MCIN/AEI/10.13039/501100011033가 후원하는 Severo Ochoa Center of Excellence Accreditation CEX2021-001136-S와 Instituto de Salud Carlos III(ISCIII, Madrid, Spain)의 이니셔티브인 CIBERES에 대해 스페인의 Agencia Estatal de Investigación에 감사드립니다. 우리는 또한 GLYCOTWINNING 프로젝트를 위해 유럽연합 집행위원회(European Commission)에 감사를 표합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 분석을 위한 고급 NMR 기술

<ol>
	<li>Sol&#237;s, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+into+glycosciences:+How+chemistry,+biochemistry+and+biology+cooperate+to+crack+the+sugar+code.">A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).</li><li>Poveda, A., Jimenez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+studies+of+carbohydrate-protein+interactions+in+solution.">NMR studies of carbohydrate-protein interactions in solution.</a> Chem Soc Rev. 27, 133-144 (1998).</li><li>Kogelberg, H., Sol&#237;s, D., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+structural+insights+into+carbohydrate-protein+interactions+from+NMR+spectroscopy.">New structural insights into carbohydrate-protein interactions from NMR spectroscopy.</a> Curr Opin Struct Biol. 13 (5), 646-653 (2003).</li><li>Widmalm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+shape,+motions,+and+interactions+explored+by+NMR+spectroscopy.">Glycan shape, motions, and interactions explored by NMR spectroscopy.</a> JACS Au. 4 (1), 20-39 (2024).</li><li>Marchetti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=34;Rules+of+Engagement&amp;#34;+of+protein-glycoconjugate+interactions:+A+molecular+view+achievable+by+using+NMR+spectroscopy+and+molecular+modeling.">34;Rules of Engagement&amp;#34; of protein-glycoconjugate interactions: A molecular view achievable by using NMR spectroscopy and molecular modeling.</a> ChemistryOpen. 5 (4), 274-296 (2016).</li><li>Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+recognition+of+glycans+by+protein+receptors.+Insights+from+NMR+spectroscopy.">The recognition of glycans by protein receptors. Insights from NMR spectroscopy.</a> Chem Commun. 54 (38), 4761-4769 (2018).</li><li>Gimeno, A., Valverde, P., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycan+structures+and+their+interactions+with+proteins.">Glycan structures and their interactions with proteins.</a> A NMR view. Curr Opin Struct Biol. 62, 22-30 (2020).</li><li>Ca&#241;ada, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+and+structural+characterization+of+carbohydrates+and+their+interactions+studied+by+NMR.">Conformational and structural characterization of carbohydrates and their interactions studied by NMR.</a> Curr Med Chem. 29 (7), 1147-1172 (2022).</li><li>Valverde, P., Quintana, J. I., Santos, J. I., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+NMR+avenues+to+explore+the+conformation+and+interactions+of+glycans.">Novel NMR avenues to explore the conformation and interactions of glycans.</a> ACS Omega. 4, 13618-13630 (2019).</li><li>Jim&#233;nez-Barbero, J., Asensio, J. L., Ca&#241;ada, F. J., Poveda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Free+and+protein-bound+carbohydrate+structures.">Free and protein-bound carbohydrate structures.</a> Curr Opin Struct Biol. 9 (5), 549-555 (1999).</li><li>Quintana, J. I., Atxabal, U., Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+multivalent+carbohydrate-protein+interactions+by+NMR.">Exploring multivalent carbohydrate-protein interactions by NMR.</a> Chem Soc Rev. 52 (5), 1591-1613 (2023).</li><li>Rold&#243;s, V., Ca&#241;ada, F. J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carbohydrate-protein+interactions:+a+3D+view+by+NMR.">Carbohydrate-protein interactions: a 3D view by NMR.</a> Chembiochem. 12 (7), 990-1005 (2011).</li><li>Unione, L., Ard&#225;, A., Jim&#233;nez-Barbero, J., Millet, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMR+of+glycoproteins:+profiling,+structure,+conformation,+and+interactions.">NMR of glycoproteins: profiling, structure, conformation, and interactions.</a> Curr Opin Struct Biol. 68, 9-17 (2021).</li><li>del Carmen Fern&#225;ndez-Alonso, M., D&#237;az, D., Berbis, M. A., Marcelo, F., Ca&#241;ada, J., Jim&#233;nez-Barbero, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-carbohydrate+interactions+studied+by+NMR:+from+molecular+recognition+to+drug+design.">Protein-carbohydrate interactions studied by NMR: from molecular recognition to drug design.</a> Curr Protein Pept Sci. 13 (8), 816-830 (2012).</li><li>Angulo, J., Nieto, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STD-NMR:+application+to+transient+interactions+between+biomolecules-a+quantitative+approach.">STD-NMR: application to transient interactions between biomolecules-a quantitative approach.</a> Eur Biophys J. 40 (12), 1357-1369 (2012).</li><li>Mayer, M., Meyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Group+epitope+mapping+by+saturation+transfer+difference+NMR+to+identify+segments+of+a+ligand+in+direct+contact+with+a+protein+receptor.">Group epitope mapping by saturation transfer difference NMR to identify segments of a ligand in direct contact with a protein receptor.</a> J Am Chem Soc. 123 (25), 6108-6117 (2001).</li><li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+chemical+shift+perturbation+to+characterise+ligand+binding.">Using chemical shift perturbation to characterise ligand binding.</a> Prog Nucl Magn Reson Spectrosc. 73, 1-16 (2013).</li><li>Fern&#225;ndez, C., Adeishvili, K., W&#252;thrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transverse+relaxation-optimized+NMR+spectroscopy+with+the+outer+membrane+protein+OmpX+in+dihexanoyl+phosphatidylcholine+micelles.">Transverse relaxation-optimized NMR spectroscopy with the outer membrane protein OmpX in dihexanoyl phosphatidylcholine micelles.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (5), 2358-2363 (2001).</li><li>Yee, A., Gutmanas, A., Arrowsmith, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+NMR+in+structural+genomics.">Solution NMR in structural genomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 611-617 (2006).</li><li>Skinner, S. P., Fogh, R. H., Boucher, W., Ragan, T. J., Mureddu, L. G., Vuister, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CCPNMR+AnalysisAssign:+a+flexible+platform+for+integrated+NMR+analysis.">CCPNMR AnalysisAssign: a flexible platform for integrated NMR analysis.</a> J Biomol NMR. 66 (2), 111-124 (2016).</li><li>Gimeno, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimizing+the+entropy+penalty+for+ligand+binding:+Lessons+from+the+molecular+recognition+of+the+histo+blood-group+antigens+by+human+Galectin-3.">Minimizing the entropy penalty for ligand binding: Lessons from the molecular recognition of the histo blood-group antigens by human Galectin-3.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 58 (22), 7268-7272 (2019).</li></ol>

저자는 밝힐 것이 없습니다.

포화 전달 차이 NMR(STD-NMR)은 리간드-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 가장 많이 사용되는 다재다능한 NMR 방법이 되었습니다. 위에서 볼 수 있듯이 포화 전달 현상에 의존하며, 실험 설정에는 두 개의 1차원(1D) 1H스펙트럼, 즉 on-resonance¬ 및 ¬off-resonance 스펙트럼의 획득이 포함됩니다. 온 공명 실험 중에 단백질의 특정 양성자의 포화는 특정 기간(포화 시간 범위는 일반적으로 1-3초 범위) 동안 저전력 무선 주파수 펄스 트레인을 적용하여 달성됩니다. 리간드의 직접적인 포화를 피하기 위해, 포화 펄스의 주파수와 길이는 단백질의 특정 양성자를 선택적으로 조사하도록 최적화됩니다. 즉, 모든 리간드 신호의 빈 주파수에 적절한 길이로 적용되어야 합니다(그림 1). 일반적으로 50ms 포화 펄스의 경우 포화 영역에서 가장 가까운 리간드 신호까지 1ppm의 차이를 유지해야 합니다. 일반적으로, 단백질의 지방족 영역에 적용되는 선택적 포화 펄스는 증가된 포화 효과를 제공합니다. 대안적으로, 리간드 분자가 어떠한 방향족 신호도 포함하지 않는 경우 방향족 양성자(6-7 ppm)를 조사할 수 있다. 이것은 방향족 그룹을 가지고 있지 않기 때문에 자연적으로 발생하는 글라이칸에 매우 유용합니다. 단백질의 특정 영역에 선택적으로 조사되면 포화도는 쌍극자 1 H-1H 교차 이완(스핀 확산)을 통해 단백질을 따라 전파됩니다. 결국, 포화도는 결합 부위의 단백질 양성자에 도달하고, 이는 분자간 1 H-1H NOE를 통해 수용체와 밀접하게 접촉(r < 5 Å)되는 당 양성자로 전달됩니다. 분명히, 포화 리간드 양성자의 신호 강도는 감소합니다. 포화를 받은 후 결합 역학으로 인해 일시적으로 결합된 리간드(빠른 교환이 필요함)가 해리되고 포화 정보가 자유 상태로 축적됩니다. 이 과정으로 인해 NMR 온 공명 스펙트럼은 감소된 신호를 나타냅니다(그림 2).
결합 글라이칸의 1H핵의 이러한 강도 섭동을 명확하게 나타내기 위해, 포화가 동일한 조건에서 수용체 또는 탄수화물 신호(보통 40-100ppm 사이)에서 멀리 떨어진 곳에 적용되는 제어 양성자 NMR 스펙트럼(오프 공명)을 획득합니다. off-resonance와 on-resonance 사이의 빼진 1D 스펙트럼은 강도가 수정된 리간드의 1H핵의 신호, 즉 자화를 받을 수 있을 만큼 수용체 결합 부위에 충분히 가까운 신호를 독점적으로 보여줍니다(그림 2).
그럼에도 불구하고 결합 된 탄수화물의 모든 1H핵이 동일한 양의 포화도를받는 것은 아닙니다. 이론적으로, 수용체에서 결합된 리간드로의 자화 전달은 거리에 따라 달라집니다(1/r6). 이는 글리칸 1H핵 사이의 전이 포화 강도가 리간드의 양성자와 수용체의 양성자 사이의 공간적 근접성에 대한 정보를 포함하고 STD NMR 강도가 수용체에 더 가까운 양성자에 대해 더 크다는 것을 의미합니다. 따라서 STD NMR 실험은 단백질 표면에 더 가깝게 위치한 리간드의 양성자가 결합에 직접 참여하지 않는 것보다 더 높은 강도를 보여주기 때문에 탄수화물의 결합 에피토프를 결정할 수도 있습니다(그림 2 및 그림 3).
이 실험은 약한 친화도-중간 친화도를 가진 시스템에 적용할 수 있으며, 낮은 μM 또는 nM 범위에서 강한 친화도를 가진 시스템에는 드물게 적용할 수 있습니다. 실제로, 이완 시간 척도에서 해리 속도가 빨라야 합니다. 그렇지 않으면 리간드가 해리되기 전에 이완을 통해 포화 전달 정보가 손실됩니다.
반면에 단백질 기반 NMR 실험은 원자 분해능 구조를 해결하지 않고 아미노산 수준 정확도로 리간드-단백질 상호 작용을 밝히는 데 독특합니다. 공결정화(co-crystallization) 없이 용액 내 분자 인식 현상을 직접 검사합니다. CSP 분석 매핑은 리간드를 발견하고 단백질 결합 부위를 매핑하는 데 매우 강력합니다(그림 4 및 그림 5). 이 방법은 mM과 nM 범위 사이의 친화도의 모든 범위에 적용 가능하며, 화학적 이동 시간 척도(21)에서 환율이 느린 시스템의 경우에도 적용할 수 있다.
그럼에도 불구하고 이 접근법은 이완 문제로 인해 분자량이 30-40kDa 이상인 단백질에는 효과가 없을 것입니다. 그런 다음 TROSY 대안18 을 사용할 수 있으며, 단백질 중수소화와 결합할 때 특히 강력합니다. 또한, 단백질은 15N으로 균일하게 표지되어야 합니다(그리고 필요한 백본 할당을 완료할 수 있도록 13C 및 15N으로 이중 표지된 또 다른 샘플). 따라서, 해당 발현 시스템을 포함한 단백질 발현 조건은 밀리그램 양의 단백질을 얻을 수 있도록 최적화되어야 합니다. 올리고머화(oligomerize) 또는 응집(응집) 경향을 보이는 단백질도 이 분석에 적합하지 않습니다. NMR 데이터를 기록하기 위해 본 명세서에서 사용되는 기기는 TCI cryoprobe가 장착된 Bruker 800MHz 분광계이다. 이 방법론을 600MHz 미만의 기기를 사용하거나 극저온 프로브 없이 사용하는 것은 매우 어려울 수 있습니다.

글라이칸의 분자 인식은 건강 및 질병과 관련된 많은 과정에 필수적입니다. 글라이칸에 대한 생물학적 수용체(렉틴, 항체, 효소)의 특이성과 선택성은 엔탈피의 다양한 구성 요소(CH-π 및 van der Waals, 수소 결합, 정전기)와 엔트로피(소수성, 역학, 용매-탈용매화) 간의 불안정한 균형을 조정하는 데 크게 좌우됩니다1.
글라이칸의 큰 화학적 다양성과 동적 특성을 감안할 때, NMR 방법은 25년 이상 글라이칸 상호 작용을 해부하는 데 널리 사용되어 왔습니다2, 이러한 방법론은 다른 방법론을 사용하여 필요한 상호 작용 증거를 검색할 수 없는 경우에도 원자 분해능 3,4에서 정확한 세부 정보와 함께 분자 인식 이벤트에 대한 탁월한 정보를 제공하기 때문입니다. 요점으로, NMR은 다재다능하며 원자 수준에서, 다양한 시간 규모에서 동적 이벤트를 연구할 수 있게 해주어 용액 내 글라이칸의 구조, 형태 및 역학을 연구하기 위한 최고의 기술을 구성합니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 정보를 분리하는 것은 신중한 데이터 분석과 함께 잘 정의된 전략을 필요로 하는 다소 복잡한 과정일 수 있다5.
NMR 기술은 다양하며 실제로 글리칸-단백질 상호 작용을 밝히기 위해 사용할 수 있는 많은 방법론이 있습니다6. 여기에서는 현재 글리칸-수용체 상호 작용을 해독하기 위해 사용되는 두 가지 기본 NMR 접근법을 설명하며7,8, 주요 글라이칸 에피토프와 단백질 결합 부위9의 제시를 푸는 방법에 중점을 둡니다.
임의의 분자 인식 이벤트에서, 수용체가 주어진 리간드에 결합할 때, 결합(10)에 있는 참가자의 많은 NMR 파라미터에 영향을 미치는 화학적 교환 과정이 있다. 따라서, NMR 관점에서, 상호 작용은 글라이칸 리간드의 관점에서 또는 단백질 수용체11의 관점에서 모니터링될 수 있다. 일반적으로 단백질 수용체는 큰 생체 분자(느린 회전 운동, ns 시간 척도의 속도, 따라서 빠른 횡방향 이완)인 반면, 상호 작용하는 글라이칸은 중소형 분자(빠른 회전 운동, ps 시간 척도의 속도 및 느린 횡방향 이완)로 간주될 수 있습니다12. 표준 관점에서 볼 때, 글리칸의 NMR 신호는 좁고 수용체의 NMR 신호는 넓습니다13.
리간드 기반 NMR 방법은 자유 상태에서 결합 상태로 전달할 때 많은 글라이칸 NMR 매개변수가 경험하는 극적인 변화에 의존합니다(14). STD-NMR은 용액 상태에서의 결합의 존재를 추론하는 것부터 글리칸 결합 에피토프의 결정에 이르기까지 다양한 글리칸 결합 특징(15)을 평가하기 위해 가장 많이 사용되는 실험적 NMR 기술이다. 즉, 단백질 수용체(16)와 접촉하는 리간드의 원자.
대안적으로, 수용체-기반 NMR 방법은 apo 상태(17)에 대해 기록된 것들에 대해 글라이칸의 존재 하에 단백질 수용체의 신호에서 발생하는 변화를 모니터링한다. 이들은 주로 두 상태 사이의 단백질 신호의 화학적 이동 섭동을 스크리닝하는 데 중점을 둡니다. 가장 일반적으로 사용되는 실험은 1 H-15N HSQC 또는 TROSY 대안18입니다.
두 접근 방식의 조합을 통해 광범위한 친화력을 나타내는 많은 다양한 시스템에 NMR을 적용할 수 있습니다. 그러나 수용체 기반 NMR 방법의 경우 리간드를 기반으로 하는 방법과 달리 상대적으로 많은 양의 용해성, 비응집성, 안정 동위원소 표지(15N) 단백질을 사용할 수 있어야 합니다.
여기에서는 두 가지 방법을 모두 설명하고 강점과 약점을 강조합니다. 프로토콜에 설명된 기본 단계는 Bruker 분광계 사용에 대한 예제로 사용됩니다. 결과적으로 명령 및 매개 변수 이름은 TopSpin(Bruker의 분광계 제어 소프트웨어)에서 사용되는 것과 일치합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>5 mm Shigemi microtube set mat</td>
			<td>CortecNet SAS</td>
			<td>S30BMS-005B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alpha-Lactose-Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich Qu&#237;mica S.L.</td>
			<td>7634-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium chloride (15 N, 99%)</td>
			<td>LC-0179-N-50G</td>
			<td>Tracer Tecnolog&#237;as Anal&#237;ticas S.L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (Sodium Salt)&#160;</td>
			<td>Melford Laboratories LTD</td>
			<td>A40040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIOVIA Discovery studio&#160;</td>
			<td>BIOVIA, Dassault Syst&#232;mes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21(DE3) Chemically Competent Cells&#160;</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>CMC0014-40X40UL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Allegra X-22R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O&#160;</td>
			<td>Cambridge Isotope Laboratories, Inc.</td>
			<td>DLM-4-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Innova 42</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG (Isopropyl &#223;-D-1-thiogalactopyranoside)</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>VW437144N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LacNAc</td>
			<td>Elicityl</td>
			<td>GLY008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luria Bertani (LB) Broth</td>
			<td>Merck Life Science, S.L.U.</td>
			<td>3397-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matraz Erlenmeyer B N 5000 CC&#160;</td>
			<td>VWR International Eurolab S.L.</td>
			<td>214-1137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 10x</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1610780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>PyMOL Molecular Graphics System</td>
			<td>Version 2.0 Schr&#246;dinger</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Sonics &#38; Materials, Inc.</td>
			<td>VC 505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>600 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superconducting NMR magnet</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>800 MHz AVANCE III</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

disentangling glycan-protein interactions: nuclear magnetic resonance (nmr) to the rescue

글라이칸과 단백질의 상호 작용은 건강 및 질병과 관련된 많은 이벤트를 조절합니다. 사실, 이러한 인식 사건의 확립과 그 생물학적 결과는 두 파트너의 3차원 구조뿐만 아니라 그들의 역동적인 특징 및 해당 세포 구획에 대한 표현과 밀접한 관련이 있습니다. NMR 기술은 이러한 특성을 풀기 위해 고유하며, 실제로 다양한 NMR 기반 방법론이 개발되어 관련 수용체와 글리칸의 결합 이벤트를 모니터링하는 데 적용되었습니다. 이 프로토콜은 NMR-glycobiology 분야에서 사용되는 가장 강력한 NMR 방법론 중 두 가지인 1H-포화 전달 차이(STD) 및 1 H,15N-Heteronuclear 단일 양자 일관성(HSQC) 적정 실험을 획득, 처리 및 분석하는 절차를 간략하게 설명하며, 각각 글라이칸 및 단백질 관점에서 정보를 보완적으로 제공합니다. 실제로, 이 둘을 결합하면 분자 인식 프로세스의 구조적 측면과 동적 측면을 모두 설명할 수 있는 강력한 툴킷을 제공합니다. 이 포괄적인 접근 방식은 글라이칸-단백질 상호 작용에 대한 이해를 높이고 화학 당생물학 분야의 연구를 발전시키는 데 기여합니다.

여기에서는 렉틴과 작은 올리고당 간의 결합 상호 작용에 대한 세부 사항을 밝히기 위해 1H-STD NMR 및 1 H-15N HSQC 실험을 활용하기 위한 프로토콜을 제시합니다. hGalectin-7(hGal-7)에 의한 LacNAc의 분자 인식 분석에서 얻은 결과가 포함되어 있으며, 이는 프로토콜의 성공적인 구현과 분자 인식 프로세스의 세부 사항을 연구하기 위한 이러한 NMR 방법론의 효과에 대한 예시적인 예시 역할을 합니다. 그림 3은 LacNAc와 hGal-7의 상호 작용에 대한 1H-STD NMR 스펙트럼을 보여줍니다. STD NMR 신호의 존재는 결합을 나타냅니다(그림 3A). 더욱이, 단백질과 밀접하게 접촉하는 양성자에 속하는 신호만 나타나 결합 항원결정기(binding epitope)를 묘사할 수 있습니다(그림 3B). 그림 4는 단백질의 1 H-15N HSQC 스펙트럼을 지문으로 사용할 수 있는 방법을 보여주며, 그림 5는 LacNAc 결합 시 hGalectin-7 백본 아미드 그룹의 화학적 이동 섭동을 정의하기 위해 1 H-15N 이종핵 단일 양자 일관성(HSQC) 적정 실험을 적용하는 방법을 보여줍니다. 이러한 데이터는 상호 작용의 존재를 나타낼 뿐만 아니라 렉틴의 결합 인터페이스를 설명합니다. 그림 6은 적정 데이터 분석을 통해 높은 마이크로몰 범위에 속하는 hGalectin-7에 의한 LacNAc의 결합 친화도를 추정할 수 있는 방법을 보여줍니다. 이 결과는 대체 기술을 사용하여 얻은 결과와 일치합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig01.jpg"> 그림 1: 온 공진 주파수의 선택. pH 7.4에서 중수소화 인산염 완충 식염수에서 LacNAc:hGal-7 50:1 비율의 1H-NMR 스펙트럼이 표시됩니다. 리간드(LacNAc)의 신호는 2.0-5.2ppm 사이의 영역에 국한됩니다. 포화 주파수는 1-2ppm 범위 내에서 리간드 양성자가 없는지 확인하기 위해 신중하게 선택되어 단백질의 양성자를 선택적으로 조사할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig02.jpg"> 그림 2: STD NMR 실험. STD 실험의 개략도: 첫 번째 스펙트럼(off-resonance)은 참조 역할을 하고 두 번째 스펙트럼(on-resonance)에서는 단백질 포화가 수행됩니다. 포화도는 전체 단백질에 걸쳐 효율적으로 전파되고 단백질과 밀접하게 접촉하는 리간드 양성자로 전달됩니다. 결과 차이 스펙트럼(STD 스펙트럼)은 포화를 경험한 공명만 생성합니다. STD 실험의 분석은 결합 설탕의 epitope 매핑을 허용합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig03.jpg"> 그림 3: 리간드의 관점에서 본 결합 분석. (A) LacNAc와 hGal-7의 상호 작용에 대한 오프 공진 및 1H STD-NMR 스펙트럼의 중첩. STD 스펙트럼에서는 단백질과 밀접하게 접촉하는 양성자에 속하는 신호만 나타납니다. 리간드의 1H공명에 대한 주석은 오프 공명 스펙트럼에서 보고됩니다. (B) 상대적인 STD 강도는 LacNAc의 화학 구조에 컬러 매핑되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig04.jpg"> 그림 4: 단백질의 1 H-15N HSQC 스펙트럼은 지문을 나타냅니다. (A) apo 형태로 100μM의 hGal-7의 1 H-15N HSQC 스펙트럼. 스펙트럼은 25°C에서 기록되었습니다. 일부 NH cross-peaks는 해당 아미노산의 라벨로 주석을 달았습니다. (B) 각 NH 쌍은 화학적 환경과 결과적으로 단백질의 3D 구조에 따라 달라지는 고유한 화학적 변화를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig05.jpg"> 그림 5: 단백질의 관점에서 본 결합 분석. (A) LacNAc를 hGal-7 용액에 적정하기 위해 기록된 1 H-15N HSQC 스펙트럼의 중첩이 표시됩니다. 여러 교차 피크가 화학적 이동 변화를 경험하는 스펙트럼을 검사하면 상호 작용이 명확하게 나타납니다. (B) hGal-7을 사용한 LacNAc(15개 등가물)의 적정에서 추론된 백본 아미드 신호의 최대 화학적 이동 섭동(maxCSP)의 플롯. (C) CSP 분석에 따르면 hGal-7의 가장 교란된 아미노산은 5gal PDB 구조에 매핑됩니다. 3D 모델에서 빨간색은 2σ 이상의 CSP 값을 나타내고 분홍색은 1σ에서 2σ 사이의 값을 나타냅니다. 색상이 지정된 영역은 결합 부위를 나타낼 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66530/66530fig06.jpg"> 그림 6: 1 H-15N HSQC 적정 실험을 기반으로 한 KD 측정. (A) 연구 시스템의 NMR 시간 척도에서 화학적 교환율에 따른 1 H-15N HSQC 기반 적정의 패턴 표현(빠름, 중간 또는 느림). LacNAc/hGal-7 상호작용의 경우 빠른 교환 체제가 관찰되었습니다. (B) hGal-7 및 LacNAc 이당류의 모델 시스템에 대한 다양한 리간드 농도에서 CSP 분석에서 얻은 피팅 곡선및 KD 추정. 추정된 KD는 20개의 서로 다른 아미노산에 대한 데이터의 평균으로서 해당 오차와 함께 보고됩니다. (C) 적정 중 선택된 교차 피크의 이동을 표시하는 1 H,15N-HSQC 스펙트럼의 스니펫. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66530/66530fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

저자 스포트라이트: Unveiling the Structural and Dynamic Aspects of Glycan Molecular Recognition (글라이칸 분자 인식의 구조적 및 동적 측면 공개)

여기에서는 용액에서 단백질-글라이칸 상호 작용을 특성화하는 것을 목표로 하는 일련의 NMR 실험의 획득, 처리 및 분석을 자세히 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 가장 일반적인 리간드 기반 및 단백질 기반 방법론이 요약되어 있으며, 이는 의심할 여지 없이 구조 당생물학 및 분자 인식 연구 분야에 기여합니다.

글라이칸-단백질 상호 작용 해체: 핵 자기 공명(NMR)을 위한 구조

The interactions of glycans with proteins modulate many events related to health and disease. In fact, the establishment of these recognition events and ...

당사의 연구는 다양한 글리칸 렉틴 시스템에 대한 연구를 탐구하여 건강 및 질병과의 연관성을 탐구합니다. 우리는 화학, 생물학 및 생물 의학의 방법론을 병합하여 암에서 박테리아 및 바이러스 감염에 이르기까지 병리학자에 대한 면역 반응의 역할을 심층적으로 조사했습니다. 최근 글리코 과학은 구조 분자 인식 측면의 글라이칸 설계, 합성 및 분석을 원자 수준에서 세포 수준으로 변화시킴으로써 획기적인 이정표를 세웠습니다.이러한 발전은 총체적으로 형광 또는 고급 글리칸 기반 치료법을 위한 무대를 마련했습니다. 이 프로토콜은 글라이칸 분야에서 사용되는 가장 강력한 NMR 방법론 중 두 가지를 획득, 처리 및 분석하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 방법론, 포화 전달 차이 및 화학적 안전 섭동 분석은 지의류 분자 인식의 구조적 및 동적 측면에 대한 정확한 정보를 제공합니다.

disentangling-glycan-protein-interactions-nuclear-magnetic-resonance

Research

JoVE Journal

Chemistry

Disentangling Glycan-Protein Interactions: Nuclear Magnetic Resonance (NMR) to the Rescue

644 조회수.  CIC bioGUNE, Basque Research and Technology Alliance (BRTA). 당사의 연구는 다양한 글리칸 렉틴 시스템에 대한 연구를 탐구하여 건강 및 질병과의 연관성을 탐구합니다. 우리는 화학, 생물학 및 생물 의학의 방법론을 병합하여 암에서 박테리아 및 바이러스 감염에 이르기까지 병리학자에 대한 면역 반응의 역할을 심층적으로 조사했습니다. 최근 글리코 과학은 구조 분자 인식 측면의 글라이칸 설계, 합성 및 분석을 원자 수준에서 세포...

비디오: 저자 스포트라이트: Unveiling the Structural and Dynamic Aspects of Glycan Molecular Recognition (글라이칸 분자 인식의 구조적 및 동적 측면 공개)

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox reactions. The Cu (I) complex of the peptide model of a Cu (I) binding metallochaperone protein, which includes the sequence MTCSGCSRPG (underlined is conserved), was determined in solution under inert conditions by NMR spectroscopy.
NMR is a widely accepted technique for the determination of solution structures of proteins and peptides. Due to difficulty in crystallization to provide single crystals suitable for X-ray crystallography, the NMR technique is extremely valuable, especially as it provides information on the solution state rather than the solid state. Herein we describe all steps that are required for full three-dimensional structure determinations by NMR. The protocol includes sample preparation in an NMR tube, 1D and 2D data collection and processing, peak assignment and integration, molecular mechanics calculations, and structure analysis. Importantly, the analysis was first conducted without any preset metal-ligand bonds, to assure a reliable structure determination in an unbiased manner.

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

The NMR-solution structure of a metallochaperone model peptide with Cu (I) was determined, and a detailed protocol from sample preparation and 1D and 2D data collection to a three-dimensional structure is described.

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

연구

화학

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic isotopes are typically incorporated metabolically to improve the sensitivity and allow for sequential resonance assignment. Reductive 13C-methylation is an alternative labeling method for proteins that are not amenable to bacterial host over-expression, the most common method of isotope incorporation. Reductive 13C-methylation is a chemical reaction performed under mild conditions that modifies a protein&#39;s primary amino groups (lysine &#949;-amino groups and the N-terminal &#945;-amino group) to 13C-dimethylamino groups. The structure and function of most proteins are not altered by the modification, making it a viable alternative to metabolic labeling. Because reductive 13C-methylation adds sparse, isotopic labels, traditional methods of assigning the NMR signals are not applicable. An alternative assignment method using mass spectrometry (MS) to aid in the assignment of protein 13C-dimethylamine NMR signals has been developed. The method relies on partial and different amounts of 13C-labeling at each primary amino group. One limitation of the method arises when the protein&#39;s N-terminal residue is a lysine because the &#945;- and &#949;-dimethylamino groups of Lys1 cannot be individually measured with MS. To circumvent this limitation, two methods are described to identify the NMR resonance of the 13C-dimethylamines associated with both the N-terminal &#945;-amine and the side chain &#949;-amine. The NMR signals of the N-terminal &#945;-dimethylamine and the side chain &#949;-dimethylamine of hen egg white lysozyme, Lys1, are identified in 1H-13C heteronuclear single-quantum coherence spectra.

Methods to Identify the NMR Resonances of the 13C-Dimethyl N-terminal Amine on Reductively Methylated Proteins

Two methods for assigning the &#945;- and &#949;-dimethylamine nuclear magnetic resonance signals of a reductively 13C-methylated N-terminal lysine are described. One method utilizes the pH-induced selectivity of the reductive methylation reaction, and the other uses aminopeptidase to selectively remove the N-terminal lysine.

의 NMR 공명 확인하는 방법<sup&gt; 13</sup환원 메틸을 단백질에&gt; C-디메틸 N-말단 아민

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is a proven technique for protein structure and dynamic studies. To study proteins with NMR, stable magnetic ...

Dissolution Dynamic Nuclear Polarization Instrumentation for Real-time Enzymatic Reaction Rate Measurements by NMR

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of metabolic transformations. Hyperpolarization via dissolution DNP circumvents part of the sensitivity issues thanks to the large out-of-equilibrium nuclear magnetization stemming from the electron-to-nucleus spin polarization transfer. The high NMR signal obtained can be used to monitor chemical reactions in real time. The downside of hyperpolarized NMR resides in the limited time window available for signal acquisition, which is usually on the order of the nuclear spin longitudinal relaxation time constant, T1, or, in favorable cases, on the order of the relaxation time constant associated with the singlet-state of coupled nuclei, TLLS. Cellular uptake of endogenous molecules and metabolic rates can provide essential information on tumor development and drug response. Numerous previous hyperpolarized NMR studies have demonstrated the relevancy of pyruvate as a metabolic substrate for monitoring enzymatic activity in vivo. This work provides a detailed description of the experimental setup and methods required for the study of enzymatic reactions, in particular the pyruvate-to-lactate conversion rate in presence of lactate dehydrogenase (LDH), by hyperpolarized NMR.

The sensitivity enhancement provided by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) enables following metabolic processes in real time by NMR and MRI. The characteristics and performances of a dedicated dissolution DNP setup designed for study enzymatic reactions are discussed.

The main limitation of NMR-based investigations is low sensitivity. This prompts for long acquisition times, thus preventing real-time NMR measurements of ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

EOB-DTPA와의 조지아 (III) 단지에 대한 조사 그것<sup&gt; (68)</sup&gt; 조지아 방사성 표지 된 아날로그

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our group to study processes of mutual-site chemical exchange that are difficult to analyze by traditional methods. As the name suggests, this method combines the Spin Saturation Transfer method used for small molecules, with the Saturation Transfer Difference (STD) NMR method employed for the study of protein-ligand interactions, by measuring transient spin saturation transfer along increasing saturation times (build-up curves) in small organic and organometallic molecules undergoing chemical exchange.
Advantages of this method over existing ones are: there is no need to reach coalescence of the exchanging signals; the method can be applied as long as one signal of the exchanging sites is isolated; there is no need to measure T1 or reach steady state saturation; rate constant values are measured directly, and T1 values are obtained in the same experiment, using only one set of experiments.
To test the method, we have studied the dynamics of the hindered rotation of N,N-dimethylamides, for which much data is available for comparison. The thermodynamic parameters obtained using SSTD are very similar to the reported ones (spin-saturation transfer techniques and line-shape analysis). The method can be applied to more challenging substrates that cannot be studied by previous methods.
We envisage that the simple experimental set up and the wide applicability of the method to a great variety of substrates will make this a common technique amongst organic and organometallic chemists without extensive expertise in NMR.

Spin Saturation Transfer Difference NMR SSTD NMR: A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

A detailed protocol describing the SSTD NMR method is presented here to help new users apply this new method to obtain the kinetic parameters of their own systems undergoing chemical exchange.

This detailed protocol describes the new Spin Saturation Transfer Difference Nuclear Magnetic Resonance protocol (SSTD NMR), recently developed in our ...

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance imaging (MRI). Their purpose is to enhance the relaxation rate of water protons in tissue, thus increasing the MR image contrast and the specificity of the MRI measurements. Current clinically approved contrast agents are low molecular weight molecules that are rapidly cleared from the body. The use of dendrimers as carriers of paramagnetic chelators can play an important role in the future development of more efficient MRI contrast agents. Specifically, the increase in local concentration of the paramagnetic species results in a higher signal contrast. Furthermore, this CA provides a longer tissue retention time due to its high molecular weight and size. Here, we demonstrate a convenient procedure for the preparation of macromolecular MRI contrast agents based on poly(amidoamine) (PAMAM) dendrimers with monomacrocyclic DOTA-type chelators (DOTA &#8211; 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetate). The chelating unit was appended by exploiting the reactivity of the isothiocyanate (NCS) group towards the amine surface groups of the PAMAM dendrimer to form thiourea bridges. Dendrimeric products were purified and analyzed by means of nuclear magnetic resonance spectroscopy, mass spectrometry, and elemental analysis. Finally, high resolution MR images were recorded and the signal contrasts obtained from the prepared dendrimeric and the commercially available monomeric agents were compared.

Preparation and In Vitro Characterization of Dendrimer-based Contrast Agents for Magnetic Resonance Imaging

This protocol describes the preparation and characterization of a dendrimeric magnetic resonance imaging (MRI) contrast agent that carries cyclen-based macrocyclic chelates coordinating paramagnetic gadolinium ions. In a series of MRI experiments in vitro, this agent produced an amplified MRI signal when compared to the commercially available monomeric analogue.

준비 및<em&gt; 체외</em&gt; 자기 공명 영상에 대한 덴드리머 기반 대조 대리인의 특성

Paramagnetic complexes of gadolinium(III) with acyclic or macrocyclic chelates are the most commonly used contrast agents (CAs) for magnetic resonance ...

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the average content of fluorinated drugs in their formulated drug product forms: tablets or capsules. This method is specific to fluorinated drugs because it detects only the content of fluorine, avoiding interference from the excipients that lack fluorine. The advantages of measuring the active content of fluorinated drugs using low-field 19F TD-NMR versus high-field 19F solid-state (SS) NMR are the simplicity of the method; the low cost; and the non-destructive nature of the technique, with all samples recoverable in intact forms (e.g., powders, tablets, and capsules), making this technique affordable for any laboratory.
We have tested the method with three fluorinated drug products available on the market - cinacalcet, lansoprazole, and ciprofloxacin - with doses ranging from 15 to 500 mg. The results of the analyses, measured by low-field 19F TD-NMR, supported the reported label claims for the average drug content.
Based on the simplicity and reproducibility of the analysis, we envision this methodology being implemented in any laboratory, including manufacturing plants, as a process analytical technology (PAT) tool in the pharmaceutical industry.

Application and Methodology of the Non-destructive 19F Time-domain NMR Technique to Measure the Content in Fluorine-containing Drug Products

A simple and non-destructive technique that measures the average content of drug substances in formulated drug products containing fluorine using low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) is presented here. The technique can be applied to the development and manufacturing of drugs in the pharmaceutical industry.

응용 프로그램 및 비 파괴적인 19F 시간 영역 NMR 기법의 방법론 포함 하는 불 소 약 제품에 콘텐츠를 측정 하

Here, we describe a protocol developed by our group that uses low-field fluorine-19 (19F) time-domain (TD) nuclear magnetic resonance (NMR) to measure the ...

Disentangling High Strength Copolymer Aramid Fibers to Enable the Determination of Their Mechanical Properties

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to diversify the fiber choices in the United States body armor market, copolymer fibers based on the combination of 5-amino-2-(p-aminophenyl) benzimidazole (PBIA) and the more conventional PPTA were introduced. Little is known regarding the long-term stability of these fibers, but as condensation polymers, they are expected to have potential sensitivity to moisture and humidity. Therefore, characterizing the strength of the materials and understanding their vulnerability to environmental conditions is important for evaluating their use lifetime in safety applications. Ballistic resistance and other critical structural properties of these fibers are predicated on their strength. To accurately determine the strength of the individual fibers, it is necessary to disentangle them from the yarn without introducing any damage. Three aramid-based copolymer fibers were selected for the study. The fibers were washed with acetone followed by methanol to remove an organic coating that held the individual fibers in each yarn bundle together. This coating makes it difficult to separate single fibers from the yarn bundle for mechanical testing without damaging the fibers and affecting their strength. After washing, fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy was performed on both washed and unwashed samples and the results were compared. This experiment has shown that there are no significant variations in the spectra of poly(p-phenylene-benzimidazole-terephthalamide-co-p-phenylene terephthalamide) (PBIA-co-PPTA1) and PBIA-co-PPTA3 after washing, and only a small variation in intensity for PBIA. This indicates that the acetone and methanol rinses are not adversely affecting the fibers and causing chemical degradation. Additionally, single fiber tensile testing was performed on the washed fibers to characterize their initial tensile strength and strain to failure, and compare those to other reported values. Iterative procedural development was necessary to find a successful method for performing tensile testing on these fibers.

The primary goal of the study is to develop a protocol to prepare consistent specimens for accurate mechanical testing of high strength copolymer aramid fibers, by removing a coating and disentangling the individual fiber strands without introducing significant chemical or physical degradation.

그들의 기계적 특성의 결정 수 있도록 고 강도 공중 합체 Aramid 섬유 disentangling

Traditionally, soft body armor has been made from poly(p-phenylene terephthalamide) (PPTA) and ultra-high molecular weight polyethylene. However, to ...

High-Temperature and High-Pressure In situ Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy represents an important technique to understand the structure and bonding environments of molecules. There exists a drive to characterize materials under conditions relevant to the chemical process of interest. To address this, in situ high-temperature, high-pressure MAS NMR methods have been developed to enable the observation of chemical interactions over a range of pressures (vacuum to several hundred bar) and temperatures (well below 0 &#176;C to 250 &#176;C). Further, the chemical identity of the samples can be comprised of solids, liquids, and gases or mixtures of the three. The method incorporates all-zirconia NMR rotors (sample holder for MAS NMR) which can be sealed using a threaded cap to compress an O-ring. This rotor exhibits great chemical resistance, temperature compatibility, low NMR background, and can withstand high pressures. These combined factors enable it to be utilized in a wide range of system combinations, which in turn permit its use in diverse fields as carbon sequestration, catalysis, material science, geochemistry, and biology. The flexibility of this technique makes it an attractive option for scientists from numerous disciplines.

The molecular structures and dynamics of solids, liquids, gases, and mixtures are of critical interest to diverse scientific fields. High-temperature, high-pressure in situ MAS NMR enables detection of the chemical environment of constituents in mixed phase systems under tightly controlled chemical environments.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy represents an important technique to understand the structure and bonding environments of molecules. There ...