을 확장하는 데 도움이 됩니다. 이 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 질병 진행 및 치료 표적을 연구하기 위해 암세포를 iPSC로 재프로그래밍

The generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) using transcription factors has been achieved from almost any differentiated cell type and has proved highly valuable for research and clinical applications. Interestingly, iPSC reprogramming of cancer cells, such as pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC), has been shown to revert the invasive PDAC phenotype and override the cancer epigenome. The differentiation of PDAC-derived iPSCs can recapitulate PDAC progression from its early pancreatic intraepithelial neoplasia (PanIN) precursor, revealing the molecular and cellular changes that occur early during PDAC progression. Therefore, PDAC-derived iPSCs can be used to model the earliest stages of PDAC for the discovery of early-detection diagnostic markers. This is particularly important for PDAC patients, who are typically diagnosed at the late metastatic stages due to a lack of reliable biomarkers for the earlier PanIN stages. However, reprogramming cancer cell lines, including PDAC, into pluripotency remains challenging, labor-intensive, and highly variable between different lines. Here, we describe a more consistent protocol for generating iPSCs from various human PDAC cell lines using bicistronic lentiviral vectors. The resulting iPSC lines are stable, showing no dependence on the exogenous expression of reprogramming factors or inducible drugs. Overall, this protocol facilitates the generation of a wide range of PDAC-derived iPSCs, which is essential for discovering early biomarkers that are more specific and representative of PDAC cases.

The present protocol describes the reprogramming of Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC) and normal pancreatic ductal epithelial cells into induced pluripotent stem cells (iPSCs). We provide an optimized and detailed, step-by-step procedure, from preparing lentivirus to establishing stable iPSC lines.

연구

암 연구학

Lentivirus Preparation and Reprogramming Transduction for Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Cells

1 2 To begin, see the HEK 293T cells<v>3 24 hours before transfection 4 in a 15 centimeter dish containing GMEN. 5 Incubate the cells at 37 degrees Celsius 6 and 5%carbon dioxide 7 until they reach 40 to 50%confluency. 8 Label three 15 milliliter plastic tubes 9 with the appropriate lentivirus name.10 Add 1.710 milliliters of reduced serum medium 11 and 90 microliters of transfection reagent to each tube. 12 Mix the contents by vortexing 13 before incubating the tubes at room temperature. 14 After five minutes, add the packaging vector mixture 15 to the transfection medium and vortex.16 Then add 7.5 micrograms of reprogramming vector 17 and the pWPT-GFP control 18 to the respective transfection mixture. 19 Vortex the tubes for two seconds 20 before incubating for 15 minutes at room temperature. 21 To transfect the 293T cells with each lentivirus, 22 dropwise, add a transfection DNA mixture into the dish.23 Incubate the transfected cells at 37 degrees Celsius 24 and 5%carbon dioxide. 25 After 14 to 16 hours, 26 replace the medium with 30 milliliters 27 of fresh 293T medium 28 and continue incubation for 60 to 72 hours. 29 Observe the cells daily 30 and check transfection efficiency.31 Next, transfer the virus transfection culture 32 into 15 milliliter tubes 33 and spin down at 1, 932 G for 10 minutes 34 at four degrees Celsius. 35 Filter the lentiviral supernatant 36 using a 0.45 micron syringe filter 37 into a new 50 milliliter tube. 38 One day before lentivirus transduction, 39 prepare two wells of a 6-well plate 40 containing 100, 000 PDAC cells per well.41 Prepare two 15 milliliter tubes 42 with two milliliters of pre-warmed PDAC medium. 43 In the first tube, 44 add 12 milliliters of reprogramming lentivirus. 45 Then add 12 microliters of polybrene 46 and mix by pipetting.47 To the second tube, 48 add two microliters of polybrene. 49 Now carefully remove the medium from each well 50 of a 6-well plate 51 and wash once with PBS at room temperature. 52 Add the reprogramming infection medium 53 from tube one to the first well.54 Add the mixture from tube two to the second well. 55 Incubate the cells overnight at 37 degrees Celsius 56 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen. 57 The next day, replace the medium 58 from both wells with fresh PDAC medium 59 and continue incubation 60 for up to 48 hours as demonstrated.

췌관 선암종 세포를 위한 렌티바이러스 준비 및 재프로그래밍 형질도입

Preparation of iMEF Feeder Cells and Reprogramming Transduction for Induced Pluripotent Stem Cells

1 To begin, coat the 6-well plate<v>2 with two milliliters of 0.2%gelatin solution per well. 3 Incubate the plate at 37 degrees Celsius 4 and 5%carbon dioxide for 30 minutes. 5 Next, drop-wise add iMEFs into a 15 milliliter tube 6 containing 10 milliliters 7 of pre-warmed human fibroblast medium, 8 and mix by gently inverting the tube.9 Centrifuge the cell suspension at 309 G for three minutes. 10 And remove the supernatant before re-suspending the pellet 11 in 12 milliliters of human fibroblast medium. 12 Place two milliliters of the cell suspension 13 into each well of the gelatin-coated six well plate.14 And incubate overnight at 37 degrees Celsius 15 and 5%carbon dioxide. 16 Discard the medium from the lentivirus-infected 17 and non-infected PDAC, and wash the cells twice with PBS. 18 Then add 500 microliters of trypsin to dissociate the cells.19 And incubate at 37 degrees Celsius 20 with 5%carbon dioxide and 5%oxygen 21 for 15 minutes. 22 Centrifuge the cell suspension at 300 G for five minutes. 23 And re-suspend the pellet in one milliliter of PDAC medium.24 Wash the iMEF plate with PDAC medium. 25 Then add 50, 000 lentivirus-infected PDAC cells 26 per well in five wells of iMEF plate, and incubate overnight 27 as demonstrated previously. 28 After preparing the reprogramming medium, 29 add 100 microliters of basic fibroblasts growth factor 30 to 100 milliliters of reprogramming medium.31 The next day, wash the cells growing on iMEF feeders twice 32 with pre-warmed reprogramming media. 33 Then add two milliliters of media to each well, 34 and incubate overnight at 37 degrees Celsius 35 with 5%carbon dioxide and 3%oxygen. 36 After passing the IPSC pool five times, 37 observe the robust colonies 38 maintaining ESC-like morphology.39 The PDAC, BxPc3, 40 H6c7, and human fibroblast 41 showed different days of reprogramming 42 to form a mature ESC-like morphology. 43 Clonal IPSC lines were established 44 from each reprogramming of PDAC, 45 BxPc3, H6c7, 46 and human fibroblast cells. 47 All established IPSC lines stained positive 48 for TRA-160, confirming their reprogramming to pluripotency.