TC는 National Institute of General Medical Sciences 분자 생물 물리학 교육 보조금 GM-08295 및 보조금 번호 DGE 2146752에 따라 National Science Foundation 대학원 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. R.G.와 B.H.는 R.G.와 B.H.에게 수여된 미국 국립보건원(National Institute of Health)의 보조금 R21-GM135666의 지원을 받았습니다. 이 연구는 E.N.에게 수여된 R35-GM127018 보조금 R35-를 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

Cryo-EM 구조 연구를 위한 Streptavidin 친화성 그리드 제작

<ol>
	<li>Glaeser, R. M., Nogales, E., Chiu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Single-particle Cryo-EM of Biological Macromolecules. IOP Publishing. , (2021).</li><li>Carragher, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+outcomes+when+optimizing+'standard'+sample+preparation+for+single-particle+cryo-EM.">Current outcomes when optimizing 'standard' sample preparation for single-particle cryo-EM.</a> Journal of Microscopy. 276 (1), 39-45 (2019).</li><li>Drulyte, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+altering+particle+distributions+in+cryo-electron+microscopy+sample+preparation.">Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation.</a> Acta Crystallographica Section D-Structural Biology. 74, 560-571 (2018).</li><li>Noble, A. 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A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structures+of+a+phycobilisome+in+light-harvesting+and+photoprotected+states.">Structures of a phycobilisome in light-harvesting and photoprotected states.</a> Nature. 609 (7928), 835-845 (2022).</li><li>Kasinath, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=JARID2+and+AEBP2+regulate+PRC2+in+the+presence+of+H2AK119ub1+and+other+histone+modifications.">JARID2 and AEBP2 regulate PRC2 in the presence of H2AK119ub1 and other histone modifications.</a> Science. 371 (6527), eabc3393 (2021).</li><li>Lahiri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3.1+structure+of+yeast+RNA+polymerase+II+elongation+complex+stalled+at+a+cyclobutane+pyrimidine+dimer+lesion+solved+using+streptavidin+affinity+grids.">3.1 structure of yeast RNA polymerase II elongation complex stalled at a cyclobutane pyrimidine dimer lesion solved using streptavidin affinity grids.</a> Journal of Structural Biology. 207 (3), 270-278 (2019).</li><li>Marr, C. R., Benlekbir, S., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+of+carbon+films+with+~+500nm+holes+for+cryo-EM+with+a+direct+detector+device.">Fabrication of carbon films with ~ 500nm holes for cryo-EM with a direct detector device.</a> Journal of Structural Biology. 185 (1), 42-47 (2014).</li><li>Levine, M. J., Schwarz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+guidelines+for+producing+molecular+assemblies+by+Langmuir-Blodgett+techniques.">Experimental guidelines for producing molecular assemblies by Langmuir-Blodgett techniques.</a> Journal of Chemical Education. 65 (7), 638 (1988).</li><li>Zheng, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MotionCor2:+anisotropic+correction+of+beam-induced+motion+for+improved+cryo-electron+microscopy.">MotionCor2: anisotropic correction of beam-induced motion for improved cryo-electron microscopy.</a> Nature Methods. 14 (4), 331-332 (2017).</li></ol>

당사의 프로토콜은 스트렙타비딘 친화성 그리드를 만들고 사용하는 방법과 스트렙타비딘 회절 신호가 포함된 데이터를 처리하는 방법을 설명합니다. 프로토콜에는 특별한 주의가 필요한 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
실패한 그리드 배치는 몇 가지 일반적인 오류로 거슬러 올라갈 수 있습니다. 오류의 가장 흔한 원인은 오래되거나 품질이 좋지 않은 시약을 사용하는 것입니다. 프로토콜에 설명된 대로 정확하게 비오틴화 지질 용액을 준비하는 것이 특히 중요합니다. 또한, 실험기구의 세제 잔류물 또는 피부에 자연적으로 존재하는 오일과 같은 불순물은 스트렙타비딘 결정의 품질에 영향을 미칠 수 있으며, 따라서 결과 이미지의 품질에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 그리드 제조업체에서 계면활성제 오염 가능성을 제거하기 위해 첫 번째 탄소 증발 전에 그리드에 대해 세 번의 세척 주기를 수행하는 것이 좋습니다(2.1단계). 게다가, 피마자유의 오염 또는 불순은 격자에 결정 대형을 방해하기 위하여 관찰되었습니다.
지질 단층을 만들고 집는 것은 작은 지질 부피에 대한 느낌을 얻기 위해 몇 번 연습해야 하는 작업입니다. 이 단계가 적절한 지질 단층을 생성하기 전에 처음 두세 번 실패하는 것은 드문 일이 아니며, 이는 궁극적으로 음성으로 염색된 그리드에서 볼 수 있는 스트렙타비딘 결정의 품질에 반영됩니다(그림 4C).
그리드 제조 공정(3.12-3.20단계) 동안 그리드의 뒷면(금색 면, 지질 면)이 젖지 않도록 하는 것이 중요합니다. 뒷면이 젖었을 경우 그리드를 버리는 것이 좋습니다. 이로 인해 이미지 품질을 방해하는 큰 지질 소포가 나타날 수 있습니다(그림 5D)(행 3, 표 1). 지질 단층이 적용된 후 불충분한 세척으로 인해 지질 소포가 관찰될 수도 있습니다(단계 3.13). 스트렙타비딘을 첨가하기 전에 지질 단층을 만진 후 결정화 완충액을 사용하여 3회 세척하는 것이 좋습니다.
트레할로스가 내장된 그리드에 얇은 탄소 층이 증발한 후 그리드 뒷면은 격자 품질을 손상시키지 않고 젖을 수 있습니다. 예를 들어, 샘플 버퍼에 최소한의 세제가 포함되어 있을 때 뒷면의 습윤이 자주 관찰됩니다. 시료에 의한 후면의 습윤은 시료가 후면의 얇은 탄소 필름에 비특이적으로 결합하는 결과를 초래할 수 있으며, 이는 입자가 공기-물 계면으로 확산되는 것을 방지하거나 그리드 정제 전략에 친화성 결합을 사용하는 효과를 감소시킵니다. 가능하면 세제가 없는 상태에서 샘플을 그리드에 추가합니다. 세제 및 기타 첨가제는 그리드 세척 단계에서 추가되거나 유리화 전 마지막 단계에서 추가될 수 있습니다. 이것은 streptavidin 친화성 그리드 사용에 대한 한 가지 제한 사항입니다. 그러나, 목표가 우선 배향을 개선하는 것이라면, 세제를 포함한 완충액을 사용한 시료 전처리가 성공적으로 수행된 것이다11.
일반적인 오류의 원인은 두 탄소 증발 단계(2.3단계 및 3.21단계)와 관련된 그리드의 수명에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 권장되는 대기 기간은 Cryo-EM에 streptavidin 그리드를 사용하기 전에 뒷면 탄소 증발 후 5-7일입니다. 제작 후 그리드가 너무 빨리 사용되면 격자와 지질 단층이 그리드 구멍에서 동원되는 것이 관찰되었습니다. 그리드가 너무 오래되어 6개월 후에 사용된 경우에도 유사한 관찰을 할 수 있습니다(그림 5A)(행 1, 표 1). 우리는 이 관찰이 지질 단층과 스트렙타비딘 결정을 안정화하기 위해 적용되는 탄소 백킹의 소수성 변화에 의해 설명된다는 가설을 세웠습니다. 또한 streptavidin 격자는 모자이크(그림 5B)(행 3, 표 1)로 나타날 수 있으며, 첫 번째 탄소 증발층(단계 2.3)이 충분히 노화되지 않은 그리드에 단층을 적용하는 경우 음성 염색 및 Cryo-EM 모두에서 파손될 수 있습니다.
오류의 또 다른 일반적인 원인은 스트렙타비딘 결정질 단층(지질 단층은 그 자체가 유동이며 가역적으로 팽창하거나 압축될 수 있음)의 취약성으로 추적할 수 있습니다. 뒷면 탄소 증착(단계 3.21)은 시료 흡착, 세척 및 Cryo-EM 블로팅 공정 중에 단층 및 스트렙타비딘 격자 모두에 중요한 안정성을 제공합니다. 그리드 뒷면에 충분한 탄소 증발이 없는 경우 스트렙타비딘 격자는 블로팅/동결 후 조각난 것처럼 보이는 경우가 많습니다(그림 5C)(행 2, 표 1). 이 프로토콜에서는 단면 블로팅을 위해 단면 자동 플런지 냉동고를 사용하는 것이 좋습니다. 이 방법은 동결 공정 중에 streptavidin 격자를 보존하고 샘플 응용 프로그램 및 블로팅 파라미터의 간소화된 최적화를 가능하게 하는 재현성이 높은 블로팅 조건을 제공합니다. 대안적으로, 다른 자동 플런지-동결 장치들이 수동 블로팅과 함께 사용되어 왔다. 이를 위해 장치 설정에서 실제 압지 기능이 비활성화되고 대신 측면 입구를 통해 압지를 들고 있는 핀셋으로 손을 뻗어 그리드를 지웁니다. 이 방법은 단면 블로팅 및 플런지 동결 장치 없이 실험실에서 고품질 결과를 얻을 수 있습니다. 그러나 그리드 간 재현성은 어렵습니다.
streptavidin 친화도 그리드를 사용하면 많은 장점이 있지만 이 방법의 몇 가지 제한 사항을 고려해야 합니다. 절차의 특성으로 인해 일반적으로 전체 프로세스가 완료될 때까지 스트렙타비딘 격자의 품질을 평가할 수 없습니다. 샘플을 동결하기 전에 음성 염색으로 각 배치의 품질을 신속하게 스크리닝하는 것이 좋습니다. streptavidin 격자가 원시 이미지에 기여하는 신호로 인해 경우에 따라 이미지만으로는 온전하고 분산된 입자의 수가 충분한지 여부를 평가하기 어려울 수 있습니다. 같은 이유로, streptavidin 신호 빼기 절차가 데이터 전처리 파이프라인에 포함되지 않는 한 데이터 수집 중 Cryo-EM 데이터의 즉석 처리는 불가능합니다. streptavidin 신호는 일반적으로 프레임 자체가 아니라 모션 보정된 영상에서 차감되기 때문에, 널리 사용되는 소프트웨어 제품군에서 구현된 베이지안 마무리는 설명된 대로 뺄셈 절차를 사용할 때 실패할 수 있습니다. 따라서 데이터 처리의 시작부터 입자 이동을 최소화하기 위해 여러 패치에서 모션 보정을 수행하는 것이 권장된다16.
이러한 한계에도 불구하고 streptavidin 친화도 그리드는 많은 이점을 제공합니다. streptavidin 친화성 그리드가 표준 개방형 Cryo-EM 그리드에 비해 제공하는 두 가지 주요 이점은 공기-물 계면에서 시료를 보호하고 그리드에 저농도(10-100nM)의 시료를 농축하는 수단입니다. 탄소 및 산화 그래핀과 같은 다른 지지층도 이러한 시료 전처리 병목 현상을 극복하기 위한 전략으로 사용할 수 있습니다. 한 예로, 스트렙타비딘 친화도 그리드는 가교 접근법과 양립할 수 없는 단백질-핵산 상호작용의 온전한 재구성을 얻기 위한 유일한 솔루션이었습니다. 12의
스트렙타비딘 친화성 그리드가 제공하는 또 다른 주요 이점은 탄소 또는 산화그래핀과 같은 다른 지지층에 흡착되는 시료에 대한 솔루션으로, 관심 시료의 3D 재구성을 얻는 능력을 방해하는 선호 방향입니다. 시중에서 판매되는 키트를 사용하여 시료의 무작위 비오틴화를 통해 관심 시료를 스트렙타비딘 단층에 무작위로 부착하여 이 문제를 극복할 수 있는 더 많은 잠재적 관점을 얻을 수 있습니다.
또한 streptavidin 친화도 그리드는 친화도 기반 그리드에 고유한 이점을 제공합니다. 스트렙타비딘-비오틴 상호작용의 높은 친화력과 특이성은 스트렙타비딘 친화성 그리드를 비오틴과 관련된 다른 워크플로우와 결합하여 관심 복합체를 정제할 수 있도록 합니다. 발표된 한 예에서 저자는 스트렙타비딘 친화성 그리드에 복합체를 고정하고 알려지지 않은 화학량론의 결합 파트너를 과도하게 배양했습니다. 결합되지 않은 단백질을 씻어낸 후 올바르게 조립된 슈퍼 복합체를 얻었고 Cryo-EM11로 즉시 분석할 수 있었습니다. 한 가지 가능한 미래 응용 분야는 스트렙타비딘 결합 단백질 태그, Avi 태그 시스템 또는 근접 라벨링 접근법을 스트렙타비딘 친화성 그리드와 결합하여 표준 정교한 정제 계획 없이 재조합 또는 내인성 소스에서 직접 단일 단백질 및/또는 단백질 복합체를 추출하는 것입니다.
이 프로토콜을 제공함으로써 실험실은 스트렙타비딘 친화성 그리드의 제조를 쉽게 재현할 수 있어야 하며, Cryo-EM에 의한 단백질 복합체의 구조 분석에 더 일반적으로 사용되는 도구로 확립할 수 있어야 합니다.

전자 초저온 현미경(Cryo-EM)은 이전에는 X선 결정학 또는 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance)으로 접근할 수 없었던 크고 유연한 이종 시료의 고분자 구조 측정을 가능하게 함으로써 구조 생물학 분야에 혁명을 일으켰습니다1. 이 방법은 용액에서 거대분자를 급속 동결하여 전자 현미경을 사용하여 나중에 이미지화할 수 있는 유리질 얼음의 얇은 층을 만드는 방식으로 작동합니다. 최근 몇 년 동안 현미경 하드웨어와 이미지 처리 소프트웨어가 크게 발전하면서 Cryo-EM에 의한 고분해능 구조 측정에 적합한 시료 유형이 더욱 확장되었습니다.
그럼에도 불구하고 얇은 유리화 시료의 준비는 Cryo-EM에 의한 고분자 구조 측정에서 가장 중요한 단계 중 하나입니다. 생물학적 시료는 종종 동적이고, 깨지기 쉬우며, 변성되기 쉬우며, 때로는 Cryo-EM 연구에 소량만 사용할 수 있습니다. 블로팅 공정 중에 이러한 입자는 소수성 공기-물 계면과 상호 작용하여 입자 선호 방향, 깨지기 쉬운 복합체의 분해, 부분 또는 전체 시료 변성 및 응집 2,3,4를 초래할 수 있습니다. 세제 또는 기타 계면활성제의 사용, 화학적 가교 및 지지층을 위한 시료 흡착은 동결 공정 중에 생물학적 시료를 보존하기 위한 일반적인 전략입니다. 그래핀 산화물 5,6,7 또는 비정질 탄소8과 같은 지지층은 샘플이 제한된 양으로 제공될 때 흡착을 통해 그리드에 입자를 농축하는 기능도 합니다. 그러나 이러한 방법은 일반적이거나 신뢰할 수 없으며 그리드 준비 최적화는 시간이 많이 걸리거나 완전히 실패할 수 있습니다.
스트렙타비딘 친화성 그리드(9,10)는 이러한 단점을 극복하고 관심 복합체를 격리하고 공기-물 계면으로부터 보호하기 위한 온화하고 일반적으로 적용 가능한 방법을 제공하기 위해 개발되었다. 이 그리드는 그리드의 비오틴화된 지질 단층에서 성장한 2차원(2D) 스트렙타비딘 결정 격자를 사용합니다. 샘플 자체가 비오틴화된 후(종종 드물게 무작위로, 복합체당 평균 하나의 비오틴을 의미함) 스트렙타비딘 코팅 그리드에 적용할 수 있습니다. 시료 흡착은 스트렙타비딘과 비오틴 사이의 매우 높은 친화력에 의존하기 때문에 이러한 그리드에는 10nM의 낮은 시료 농도를 사용할 수 있습니다. 단백질용 비오틴화 키트와 DNA 함유 복합체용 비오틴화 프라이머를 시판하면 대부분의 관심 샘플에 필요한 비오틴 부분을 비교적 쉽게 부착할 수 있습니다. 시료를 농축하고 블로팅 중 유해한 공기-물 계면으로부터 멀리 유지하는 것 외에도, 하나 또는 몇 개의 라이신 잔기의 무작위 비오틴화는 Cryo-EM 그리드에서 관심 분자의 배향 범위를 크게 개선할 수 있습니다11. 기본 스트렙타비딘 결정의 신호가 원시 이미지에 존재하지만, 결정의 날카로운 브래그 반사에 대한 푸리에 여과와 관련된 데이터 처리 체계는 초기 데이터 처리 중에 쉽게 제거될 수 있으며, 궁극적으로 관심 샘플의 고해상도 재구성을 가능하게 합니다 11,12,13. 여기에서 streptavidin 친화성 그리드의 강력한 생산과 Cryo-EM 실험에서의 후속 사용을 위해 최적화된 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 제공된 프로토콜은 2주에 걸쳐 완료될 것으로 예상됩니다(그림 1A). 프로토콜의 첫 번째 부분에서는 시약 준비, 그리드 전처리 및 첫 번째 탄소 증발 단계를 설명합니다. 다음으로, 지질 단층의 제조 및 EM 그리드에서 스트렙타비딘 결정의 성장에 대한 지침이 설명됩니다. 또한 음성 염색 EM 및 Cryo-EM 실험에서 streptavidin 친화성 그리드를 사용하기 위한 지침이 제공됩니다. 마지막으로, Cryo-EM 데이터를 획득한 후 현미경 사진에서 스트렙타비딘 신호를 제거하기 위한 절차가 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N-(biotinyl) sodium salt&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>870285P</td>
			<td>Comes as a powder. Dissolve at concentration of 1&#8211;10 mg/mL&#160; in chloroform/methanol/water solvent, 65:35:8 v/v and store in single use aliquots at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 proof pure ethanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-678-005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 &#956;L Hamilton Syringe&#160;</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>87930</td>
			<td>5 &#181;L Microliter Syringe Model 75 RN, Small Removable Needle, 26 G, 2 in, point style 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Castor Oil</td>
			<td>Sigma Adrich</td>
			<td>259853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes untreated (35 mm)</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>SP22146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform&#160;</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Trehalose dihydrate,from starch, &#8805;99%</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T9449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DUMONT Anti-Capillary Reverse (self-closing) Tweezers Biology Grade</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>510-5NM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC Grade Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A452-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM ACE600 High Vacuum Sputter Coater</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica EM GP2 Automatic Plunge Freezer</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quantifoil R 2/1 Au300&#160;</td>
			<td>Quantifoil</td>
			<td>Q84994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Steptavidin</td>
			<td>New England Bioscience</td>
			<td>N7021S</td>
			<td>Comes as 1 mg/mL solution. Dilute to final concentration of 0.5 mg /mL in crystallization bufferwith a final trehalose concentration of 10%. Can be flash frozen in 25&#8211;50 &#956;L aliquots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Talcum powder&#160;</td>
			<td>Carolina</td>
			<td>896060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Whatman Grade 1 filter paper</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>1001-085</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

streptavidin-affinity grid fabrication for cryo-electron microscopy sample preparation

Streptavidin 친화성 그리드는 공기-물 계면으로 인해 발생할 수 있는 시료 변성 및 우선 배향을 포함하여 일반적으로 발생하는 많은 초저온 전자 현미경(Cryo-EM) 시료 전처리 문제를 극복하기 위한 전략을 제공합니다. 그러나 Streptavidin 친화성 그리드는 상업적으로 이용 가능하지 않고 신중한 제조 공정이 필요하기 때문에 현재 소수의 Cryo-EM 실험실에서 활용되고 있습니다. 2차원 스트렙타비딘 결정은 표준 holey-carbon Cryo-EM 그리드에 직접 적용되는 비오틴화된 지질 단층에서 성장합니다. 스트렙타비딘과 비오틴 사이의 높은 친화성 상호 작용은 Cryo-EM 시료 전처리 중 공기-물 계면으로부터 보호되는 비오틴화된 시료의 후속 결합을 가능하게 합니다. 또한 이러한 그리드는 제한된 수량으로 사용 가능한 샘플을 농축하고 그리드에서 직접 관심 단백질 복합체를 정제하기 위한 전략을 제공합니다. 여기에서는 Cryo-EM 및 음성 염색 실험에 사용하기 위한 스트렙타비딘 친화성 그리드의 견고한 제조를 위해 단계별로 최적화된 프로토콜이 제공됩니다. 또한 일반적으로 경험하는 문제에 대한 문제 해결 가이드가 포함되어 있어 더 큰 Cryo-EM 커뮤니티에서 streptavidin 친화성 그리드를 더 쉽게 사용할 수 있습니다.

Electron cryo-microscopy (cryo-EM) has revolutionized the field of structural biology by enabling macromolecular structure determination of large, flexible, and heterogeneous samples that were previously inaccessible by X-ray crystallography or nuclear magnetic resonance1. This method works by flash-freezing macromolecules in solution to create a thin layer of vitreous ice that can be subsequently imaged using an electron microscope. In recent years, significant advances in both microscope hardware and image processing software have further expanded the types of samples suitable for high-resolution structure determination by cryo-EM.
Nevertheless, the preparation of thin, vitrified samples remains one of the most critical steps in macromolecular structure determination by cryo-EM. Biological samples are often dynamic, fragile, prone to denaturation, and sometimes are only available in small quantities for cryo-EM studies. During the blotting process, these particles interact with the hydrophobic air-water interface, which can result in particle-preferred orientations, disassembly of fragile complexes, partial or complete sample denaturation, and aggregation2,3,4. The use of detergents or other surfactants, chemical cross-linking, and adsorption of samples to support layers are common strategies to preserve biological samples during the freezing process. Support layers such as graphene oxide5,6,7 or amorphous carbon8 also function to concentrate particles on the grid by adsorption when the sample is available in limited quantities. However, these methods are not general or reliable, and optimization of grid preparation can be extremely time-consuming or fail altogether.
Streptavidin affinity grids9,10 were developed to overcome these shortcomings and to provide a mild and generally applicable method to sequester the complex of interest and protect it from the air-water interface. These grids utilize a two-dimensional (2D) streptavidin crystal lattice grown on a monolayer of biotinylated lipids on the grid. After samples are themselves biotinylated (often sparsely and randomly, meaning one biotin per complex on average), they can be applied to the streptavidin-coated grid. Because sample adsorption relies on the extremely high affinity between streptavidin and biotin, sample concentrations as low as 10 nM can be used with these grids. Commercially available biotinylation kits for proteins and biotinylated primers for DNA-containing complexes make it relatively easy to attach the necessary biotin moieties to most samples of interest. In addition to concentrating the sample and keeping it away from the damaging air-water interface during blotting, the random biotinylation of one or just a few lysine residues can significantly improve the range of orientations of the molecule of interest on the cryo-EM grid, as demonstrated in a number of studies11. While the signal from the underlying streptavidin crystal is present in the raw images, data processing schemes involving Fourier filtration of the sharp Bragg reflections from the crystal can be easily removed during early data processing, ultimately enabling high-resolution reconstructions of the sample of interest11,12,13. Here, an optimized, step-by-step protocol is provided for robust production of streptavidin affinity grids and subsequent use in cryo-EM experiments. The protocol provided is expected to be completed over a 2-week period (Figure 1A). The first parts of the protocol describe the preparation of reagents, the pretreatment of grids, and the first carbon evaporation steps. Next, instructions are described for the preparation of the lipid monolayer and the growth of streptavidin crystals on EM grids. Additionally, instructions are provided for the use of streptavidin affinity grids in negative stain EM and cryo-EM experiments. Finally, procedures are provided for removing streptavidin-signal from micrographs once cryo-EM data has been acquired.

저자 스포트라이트: Streptavidin-Biotin 접근법을 통한 Cryo-EM 시료 전처리 향상

극저온 전자 현미경 시료 전처리를 위한 Streptavidin-Affinity Grid 제작

3.21 단계에서 탄소 증발 후(보통 1주일 후) 4단계 및 5단계에 설명된 절차에 따라 streptavidin 친화성 그리드를 Cryo-EM 또는 음성 염색 시료 준비에 사용할 수 있습니다. streptavidin 친화성 그리드로 동결된 비오틴화된 샘플의 픽셀 크기 1.05Å로 81,000X 배율로 titan Krios에서 K3 검출기를 사용하여 캡처한 대표적인 현미경 사진이 그림 4A에 나와 있습니다. 성공적인 격자 형성은 이미지 배경에 나타나는 연속 격자 패턴으로 관찰됩니다. 이는 그림 4A (오른쪽)에 표시된 고속 푸리에 변환(FFT)에 나타나는 회절 패턴으로 더 쉽게 관찰할 수 있습니다. 데이터 수집 후, 이 프로토콜의 6단계에 설명된 절차에 따라 스트렙타비딘 격자에 의해 이미지에 기여하는 신호를 계산적으로 마스킹하여 후속 데이터 처리 단계에 사용할 수 있는 빼진 현미경 사진(그림 4B)을 생성할 수 있습니다. 그림 4B (오른쪽)의 FFT는 그림 4A (오른쪽)에서 관찰된 회절 패턴이 원본 이미지에서 성공적으로 제거되었음을 보여줍니다.
그림 4C 는 1.6Å의 픽셀 크기로 49,000x 배율로 Tecnai 12 현미경으로 촬영한 비오틴화된 샘플이 스트렙타비딘 친화성 그리드에 결합되고 우라닐 포름산염을 사용하여 음성으로 염색된 현미경 사진의 예를 보여줍니다. 그리드는 이 프로토콜의 4단계에 설명된 절차에 따라 준비되었으며 더 두꺼운 얼룩 필름을 남겼습니다.
스트렙타비딘 그리드 제작 절차가 성공하지 못한 경우 몇 가지 일반적인 관찰이 있으며, 이는 토론 섹션 및 표 1에 자세히 설명되어 있습니다 . 그림 5 에서는 이러한 관찰의 몇 가지 예를 보여 줍니다. 그림 5A 는 6개월 이상 된 배치에서 사용된 음성으로 염색된 스트렙타비딘 친화성 그리드의 현미경 사진을 보여줍니다. 단층은 quantifoil 그리드의 탄소 호일에 있는 구멍에서 동원되었으며 그리드의 구멍과 유사한 치수로 관찰됩니다. 그림 5B 는 시료 전처리 절차 중에 쉽게 교란되는 높은 모사이시티를 갖는 스트렙타비딘 결정의 예를 보여줍니다. 그림 5C 는 3.21 단계의 탄소 증발이 너무 얇거나 생략된 스트렙타비딘 친화성 그리드의 대표적인 현미경 사진을 보여줍니다. streptavidin 격자는 Cryo-EM 시료 전처리 공정 중에 단편화되었습니다. 그림 5D 는 3.13 단계 동안 불충분한 세척 또는 3.13-3.20 단계 동안 그리드의 금 면이 젖었기 때문에 지질 소포로 인해 오염된 음성으로 염색된 스트렙타비딘 친화성 그리드를 보여줍니다. 이러한 일반적인 문제를 극복하기 위한 전략에 대해서는 토론 섹션과 표 1 을 참조하십시오.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig01.jpg"> 그림 1: streptavidin 친화성 그리드 제작 절차의 개략도. (A) 스트렙타비딘 친화성 그리드 제작 절차의 개요 타임라인. 전체 절차는 2주에 걸쳐 완료할 수 있으며, 탄소가 충분히 숙성될 수 있도록 두 번의 탄소 증발 단계와 각 단계 후 1주일이 필요합니다. (B) 금괴 및 구멍이 뚫린 탄소 필름이 있는 표준 Cryo-EM 그리드, 첫 번째 증발 탄소 층, 지질 단층, 2D-스트렙타비딘 결정 및 후면 증발 탄소 지지층을 포함하여 제조 공정 완료 후 그리드를 구성하는 층을 보여주는 스트렙타비딘 친화성 그리드의 그리드 사각형을 확대한 보기. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig02.jpg"> 그림 2: 지질 단층과 스트렙타비딘 결정화(A) 지질 단층을 형성하는 동안 일정한 표면 압력을 생성하는 피마자유의 경계를 만들기 위해 활석 분말을 사용하여 작은 페트리 접시 내에서 지질 단층을 성공적으로 형성하는 방법을 보여주는 이미지. (B) Cryo-EM 그리드에서 스트렙타비딘 결정을 성장시키는 방법을 보여주는 이미지. 먼저, 그리드의 탄소 쪽을 지질 단층에 접촉시킨 후 결정화 완충액에서 3회 연속 세척합니다. 스트렙타비딘을 첨가하고 그리드를 습도 챔버에서 2시간 동안 배양합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig03.jpg"> 그림 3: 현미경 사진에서 streptavidin 격자 빼기를 수행하기 위한 process_subtraction.cfg 파일의 파라미터 예(6단계). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig04.jpg"> 그림 4: 성공적인 스트렙타비딘 친화성 그리드 제작의 대표적인 결과. (A) 홈메이드 스트렙타비딘 친화성 그리드로 준비한 비오틴화 단백질/뉴클레오솜 복합체의 Cryo-EM 현미경 사진. FFT는 오른쪽에 표시되며 스트렙타비딘 결정 회절 패턴을 보여줍니다. (B) 패널 A와 동일한 현미경 사진은 원본 이미지에서 2D 스트렙타비딘 결정의 신호를 제거하기 위한 격자 빼기 절차에 따라 표시됩니다. (C) 스트렙타비딘 친화성 그리드에 결합된 비오틴화된 샘플의 음성 염색에서 얻은 현미경 사진의 예. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66197/66197fig05.jpg"> 그림 5: 스트렙타비딘 친화성 그리드 제작에 실패한 대표적인 결과. (A) 그리드가 6개월 이상 되었을 때 그리드 구멍에서 스트렙타비딘 단층의 동원을 보여주는 현미경 사진. (B) Cryo-EM 및 음성 염색 시료 전처리 절차 중에 쉽게 손상되는 높은 mosaicity를 가진 streptavidin 격자를 보여주는 현미경 사진. (C) 단계 3.21의 탄소 증발층이 너무 얇거나 생략된 경우 Cryo-EM 시료 준비 중 스트렙타비딘 격자의 단편화를 보여주는 현미경 사진. (D) 3.13 단계 동안 불충분한 세척 또는 3.13-3.20 단계에서 그리드의 금 면이 젖어 지질 소포로 오염된 대표적인 현미경 사진. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/66197fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
표 1: 스트렙타비딘 친화성 그리드 제작에 실패하는 동안 일반적으로 발생하는 문제를 극복하기 위한 문제 해결 가이드. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/Table%201.xlsx" target="_blank">이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 1: lsub.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/lsub.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 2: process_subtration.sh <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 3: process_subtraction.cfg <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/process_subtraction3.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 4: bg_drill_hole.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_drill_hole.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 5: bg_FastSubtract_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_FastSubtract_standard.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 6: bg_Pick_Amp_masked_standard.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_Pick_Amp_masked_standard.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 7: bg_push_by_rot.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/bg_push_by_rot.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 8: ReadMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/ReadMRC.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 파일 9: WriteMRC.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRC.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 코딩 File 10: WriteMRCHeader.m <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66197/WriteMRCHeader.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation at JoVE.com

streptavidin 친화성 그리드를 제작하기 위한 단계별 프로토콜은 초저온 전자 현미경에 의한 까다로운 고분자 샘플의 구조 연구에 사용할 수 있도록 제공됩니다.

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, ...

Cryo-EM은 이미지의 전반적인 품질을 향상시키는 현미경 하드웨어 자체의 발전과 많은 샘플에 존재하는 많은 양의 이질성을 처리할 수 있는 Cryo-EM 이미지를 처리하는 데 사용되는 소프트웨어의 개발을 포함하여 최근 많은 기술 발전이 있었습니다. 시료 전처리는 Cryo-EM에서 가장 큰 병목 현상 중 하나입니다. 시료 양은 제한적일 수 있으며 단백질은 유리화 중에 소수성 공기-물 계면에 흡수되는 경향이 있습니다.이로 인해 시료 변성, 더 큰 단백질 복합체의 분해 및 Cryo-EM 이미지에 존재하는 선호 입자 방향이 발생할 수 있습니다. 이 그리드는 스트렙타비딘과 비오틴 사이의 높은 친화성 상호 작용을 활용하여 비오틴화된 샘플을 묶고 소수성 공기-물 계면으로부터 보호합니다. 우리는 매우 적은 양의 샘플로 작업할 수 있으며, 샘플의 무작위 비오틴 의기양화는 다른 지지층을 사용할 때 관찰될 수 있는 우선 방향 문제를 극복하기 위한 전략을 제공합니다.

streptavidin-affinity-grid-fabrication-for-cryo-electron-microscopy

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Streptavidin-Affinity Grid Fabrication for Cryo-Electron Microscopy Sample Preparation

4.6K 조회수.  University of California, Berkeley. Cryo-EM은 이미지의 전반적인 품질을 향상시키는 현미경 하드웨어 자체의 발전과 많은 샘플에 존재하는 많은 양의 이질성을 처리할 수 있는 Cryo-EM 이미지를 처리하는 데 사용되는 소프트웨어의 개발을 포함하여 최근 많은 기술 발전이 있었습니다. 시료 전처리는 Cryo-EM에서 가장 큰 병목 현상 중 하나입니다. 시료 양은 제한적일 수 있으며 단백질은 유리화 중에 소수성 공기-물 ...

비디오: 저자 스포트라이트: Streptavidin-Biotin 접근법을 통한 Cryo-EM 시료 전처리 향상

Streptavidin affinity grids provide strategies to overcome many commonly encountered cryo-electron microscopy (cryo-EM) sample preparation challenges, including sample denaturation and preferential orientations that can occur due to the air-water interface. Streptavidin affinity grids, however, are currently utilized by few cryo-EM labs because they are not commercially available and require a careful fabrication process. Two-dimensional streptavidin crystals are grown onto a biotinylated lipid monolayer that is applied directly to standard holey-carbon cryo-EM grids. The high-affinity interaction between streptavidin and biotin allows for the subsequent binding of biotinylated samples that are protected from the air-water interface during cryo-EM sample preparation. Additionally, these grids provide a strategy for concentrating samples available in limited quantities and purifying protein complexes of interest directly on the grids. Here, a step-by-step, optimized protocol is provided for the robust fabrication of streptavidin affinity grids for use in cryo-EM and negative-stain experiments. Additionally, a trouble-shooting guide is included for commonly experienced challenges to make the use of streptavidin affinity grids more accessible to the larger cryo-EM community.

A step-by-step protocol for fabricating streptavidin affinity grids is provided for use in structural studies of challenging macromolecular samples by cryo-electron microscopy.