축산 프로토콜을 세밀하게 조정해 준 이전 B. coprophila 재고 보유자(Jacob E. Bliss, Paula Bonazinga, Anne W. Kerrebrock, Ingrid M. Mercer, Heidi S. Smith)와 연구 인력(특히 Robert Baird, Michael S. Foulk, Donna Kubai, John M. Urban, Yutaka Yamamoto)에게 특별한 감사를 드립니다. B. coprophila 치료에 대한 초기 지침은 Helen V. Crouse, Natalia Gabrusewycz-Garcia, Reba M. Goodman, Charles W. Metz 및 Ellen Rasch에 의해 제공되었습니다. Yukiko Yamashita와 Anne W. Kerrebrock에게 Bradysia (Sciara) 재고 센터를 맡아준 것에 대해 감사를 표합니다. 그림을 준비하는 데 도움을 주신 Brian Wiegmann(그림 1), John M. Urban(그림 4 상단 패널), Laura Ross(그림 4 하단 패널), Yutaka Yamamoto(그림 5 왼쪽 패널), Leo Kadota(그림 7 및 그림 8)에게 감사드립니다. 사진 촬영과 촬영에 도움을 준 Ava Filiss와 Brown University Multidisciplinary Laboratory에 감사드립니다. 이 원고에 대한 의견을 제시해 준 로버트 베어드(Robert Baird)에게 감사를 표한다. B. coprophila 에 대한 우리의 연구 및 유지는 NIH GM121455에서 S.A.G.에 이르기까지 가장 최근의 지원을 포함하여 NIH와 NSF의 지원을 받았습니다. B. coprophila 에 대한 자세한 내용은 현재 건설 중인 Bradysia (Sciara) Stock Center 웹사이트(https://sites.brown.edu/sciara/ 및 https://sciara.wi.mit.edu)에서 확인할 수 있습니다.

&lt;i&gt;Bradysia coprophila&lt;/i&gt; Lab Protocols and Chromosomal Research

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

B. coprophila의 축산을 위해 여기에 제시된 프로토콜은 이 유기체의 고유한 생물학적 특징을 탐구하기 위한 실험을 위해 실험실에서 이 유기체를 키우고자 하는 과학자들에게 유용할 것입니다. B. coprophila29를 유지하기 위해 한천 염기에 효모와 버섯 분말을 뿌려 먹이는 방법에 대한 초기 설명은 Metz 실험실에서 14 종의 Sciarid 파리를 기르는 데 사용되었습니다5. 그 후, 쐐기풀 및/또는 시금치 분말의 첨가가 B. coprophila의 활력을 더욱 증가시키는 것이 관찰되었습니다(Gabrusewycz-Garcia, personal communication). 이러한 방법은 현재 배양 중인 Bradysia impatiens와 Lycoriella ingenua를 포함하여 Sciaridae 가족 내의 관련 종의 유지에 성공적이었습니다(Robert Baird, personal communication).
다른 방법(예: 아래에 설명된 대체 먹이 방법)이 B. coprophila를 키우기 위해 시도되었지만, 여기에 설명된 프로토콜은 가장 비옥한 지방 성체를 얻고 곰팡이의 성장을 최소화하기 위해 한천의 표면적당 가장 유리한 유충 비율을 갖도록 최적화되었습니다. 규모를 확장하기 위해 위의 프로토콜 2에 설명된 대로 유리 바이알에서 대량 결합을 수행할 수 있습니다. 대안적으로, 몇 마리(2-4)마리의 성인 암컷을 초파리 를 기르는 데 사용되는 것과 같은 플라스크에 두 배 많은 성인 남성과 함께 넣을 수 있습니다(일회용 6온스 = 177.4mL 정사각형 바닥 초파리 폴리프로필렌 병). 두 경우 모두에서, 연구자는 플라스크에 모든 여성 생산자 또는 모든 남성 생산자 어머니만 포함되어 있다는 것을 완전히 확신해야 합니다.
번데기와 성충은 먹지 않기 때문에 유충에게만 먹이를 주십시오. 유충이 번데기로 변한 경우 바이알에 먹이를 주지 마십시오(이것의 징후는 처음으로 일찍 출현하는 성충 파리가 나타날 때입니다). 성체가 닫히면 바이알을 더 차가운 인큐베이터(예: 16°C)에 넣으면 성체가 더 오래 살 수 있습니다. 일주일에 세 번(예: 월요일, 수요일, 금요일) 먹이를 주고 유충이 자라면서 바이알당 주는 음식의 양을 늘립니다. 넉넉하게 먹이면 뚱뚱하고 비옥한 성인으로 보상받을 수 있습니다. 그러나 너무 많이 먹이면 흰 곰팡이가 나타나며 이는 바이알에 쌓이는 음식의 양을 줄이라는 신호입니다. 또한 너무 많이 먹이면 한천 위에 두꺼운 먹이 패드가 생겨 성충이 나오기 어렵게 됩니다(집게로 패드를 제거할 수 있지만 패드로 유충을 꺼내지 않도록 주의하십시오. 전혀 하지 않는 것이 가장 좋습니다). 유충이 거의 없는 유리병("few"로 표시)은 더 적은 양의 음식이 필요합니다. 너무 적게 먹이면 유충이 먹이를 찾기 위해 유리병의 벽을 기어오를 것입니다. 영양이 부족한 유충은 번식력이 떨어지는 작은 성충을 낳습니다.
대체 수유 방법 일주일에 3번이 아닌 유충 단계에서 한 번만 유충에게 먹이를 주기 위한 다양한 방법이 시도되었습니다. B. coprophila 는 초파리 스타일의 식품에서 자라지 않습니다. John Urban (개인 커뮤니케이션)은 B. coprophila 식품을 한천에 섞어 보았지만 곰팡이가 너무 많이 자랐습니다. 그는 두 가지 곰팡이 억제제(테고셉트와 프로피온산)를 조합하여 또는 따로 첨가하여 여러 가지 다른 농도를 시도하면 모두 곰팡이를 억제하는 수준에서 B. coprophila 에 독성이 있음을 발견했습니다. 한천은 pH 6-7(중성)이어야 하며, B. coprophila 는 산성 pH(프로피안산과 마찬가지로)에서 병에 걸립니다. 또는 일주일에 세 번 먹이를 주지 않기 위해 바늘 없이 주걱이나 주사기를 사용하여 걸쭉한 효모 페이스트(Red Star 활성 건조 효모를 약간의 증류수와 혼합하여 적시게 하는 것)를 짝짓기 후 1주일 후(즉, 유충이 나오기 시작할 무렵) 각 유리병의 한천 위에 덩어리로 분배해 보았습니다.
일주일에 세 번 먹이는 것을 피하는 또 다른 방법은 각 바이알에 살아있는 곰팡이 배양액을 추가하는 것입니다. Bath and Sponsler(37 )는 Sabouraud의 배지가있는 경 사진 한천 표면은 Chaetoconidia (최고) 속의 곰팡이 배양 또는 Baplosporangia 또는 Xllescheria로 줄무늬가되어야한다고보고했습니다. 곰팡이는 B. coprophila 가 도입되기 몇 일에서 일주일 전에 성장했습니다. 그 후에는 수유가 필요하지 않았습니다. 이 방법의 변형은 Ellen Rasch (개인 의사 소통)에 의해서도 사용되었습니다. 우리 손에서는 이 방법으로 바이알이 너무 젖어 유충이 익사했지만, 살아있는 곰팡이가 있는 바이알에 비해 유충 수를 최적화하기 위해 다시 시도할 수 있었습니다.
아서 포러(Arthur Forer)는 학파리와 같은 방법으로 B. 코프로필라(B. coprophila )를 기르는 데 어느 정도 성공을 거두었다(38). 이 접근 방식을 통해 번데기는 축축한 종이 마셰에서 자랐습니다. 그 후, 성충을 교배시키고 알을 신선하고 촉촉한 종이 마셰에 쌓았습니다. 그 결과 태어난 유충은 페트리 접시에 담아 종이 에 담아 일주일에 두 번 쐐기풀 잎 가루를 먹였습니다. 번데기를 새장에 넣어 이 과정을 반복했습니다.
Yukiko Yamashita (개인 커뮤니케이션)는 습도가 높은 화분과 온실에서 자연에서 발견되는 조건을 모방하여 토양에서 B. coprophila를 기르려고 노력했지만 성공하지 못했습니다. 그러나 습도 수준이 높아지면 곰팡이가 문제가 될 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 축축한 토양은 축축한 토양이 있는 플라스틱 상자에 Pseudolycoriella(이전에는 Bradysia) hygida 유충을 키우는 데 성공적으로 사용되었습니다. 그들은 분해 된 Ilex paraguariensis 잎을 먹이며, 1.2 % 효모 추출물, 1.4 % 옥수수 전분, 0.8 % 오트밀 가루, 1.2 % 한천12로 보충됩니다. 유사하게, 축축한 토양은 분쇄 된 강낭콩과 함께 축축한 이탄 이끼로 대체하여 Sciarid 파리를 키울 수 있습니다39,40.
브라디시아의 실험실 배양을 유지하기 위해 또 다른 방법들이 사용되었다: (i) 효모와 건조된 혈액 비료를 첨가한 고압멸균 감자41; (ii) 건조된 혈액을 첨가할 수 있는 분뇨 42,43,44 45; (iii) 면봉이 있는 플라스틱 용기와 다진 콩이 든 적신 종이 타월46.
진드기 진드기는 Drosophila에서 B. coprophila로 전염될 수 있습니다. 이를 최소화하기 위해, B. coprophila는 Drosophila 주식에 가깝지 않은 별도의 인큐베이터 또는 방에 보관하는 것이 가장 좋습니다. 또한, Drosophila를 다루기 전에 이른 아침에 B. coprophila 유지 관리 작업을 수행하십시오. 진드기는 또한 관엽 식물에서 B. coprophila로 옮겨질 수 있으므로 식물을 B. coprophila와 같은 방에 두지 마십시오. 진드기가 바이알에 침입하면 B. coprophila의 몸에 기어 다니는 작은 흰색 구형 유기체로 볼 수 있습니다. 초파리의 진드기를 파괴하는 화학 처리는 화학 물질이 B. coprophila를 죽이기 때문에 B. coprophila에 사용할 수 없습니다 (B. coprophila는 페놀과 같은 유기 가스에도 민감합니다). B. coprophila 주식에서 진드기를 제거하는 유일한 치료법은 한천 판에서 배아를 수동으로 수집하고 진드기가 없는지 각각 검사한 다음 가는 붓을 사용하여 신선한 한천 유리병에 옮기는 것입니다. 면으로 채워진 거즈 플러그와 셀룰로오스 아세테이트 폼 플럭(Drosophila 폴리프로필렌 바이알에 사용됨)은 모두 바이알에 진드기가 들어가는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
축산 프로토콜의 유용성 여기에 설명된 프로토콜은 성장하는 과학자 커뮤니티가 B. coprophila 를 새로운/오래된 신흥 모델 유기체로 키워 고유한 생물학적 특징을 연구할 수 있도록 할 것입니다. 새로운 실험실 그룹은 Bradysia (Sciara)의 독특한 생물학적 특징을 유지하고 조사하기 위해 성장하는 커뮤니티에 가입하도록 권장됩니다.

생물학적 원리를 완전히 이해하려면 생명의 나무에 걸쳐 있는 다양한 유기체에 대한 연구가 필요합니다. 19세기 말까지 광범위한 유기체가 설명되었지만 20세기 중반까지 실험 연구는 12 개 미만의 모델 유기체로 제한되었습니다. 게놈 시대가 도래하고 생명의 나무1에 있는 모든 종의 게놈 염기서열을 분석하는 것이 목표됨에 따라 우리는 이제 실험실 실험에 사용되는 유기체의 유형을 확장하고 그 다양성의 이점을 누릴 수 있는 위치에 있습니다. 실험을 위한 새로운 모델 유기체의 이러한 확장은 실험실에서 이를 유지할 수 있는 전제 조건을 가지고 있습니다. 여기에서는 이러한 신흥/기존 모델 유기체 중 하나를 기르기 위한 프로토콜이 설명됩니다.
지구상에 존재하는 대부분의 동물은 곤충2의 4개의 초방사선에 의해 설명된다. 곤충 내에는 약 158,000 종의 Diptera(참파리)3가 있으며, 약 3000 종은 Sciaridae (검은 곰팡이 모기)과에 속합니다4. 초파리(Drosophila)는 딥테란 파리 중에서 가장 철저하게 연구된 파리이다. 하부 디프테란 파리(Nematocera), 브라디시아(이전에는 Sciara라고 불렸음) 코프로필라(coprophila)는 2억 년 전에 "고등 디프테란" 파리(Brachycera)인 초파리(Drosophila)에서 갈라져 나왔다. 따라서 B. coprophila는 D. melanogaster와의 비교 연구에 유리한 분류학적 위치에 있습니다(그림 1). 더욱이, B. coprophila는 그 자체로 연구할 가치가 있는 많은 독특한 생물학적 특징을 가지고 있습니다 5,6,7. 이러한 특징 중 다수는 유기체의 모든 세포가 동일한 DNA 함량을 갖는 DNA 불변성의 규칙을 따르지 않습니다. B. coprophila에서, (i) 부계 게놈은 남성 감수분열 I의 단극 방추체에서 제거됩니다. (ii) 남성 감수분열 II에서 X 다이아드의 비분리가 있습니다. (iii) 생식계통 제한(L) 염색체가 소마에서 제거됩니다. (iv) 개인의 성별에 따라 초기 배아에서 하나 또는 두 개의 X 염색체가 제거됩니다. 모계 상동체와 부계 상동체를 구별하기 위한 염색체 각인은 B. coprophila에서 처음 발견되었으며 이러한 염색체 제거 사건의 많은 부분에 작용합니다. 염색체 제거 외에도 DNA 불변성의 또 다른 우회는 유충 타액선 폴리텐 염색체의 DNA 퍼프 유전자좌에서 발달적으로 조절되는 유전자좌 특이적 DNA 증폭을 통해 발생합니다. 이러한 독특한 특징에 대한 연구는 B.coprophila의 실험실 유지 보수를 필요로합니다. 그러한 연구를 용이하게하기 위해 축산에 대한 세부 사항이 여기에 제시되어 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg"> 그림 1 : Bradysia (Sciara) coprophila의 계통 발생. 인기 있는 모델 유기체는 파란색 글꼴로 표시되고 분류 순서는 빨간색 글꼴로 표시됩니다. Bradysia와 다른 Sciarid 곰팡이 모기뿐만 아니라 모기는 lower dipteran flies (이전에는 Nematocera의 하위 목)인 반면, Drosophila 종은 높은 dipteran 파리 (하위 주문 : Brachysera)입니다. 그림 왼쪽의 정보는 Misof et al.33에서 발췌한 것입니다. 오른쪽 정보는 Bertone et al.34 및 Wiegmann et al.2에서 발췌한 것입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
이전에는 Sciara 속이 진핵 생물에 대해 가장 많은 종 (700 종)을 가지고 있었기 때문에 Steffan은이를8로 세분화했습니다. 그 후, Shin은 Sciaridae 과를 Sciarinae (Sciara, Trichosia, Leptosciarella를 포함한 6 개 속), Megalosphyinae (Bradysia 속 포함) 및 Pseudolycoriella 포함한 3 개의 다른 그룹으로 세분화 할 것을 제안했습니다 9. Sciaridae의 계통 발생은 최근 몇 년 동안 여러 그룹에 의해 더 연구되었습니다 9,10,11. 지난 수십 년 동안 Sciaridae 계통의 많은 유기체의 이름이변경되었습니다 12. 100년 이상에 걸친 대부분의 문헌에서는 우리가 연구하는 유기체를 Sciara coprophila라고 언급하고 있지만, 현재의 분류학적 이름은 현재 Bradysia coprophila(동의어 Bradysia tilicola 및 기타 동의어)입니다.10 그들은 전 세계적으로 발견되며 버섯과 다른 곰팡이를 먹기 때문에 일반적으로 곰팡이 모기로 알려져 있습니다. 그들은 1804 년 유럽의 Meigen13에 의해 처음 기술되었으며 그 후 북미의 Johannsen 14,15에 의해 기술되었습니다. B. coprophila는 Cold Spring Harbor Laboratory에서 수집되었으며 실험실 재고는 1900 년대 초 Charles Metz가 Thomas Hunt Morgan과 함께 Columbia University의 대학원생이었을 때 설립되었습니다. 따라서 현재의 주식은 한 세기에 걸친 근친 교배를 반영합니다. 마찬가지로, B. coprophila의 생물학은 Helen Crouse (Barbara McClintock과 함께 박사 학위를 받았음)에 의한 수십 년간의 세포 유전학 연구에 의해 더욱 명확해졌습니다.
1930년대에 Bradysia(Sciara)는 유전자 연구를 위한 모델 시스템으로 Drosophila melanogaster와 경쟁했습니다. 많은 독특한 생물학적 특징에도 불구하고 B. coprophila는 방사선 유도 표현형 돌연변이가 유전 연구에 필요하고 B. coprophila가 D. melanogaster16보다 감마 조사에 약간 더 저항력이 있음에도 불구하고 방사선 유도 표현형 돌연변이가 유전 연구에 필요하고 후자에서 달성하기가 더 쉬웠기 때문에 인기 있는 모델 유기체로 D. melanogaster에 의해 가려졌습니다. 현대 유전체학 시대에 이것은 더 이상 문제가 되지 않습니다. B. coprophila에 대한 게놈 염기서열 17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) 및 Method for transformation 20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown)이 최근에 사용 가능해졌기 때문에, 연구를 위해 이를 채택한 과학자 커뮤니티가 이를 새롭게 활용할 수 있는 시기가 무르익었습니다. 이 문서에서는 실험실 유지 관리 절차에 대해 설명합니다.
B. coprophila는 Y 염색체가 없으며 자손의 성별은 어머니에 의해 결정됩니다. 긴 paracentric inversion을 가진 X'("X-prime") 염색체를 가진 여성은 딸만 낳는 반면, 표준(비반전) X 염색체에 대해 동형접합성인여성은 아들만 낳습니다5(그림 2). X' 염색체19에 대한 염기서열 정보는 사용할 수 있지만, X' 염색체가 자손이 여성이 될 것이라는 것을 어떻게 결정하는지에 대한 분자 메커니즘은 아직 밝혀지지 않았습니다. 남성은 X' 염색체를 가지고 있지 않으며, 수정 후 여성은 X'X(X'의 이형접합) 또는 XX입니다. 성체 X'X 암컷은 날개의 표현형 마커로 XX 암컷과 구별할 수 있습니다(그림 3). X'X 암컷(딸만 낳을 예정)은 X'(HoLo2 스톡에서와 같이)22의 지배적인 물결 모양(W) 날개 마커로 인식할 수 있습니다. 대안적으로, XX 암컷 (아들 만 낳을 예정)은 91S 스톡23에서와 같이 X의 열성 몸집이 작은 (p) 날개 마커로 인식 할 수 있습니다. 이 경우 X'Xp 암컷은 전신(몸집이 아님) 날개를 가지며 딸만 낳습니다. 스톡 6980은 부풀어 오른 (sw) 정맥24에 대한 X 염색체에 열성 마커와 X'의 우성 마커 Wavy를 운반하여 교배에 대한 선택을위한 두 개의 마커를 허용합니다. Wavy의 발현 정도는 다양할 수 있으며 음식이 제한적이거나 온도가 너무 뜨거워지는 과밀한 바이알에서 더 약해 보입니다. 물결 모양의 날개 표현형은 유충이 일반적인 21 °C 대신 추운 방 (4 ° -8 ° C)에 보관되는 경우 매우 강합니다. 열성 쁘띠 윙 마커는 가변적이지 않고 식별하기가 매우 쉽지만 91S 스톡은 HoLo2 스톡보다 건강하지 않기 때문에 덜 자주 사용됩니다. B. coprophila 짝짓기 계획이 여기에 제시되어 있으며(그림 2), HoLo2, 7298 및 W14 스톡(보충 파일 1), 91S 스톡(보충 파일 1), 6980 스톡(보충 파일 1) 및 전좌 스톡(보충 파일 1)에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 전좌 주식은 더 이상 존재하지 않습니다. 그들은 리보솜 RNA 유전자25,26,27을 포함하는 X의 짧은 팔에서 이종 염색체 (H1, H2 및 H3)의 상호 전위였습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg"> 그림 2: B. coprophila의 짝짓기 계획. 이 유기체는 Y 염색체가 없습니다 (남성 소마는 단일 X를 가지고 있습니다). 어머니는 자식의 성별을 결정한다. XX 어머니는 아들만 있고 X'X 여자는 딸만 있습니다. X '염색체는 X 염색체와 비교할 때 긴 paracentric inversion을 가지고 있습니다. X(또는 X') 염색체의 부계 또는 모계 혈통은 이 그림에서 각각 파란색 또는 빨간색으로 표시됩니다. 정자는 상염색체에 대해 반수체이지만 감수분열 II의 비분리로 인해 X 염색체의 사본이 두 개 있습니다. 초기 배아의 체세포 계통은 각각 여성 또는 남성인 경우 부계에서 파생된 X의 하나 또는 두 개의 복사본을 제거합니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg"> 그림 3: B. coprophila의 날개 표현형. 성충 암컷 파리는 다양한 날개 표현형을 보인다: (A) 직선 날개(XX), (B) 물결 날개(X'WX), (C) 차가운 루 m에 유충을 저장한 후 쭈글쭈글한 모양을 가진 극단적인 물결 날개(X'WX) 표현형, (D) 흔적 같은 작은 날개(XpXp), (E) 야생형(XX)이 있고 정맥이 부풀어 오르지 않은 직선 날개, (F) 날개의 위쪽 가장자리 및/또는 양쪽 날개 끝 부분에 작은 기포(검은색 화살표)가 나타나는 부풀어 오른 정맥이 있는 직선 날개(XswXsw), (G) 한쪽 또는 양쪽 날개에 물집(흰색 화살표)이 발생하는 부종의 극단적인 예. 수컷은 X 염색체가 없기 때문에 물결 모양의 날개를 가질 수 없지만 91S 스톡 또는 6980 스톡에서 각각 몸집이 작거나 부풀어 오른 날개를 가지고 있습니다. 축척 막대 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
재고 관리의 목표는 교배종의 절반이 암컷을 생산하는 어머니로부터, 나머지 절반이 수컷을 생산하는 어머니의 교배종인 교배를 수행하여 다음 세대에 후속 교배를 위해 동일한 수의 여성과 남성 성인을 갖도록 하는 것입니다. 그러나 수컷의 수명주기가 암컷보다 짧고 성인 남성이 성인 암컷보다 최대 일주일 먼저 출현하기 때문에 계획도 필요합니다. 자연은 같은 날짜에 교배에서 암컷 유충보다 1-2 일 후에 수컷 배아가 유충으로 출현함으로써 남녀 간의 이러한 비동시성을 수용합니다. 그러나 수컷과 암컷 성체가 동시에 실험실 교배를 할 수 있도록 하기 위해 암컷 유충이 든 바이알을 21°C가 아닌 실온에 두거나 약간 더 낮은 온도(예: 16°C)에서 수컷 유충이 든 바이알을 배치함으로써 암컷 발달을 다소 가속화할 수 있습니다. 더 확실한 또 다른 방법은 월요일에 여성 생산자 어머니와 십자가를 하고, 같은 주 금요일에 남성 생산자 어머니와 십자가를 건너는 것입니다. 우리가 사용하는 가장 쉬운 방법은 매주 같은 날에 여성 프로듀서 및 남성 프로듀서 엄마와 함께 십자가를 공연하고 매주 연속으로 그 날에 십자가를 공연하는 것입니다. 이 접근법에서, 1주차에 교배된 성체 암컷은 2주차에 교배에서 나온 성체 남성과 교배할 수 있습니다.
암컷 B. coprophila 의 수명주기는 21 ° C에서 올릴 때 5 주입니다 (표 1). 수명주기의 길이는 더 서늘한 온도에서 또는 영양이 부족한 경우 다소 길어집니다. 수컷 B. coprophila 의 수명주기는 암컷보다 0.5-1 주 전에 번데기가 되기 때문에 ~ 4-4.5 주입니다. 각 유충 instar의 끝은 스테로이드 호르몬 ecdysone 수준의 파열에 의해 유발되는 큐티클의 탈락으로 표시됩니다. 3개의 유충 인스타가 있는 D. melanogaster 와 달리 B. coprophila 는 4개의 유충 인스타를 가지고 있습니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>발달 단계</td>
			<td>결합 후 일수(dpm)</td>
			<td>스테이지 길이(일)</td>
		</tr><tr><td>낳은 알</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>배</td>
			<td>1-2에서 7-8</td>
			<td>~7일</td>
		</tr><tr><td>유충</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>애벌레는 1, 2, 3을 인스타합니다.</td>
			<td>7-8에서 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr><tr><td>4번째 애벌레 인스타 프리아이스팟</td>
			<td>16-19에서 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>4번째 애벌레 인스타 아이스팟 스테이지</td>
			<td>21-24에서 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td>번데기</td>
			<td>25-28에서 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>성인</td>
			<td colspan="2">짝짓기를 한 경우 21 °C에서 1-2 일 동안 살거나 짝짓기를 하지 않으면 16 °C에서 2-3 주 동안 산다.</td>
		</tr></tbody></table>표 1: 21°C에서 암컷 B. coprophila 의 수명주기.
B. coprophila 는 15 °C-25 °C 범위의 어느 곳에서나 보관할 수 있으며 더 낮은 온도에서 발달이 더 천천히 진행됩니다. 이 곤충은 습한 환경(관엽 식물이나 버섯 침대의 토양에서 발견됨)을 선호하므로 인큐베이터에 탈이온수가 담긴 비커를 보관합니다. B. coprophila 는 뚜껑이 헐렁하고 물 비커가 들어있는 금속 빵 상자에 넣어 실온에서 보관 할 수 있지만 더운 기후에서는 위험 한 37 ° C28에서 열 충격을받습니다. 마이클 애쉬버너(Michael Ashburner)와 다른 연구자들은 D. 멜라노가스터를 추위에 보관하여 재고 보관에 필요한 시간을 줄이려고 노력하였으나 거의 성공하지 못하였다. 대조적으로, B. coprophila 의 주요 장점은 중간 단계 유충이 있는 바이알을 한 달에 한 번만 먹이는 최소한의 관리로 냉장실(4-8 °C)의 개방형 선반에 최대 3개월 동안 보관할 수 있다는 것입니다. 그들은 번데기 단계까지 추위에서 매우 천천히 발달하며 바이알을 21 °C로 되돌릴 때 가임기 가능한 성인으로 나타납니다. 아마도 이것은 그들이 야생에서 월동하는 것을 모방한 것일 것입니다. 이러한 추위에 의한 발달 지연은 중간 단계의 B. coprophila 유충16에 감마선을 조사한 후 관찰된 것과 비슷할 수 있지만, 정상적인 발달 진행에 대한 돌이킬 수 없는 지점을 지난 후기 단계 유충에서는 발달 지연이 나타나지 않습니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agar (bacteriological)</td>
			<td>U.S. Biological</td>
			<td>A0930</td>
			<td>https://www.usbio.net;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Foot Pedal</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff Blowgun</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>54-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 FlyStuff UltimaterFlypad</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>59-172</td>
			<td>https://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ether fume hood</td>
			<td>Labconco&#160;</td>
			<td>3955220</td>
			<td>Sits on top of lab bench</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Filter replacement&#160; cat # 6961300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Brewer&#8217;s Yeast Powder</td>
			<td>Solgar</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>Obtain from Amazon or health food store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>&#160; &#160;</td>
			<td>https://www.solgar.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Nettle Powder&#160; (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209460-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Shitake Mushrooms (pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>202127-5</td>
			<td>https://www.starwest-botanicals.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Spinach Powder ( pesticide free)</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209583-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Food: Straw (pesticide free )</td>
			<td>Starwest Botanicals</td>
			<td>209465-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jar: clear glass, polypropylene lid</td>
			<td>Fisher Scientific:</td>
			<td>FB02911765</td>
			<td>73 mm dia, 89 mm ht (240 ml) 
			https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle Probe, wooden handle</td>
			<td>US Geo Supply Inc</td>
			<td>SKU: 4190</td>
			<td>5.75&#8221; long probe, 
			stainless steel needle 
			https://usgeosupply.com; (970)-434-3708</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass, preferred:</td>
			<td>Wilmad LabGlass</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wilmad-glass custom vials</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>28-33 mm inner dia, 33 mm outer dia, 9.5 cm ht 
			Wilmad: https://www.SP-WilmadLabglass.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (cheaper and ok)&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-339-26H</td>
			<td>29 mm outer dia, 9.5 cm h 
			&#160;https://www.fishersci.com;&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: glass (a bit narrow)&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific&#160;</td>
			<td>32-201</td>
			<td>24.5 mm outer dia,9.5 cm h 
			thttps://www.geneseesci.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vials: polypropylene&#160;</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-114</td>
			<td>28.5 mm outer dia,9.5 cm ht</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vial Plugs</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>roll of non-absorbent cotton</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-456881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cheesecloth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-055053</td>
			<td>https://www.fishersci.com;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laboratory maintenance of the lower dipteran fly bradysia (sciara) coprophila: a new/old emerging model organism

하부 dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila 의 실험실 재고는 100 년 이상 유지되어 왔습니다. B. coprophila 의 실험실 유지를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다. 이러한 프로토콜은 B. coprophila 를 연구하는 실험실의 수가 급증하면서 (1) 남성 감수분열 I의 단극 방추체를 포함하는 독특한 생물학적 특징을 활용하는 데 유용할 것입니다. (2) 남성 감수분열 II에서 X dyad의 비분리; (3) 모계 상동체와 부계 상동체를 구별하기 위한 염색체 각인; (4) 생식계통 제한(L) 염색체; (5) 염색체 제거 (남성 감수분열 I에서 부계 염색체; 초기 배아에서 1-2 개의 X 염색체; 초기 배아의 소마(soma)에서 L 염색체); (6) 어머니에 의한 성별 결정(Y 염색체가 없음); (7) 유충 타액선 폴리텐 염색체의 DNA 퍼프 자리에서 발달적으로 조절된 DNA 증폭. 
이제 B. coprophila 게놈의 염기서열 분석 및 조립의 최근 발전과 게놈 공학을 위한 형질전환 방법론 개발을 사용하여 염색체 역학의 이러한 많은 고유한 특징을 탐구할 수 있습니다. 연구를 위해 B. coprophila 를 사용하는 성장하는 과학계는 여기에 설명된 파리의 짝짓기 프로토콜(아들 또는 딸만 가질 어머니를 위한 표현형 마커, 생화학 실험을 위한 대량 짝짓기에 대한 세부 정보), 배아 부화 확인, 유충 먹이 및 사육에 대한 기타 설명의 이점을 얻을 수 있습니다.

A complete understanding of biological principles requires the study of many diverse organisms spanning the Tree of Life. Although a broad range of organisms were described through the end of the 19th century, by the middle of the 20th century experimental studies became restricted to a handful of less than a dozen model organisms. With the advent of the genomic era and the goal to sequence genomes from all species in the Tree of Life1, we are now in a position to expand the types of organisms being used for laboratory experiments and to reap the advantage of their diversity. Such expansion of emerging model organisms for experiments has a prerequisite of being able to maintain them in the laboratory. Here, protocols are described for rearing one such emerging new/old model organism.
The majority of animal life on Earth is accounted for by four super-radiations of Insects2. Within the Insects, there are about 158,000 species of Diptera (true flies)3, with about 3000 species in the family Sciaridae (black fungus gnats)4. The fruitfly Drosophila is the most thoroughly studied of the Dipteran flies. The lower Dipteran fly (Nematocera), Bradysia (previously called Sciara) coprophila, diverged 200 million years ago from Drosophila, which is a &#34;higher Dipteran&#34; fly (Brachycera). Therefore, B. coprophila is in a favorable taxonomic position for comparative studies with D. melanogaster (Figure 1). Moreover, B. coprophila has many unique biological features that are worthy of study in their own right5,6,7. Many of these features disobey the rule of DNA constancy in which all cells of an organism have the same DNA content. In B. coprophila, (i) the paternal genome is eliminated on a monopolar spindle in male meiosis I; (ii) there is non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (iii) germ line-limited (L) chromosomes are eliminated from the soma; and (iv) one or two X chromosomes are eliminated in the early embryo depending on the sex of the individual. Chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs was first discovered in B. coprophila and is at play for many of these chromosome elimination events. In addition to chromosome elimination, another bypass of DNA constancy occurs via developmentally regulated, locus-specific DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. Studies of these unique features require laboratory maintenance of B.coprophila; details of its husbandry are presented here to facilitate such studies.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig01v3.jpg" /> 
Figure 1: Phylogeny of Bradysia (Sciara) coprophila. Popular model organisms are indicated in blue font and their taxonomic order in red font. Bradysia and other Sciarid fungus gnats as well as mosquitoes are lower dipteran flies (formerly, suborder Nematocera), whereas Drosophila species are higher dipteran flies (suborder: Brachysera). Information on the left side of the figure is from Misof et al.33; information on the right side is from Bertone et al.34 and Wiegmann et al.2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig01large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
Previously, the genus Sciara had the largest number (700) of species for any eukaryote, prompting Steffan to subdivide them8. Subsequently, Shin proposed that the Sciaridae family be subdivided into the subfamily Sciarinae (with six genera including Sciara, Trichosia, and Leptosciarella), the subfamiliy Megalosphyinae (including the genus Bradysia) and three other groups (including Pseudolycoriella)9. The phylogeny of the Sciaridae has been studied further by several groups in recent years9,10,11. Over the past several decades, the names of many organisms in the Sciaridae family have changed12. Although most of the literature spanning more than a century refers to the organism that we study as Sciara coprophila, its current taxonomic name is now Bradysia coprophila (syn. Bradysia tilicola and other synonyms)10. They are found worldwide and are commonly known as fungus gnats since they eat mushrooms and other fungi. They were first described in 1804 by Meigen13 in Europe and subsequently by Johannsen14,15 in North America. B. coprophila was collected at Cold Spring Harbor Laboratory and laboratory stocks were established by Charles Metz in the early 1900s when he was a graduate student at Columbia University with Thomas Hunt Morgan. Thus, the current stocks reflect a century of inbreeding. Similarly, the biology of B. coprophila was further elucidated by decades of cytogenetic studies by Helen Crouse (who did her Ph.D. work with Barbara McClintock).
In the 1930s, Bradysia (Sciara) competed with Drosophila melanogaster as a model system for genetic studies. Despite its many unique biological features, B. coprophila was eclipsed by D. melanogaster as a popular model organism since radiation-induced phenotypic mutations were needed for genetic studies and were easier to achieve in the latter, even though B. coprophila is only slightly more resistant to gamma irradiation than D. melanogaster16. In the modern era of genomics, this is no longer a concern. Since the genome sequence17,18,19 (Urban, Gerbi, and Spradling, data not shown) and methods for transformation20,21 (Yamamoto and Gerbi, data not shown) for B. coprophila have recently become available, the time is now ripe to utilize it as a new/old emerging model system, as seen by the growing community of scientists that have adopted it for their research. This article describes procedures for its laboratory maintenance.
B. coprophila lacks a Y chromosome, and the sex of the offspring is determined by the mother. Females that have the X&#39; (&#34;X-prime&#34;) chromosome with a long paracentric inversion will have only daughters, whereas females that are homozygous for the standard (non-inverted) X chromosome will have only sons5 (Figure 2). Sequence information is available for the X&#39; chromosome19, but the molecular mechanism remains to be elucidated on how the X&#39; chromosome determines that offspring will be females. Males never have the X&#39; chromosome, and after fertilization, females are X&#39;X (heterozygous for the X&#39;) or XX. Adult X&#39;X females can be distinguished from XX females by phenotypic markers on the wing (Figure 3). X&#39;X females (who will have only daughters) can be recognized by the dominant Wavy (W) wing marker on the X&#39; (as in the HoLo2 stock)22. Alternatively, XX females (who will have only sons) can be recognized by the recessive petite (p) wing marker on the X as in the 91S stock23. In this case, X&#39;Xp females will have full-length (not petite) wings and will have only daughters. The stock 6980 carries a recessive marker on the X chromosome for swollen (sw) veins24, as well as the dominant marker Wavy on the X&#39;, allowing two markers for selection for crosses. The degree of expression of Wavy can vary and seems weaker in overcrowded vials where food is limiting or if the temperature becomes too warm. The Wavy wing phenotype is exceptionally strong if larvae are kept in the cold room (4&#176;-8 &#176;C) instead of the usual 21 &#176;C. Although the recessive petite wing marker is not variable and is very easy to identify, 91S stocks are used less frequently since they are less healthy than the HoLo2 stock. The B. coprophila mating schemes are presented here (Figure 2), and described in detail for the HoLo2, 7298, and W14 stocks (Supplemental File 1), the 91S stock (Supplemental File 1), the 6980 stock (Supplemental File 1), and the translocation stocks (Supplemental File 1). The translocation stocks are no longer extant; they were reciprocal translocations of heterochromomeres (H1, H2, and H3) on the short arm of the X that contains the ribosomal RNA genes25,26,27.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig02.jpg" /> 
Figure 2: Mating scheme for B. coprophila. This organism has no Y chromosome (the male soma has a single X); mothers determine the sex of their offspring. XX mothers have only sons and X&#39;X females have only daughters. The X&#39; chromosome has a long paracentric inversion when compared to the X chromosome. The paternal or maternal lineage of the X (or X&#39;) chromosome is denoted by blue or red, respectively, in this figure. Sperm are haploid for the autosomes but have two copies of the X chromosome due to non-disjunction in meiosis II. The somatic lineage of early embryos eliminates one or two copies of the paternally derived X if they will be female or male, respectively. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig02large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig03.jpg" /> 
Figure 3: Wing phenotypes of B. coprophila. Adult female flies are shown with various wing phenotypes: (A) straight-wing (XX), (B) Wavy wing (X&#39;WX), (C) extreme Wavy wing (X&#39;WX) phenotype that has a shriveled appearance after storing larvae in the cold room, (D) petite wing (XpXp) that is vestigial-like, (E) straight wing with wildtype (XX) and not swollen veins, (F) straight wing with swollen veins (XswXsw) where small bubbles (black arrows) appear on the upper edge of the wing and/or near the tip of both wings, (G) extreme example of swollen where a blister (white arrow) occurs on one or both wings. Males lack the X&#39; chromosome and therefore will never have Wavy wings, but they have petite or swollen wings in the 91S stock or 6980 stock, respectively. Scale bar = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig03large.jpg" target="_blank">Please click here to view a larger version of this figure.</a>
The goal in stock maintenance is to perform crosses where half the crosses are from female-producing mothers and half the crosses from male-producing mothers to have equal numbers of female and male adults in the next generation for subsequent crosses. However, this also involves planning since the life cycle for males is shorter than for females and adult males emerge up to a week before adult females. Nature accommodates for this asynchrony between the sexes by having the male embryos emerge as larvae 1-2 days after the female larvae from a cross on the same date. However, to ensure that male and female adults are available at the same time for laboratory crosses, female development can be somewhat speeded up by leaving vials with female larvae at room temperature rather than at 21 &#176;C or placing vials with male larvae at slightly cooler temperatures (e.g., 16 &#176;C). Another route that is more foolproof is to do crosses with female-producer mothers on Monday and crosses with male-producer mothers on Friday of the same week. The easiest route, which is what we employ, is to perform crosses with female-producer and male-producer mothers on the same day each week and perform crosses on that day in each consecutive week. In that approach, adult females from a cross on week 1 can be mated with adult males that emerged from a cross on week 2.
The life cycle for female B. coprophila is 5 weeks when raised at 21 &#176;C (Table 1). The length of their life cycle is somewhat longer at cooler temperatures or if they are underfed. The life cycle of male B. coprophila is ~4-4.5 weeks since they pupate 0.5-1 week before females. The end of each larval instar is marked by the shedding of the cuticle, which is triggered by a burst in the level of the steroid hormone ecdysone. Unlike D. melanogaster, which has three larval instars, B. coprophila has four larval instars.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Developmental Stage</td>
			<td>Days post mating (dpm)</td>
			<td>Length of stage (days)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg laid</td>
			<td>1-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Embryo</td>
			<td>1-2 to 7-8</td>
			<td>~7 days</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larva&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval instars 1, 2, and 3</td>
			<td>7-8 to 16-19</td>
			<td>~10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar pre-eyespot</td>
			<td>16-19 to 21-24</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4th larval instar eye-spot stage</td>
			<td>21-24 to 25-28</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pupa&#160;</td>
			<td>25-28 to 30-33</td>
			<td>5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult</td>
			<td colspan="2">lives 1-2 days at 21 &#176;C if mated or lives 2-3 weeks at 16 &#176;C if not mated.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1: Life cycle of female B. coprophila at 21 &#176;C.
B. coprophila can be kept anywhere in the range of 15 &#176;C-25 &#176;C, with development progressing more slowly at cooler temperatures. This insect prefers a humid environment (being found in the soil of houseplants or mushroom beds), so we keep a beaker with deionized water in the incubator. B. coprophila can be kept at room temperature in a metal bread box with a loosely fitting lid and containing a beaker of water, but they go into heat shock at 37 &#176;C28, which is a danger in hot climates. Michael Ashburner and others have tried with little success to store D. melanogaster in the cold to reduce the time needed for stockkeeping. In contrast, a major advantage of B. coprophila is that vials with mid-stage larvae can be stored for up to 3 months on an open shelf in the cold room (4-8 &#176;C) with minimal care of only feeding once a month. They develop extremely slowly in the cold up to the pupal stage and will emerge as fertile adults when the vials are brought back to 21 &#176;C. Presumably, this mimics their overwintering in the wild. This cold-induced developmental stalling might be comparable to that seen after gamma irradiation of mid-stage B. coprophila larvae16, but developmental stalling is not seen in late-stage larvae that have passed the point of no return for their normal developmental progression.

Author Spotlight: Exploring &lt;i&gt;Bradysia coprophila&#039;s&lt;/i&gt; Unique Biology &amp;#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila의 실험실 유지 보수 : 새로운 / 오래된 신흥 모델 유기체

여기에 설명된 프로토콜은 B. coprophila를 키우는 데 성공한 것으로 입증되었습니다. 최근에 멸종된 뚱뚱한 성체를 짝짓기를 위해 선택하면(그림 4), 교배종의 90% 이상이 번식력이 있고 자손을 낳을 수 있습니다. 임신 성공률은 주식에 따라 다릅니다(표 2). 주식 7298 (물결 모양의 마커가 있는 X' 염색체)은 가장 건강한 주식이었지만 게놈 재배열을 생성하는 DNA 이동 요소의 활성화로 인해 감소기를 겪었다32. HoLo2 스톡은 7298에서 파생된 건강한 균주를 나타내며, 게놈 재배열이 안정화된 것으로 보이며, 스톡 센터의 부모 7298 스톡을 대체했습니다. HoLo2 스톡은 B. coprophila 게놈의 염기서열을 분석하는 데 사용된 스톡이며 다양한 실험실 그룹에서 가장 널리 사용되는 스톡입니다. 최근에는 HoLo2 파리의 CRISPR 돌연변이 유발을 사용하여 형광 눈 마커와의 형질전환에 사용할 백색 눈 표현형을 가진 W14 스톡을 생성했습니다(Yamamoto 및 Gerbi, 데이터는 표시되지 않음). W14 균주는 매우 견고합니다. 6980 스톡(물결 모양의 날개 및 부풀어 오른 정맥 마커)은 다소 덜 견고하고 91S 스톡(작은 날개 마커)은 훨씬 덜 견고합니다.
성공적인 교배는 배아를 낳습니다(그림 5). 배아는 7번째에서 9번째 분열 분열에서 각인된 부계 X 염색체의 제거를 겪습니다. 또한, 생식계통 제한 L 염색체는 5번째에서 6번째 분열 분열에서 배아의 체세포 계통에서 제거됩니다. 배아는 유충으로 나타나며, 이는 존재할 수 있는 곰팡이와 혼동되어서는 안 됩니다(그림 6). 안점(성인 눈에 대한 반점)은 4번째 유충 인스타의 후반부에 나타납니다(그림 7). 안점의 크기는 DNA 퍼프 증폭의 시작 및 진행을 위한 편리한 표현형 마커를 제공하며, 이는 자연적으로 발생하는 발달 조절 부위 특이적 염색체 내 DNA(유전자) 증폭의 알려진 두 가지 예 중 하나입니다. 그 후, 번데기가 발달하고 번데기의 눈을 채우는 색소의 양은 정자 형성에서 감수분열 I 및 II에 대한 발달 표지자로 작용할 수 있으며(그림 8) 이러한 분열에서 독특한 염색체 행동을 보입니다.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig04.jpg"> 그림 4: 성체 B. coprophila 파리의 짝짓기. 상단 패널은 HoLo2 스톡에 있는 세 가지 유형의 성체 파리, 즉 물결 모양의 날개를 가진 암컷 생산 어미(X'WX 성체 암컷), 곧은 날개를 가진 수컷 생산 어미(XX 성체 암컷), 곧은 날개를 가진 수컷(X0 성체 수컷)을 보여줍니다. 암컷 파리의 뒤쪽 끝에 있는 뾰족한 산란관과 수컷 파리의 뒤쪽 끝에 있는 갈고리 모양의 걸쇠에 유의하십시오. 아래쪽 패널은 수컷과 암컷의 짝짓기를 보여주며, 수컷 걸쇠가 암컷의 산란관을 움켜쥔 것입니다. 정자는 암컷의 정자에 저장되고 난자가 외부로 배출될 때 수정됩니다. 성인의 길이는 2.0mm(수컷), 2.5mm(암컷)입니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig05v2.jpg"> 그림 5: B. 코프로필라 배아(B. coprophila embryos). 왼쪽 상단 패널은 해부 현미경에서 표준 빛을 사용하는 배아의 모습입니다. 세포융합 세포질의 핵은 검은 점으로 나타납니다. 오른쪽 패널은 형광 현미경을 사용하여 배아의 프로피듐 요오드화물 염색 핵을 시각화합니다. 배아의 평균 길이는 200미크론이고 평균 너비는 150미크론입니다. 생식 세포의 핵은 사이클 6 (배아가 앞으로 기울어짐) 및 7-9에서 볼 수 있듯이 배아의 후극에 모여 있으며, 그 후에는 체세포핵이 산재 해 있습니다. 체세포 계통에서 L 염색체 제거는 분열 분열 5 또는 6에서 발생합니다. 체세포 계통에서 X 염색체 제거는 7번째, 8번째 또는 9번째 분열 분열에서 발생합니다. 셀룰라화는 사이클 11의 간기 동안 발생합니다. 왼쪽 표는 22°C에서 각 분할 주기의 평균 시간을 보여줍니다. 왼쪽 테이블과 오른쪽 패널은 de Saint Phalle과 Sullivan35의 허가를 받아 개조되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig06.jpg"> 그림 6: B. coprophila 배아가 유충으로 출현합니다. 알을 낳은 후 사망한 성인 암컷의 산란관 근처에서 배아 군집(파란색, 두꺼운 화살표)이 보입니다. 알을 낳은 지 일주일 후, 배아는 어린 유충이되며, 그 중 일부는 검은 화살표로 표시됩니다. 새로 나온 유충은 앞쪽 끝에 검은 턱과 반투명한 몸체를 가지고 있습니다. 그들은 한천 표면 위에서 움직이며 움직이지 않는 곰팡이와 혼동해서는 안됩니다. 삽입물에는 흰색 필라멘트(빨간색 화살표)와 끝에 검은색 포자(녹색 화살표)가 있는 곰팡이가 있으며 새로 나온 유충보다 약간 작습니다. 축척 막대 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig06large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig07.jpg"> 그림 7: B. coprophila 유충의 안점 단계. 눈반점은 턱 바로 뒤의 유충 앞쪽에 형성되며 수가 증가하는 색소 과립으로 구성됩니다. 안점은 성인의 눈에 대한 항문입니다. 상단 패널은 해부 현미경으로 시각화된 유충을 보여줍니다. 하단 패널은 위상차 현미경을 사용하여 증류수 한 방울과 위에 가볍게 떠 있는 커버슬립으로 현미경 슬라이드에 유충을 시각화한 안점을 확대한 것입니다. 안점 단계의 명명법은 Gabrusewycz-Garcia30 에 따르며, 여기서 과립의 수는 가장 긴 행(예: 12)에서 계산되고 가장 긴 행을 제외한 추가 행의 수가 표시됩니다(예: 안점 단계 12x6의 경우 6). 타액선 폴리텐 염색체에서 부위 특이적 DNA 증폭의 시작은 안점 단계 10x5에서 시작하여 유전자좌에서 전사의 폭발과 DNA 퍼프의 확장이 있을 때 14x7에서 완료됩니다(31). 후속 가장자리 눈/드롭 턱 단계에서 안점 과립이 합쳐지기 시작하고 정중선에서 측면으로 멀어집니다. 유충 몸체의 길이가 짧아집니다. 또한, 이 단계에서 DNA 퍼프가 응축됩니다. 21°C에서 각 안점 단계를 통과하는 데 약 하루가 걸립니다. 축척 막대 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig07large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66751/66751fig08.jpg"> 그림 8: B. coprophila pupae의 발달. 번데기가 생기는 동안, 신경계를 제외한 모든 유충 조직은 조직분해되고 상상 디스크의 세포 분열에 의해 발생하는 성체 조직으로 대체됩니다. 몸색은 흰색에서 황갈색으로, 갈색에서 검은색으로 바뀝니다. 색소는 점차적으로 번데기를 채웁니다. 감수분열 I과 II는 색소36으로 채워진 1/4에서 1/2의 눈을 가진 수컷 번데기에서 발생한다. 축척 막대 = 1mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/66751fig08large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>주식 이름</td>
			<td>마커</td>
			<td>출산율</td>
			<td>코멘트</td>
		</tr><tr><td>7298</td>
			<td>물결 모양(W) 날개</td>
			<td>~75%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>홀로2</td>
			<td>물결 모양(W) 날개</td>
			<td>~90%</td>
			<td>에서 파생 된 7298</td>
		</tr><tr><td>승14</td>
			<td>물결 모양(W) 날개; 하얀 눈</td>
			<td>~95%</td>
			<td>HoLo2에서 파생</td>
		</tr><tr><td>6980</td>
			<td>물결 모양(W) 날개; 부풀어 오른 (SW) 정맥</td>
			<td>~65%</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>91년대</td>
			<td>약한 물결 모양(W) 날개; 몸집이 작은 (P) 날개</td>
			<td>~50%</td>
			<td>Wavy 마커는 91S를 구출하기 위해 십자가에 도입되었습니다.</td>
		</tr></tbody></table>표 2 : Bradysia (Sciara) coprophila의 주식. Gerbi6의 표 1에는 이러한 마커와 더 이상 존재하지 않는 다른 마커가 나열되어 있습니다. X27의 중심 말단에 있는 5개의 전좌(T1, T23, T29, T32, T70)는 Gerbi6의 그림 8에 요약되어 있지만 더 이상 존재하지 않습니다.
보충 파일 1: HoLo2(및 7298 및 W14) 교차, 91S 교차 및 구조, 6980 교차, 전위 교차. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66751/Supplemental%20Materials.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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이 논문은 Lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila의 실험실 유지 관리 (짝짓기 및 먹이 포함)를 간략하게 설명합니다.

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. ...

우리는 감수 분열, 염색체 각인, 생식세포 특이적 염색체, 염색체 제거, 모계 성 결정 및 오염 염색체 DNA 퍼프에서의 DNA 증폭에서 단극 방추체 및 x-dyad 비 분리를 포함하는 독특한 생물학적 특성 중 일부를 연구하기 위해 Sciara coprophila로도 알려진 lower dipteran fly, Bradysia를 유지합니다. 우리 연구실에서는 유타카 야마모토(Yutaka Yamamoto)가 브라디시아 코프로필라(Bradysia coprophila)의 게놈 형질전환을 위한 방법론을 개발했습니다. 더욱이, 이 유기체의 전사체가 이용 가능하게 되었고, 그 게놈은 John Urban에 의해 시퀀싱되고 조립되었습니다.이러한 돌파구를 통해 Bradysia coprophila의 독특한 생물학을 탐구할 수 있습니다. Bradysia coprophila의 고유한 특성을 다루기 위해 성장하는 과학자 커뮤니티에 가입할 것을 권장합니다. 연구 결과는 세포 및 발달 생물학에 근본적으로 중요한 분자 메커니즘을 밝힐 것입니다.여기에 제시된 축산 프로토콜은 귀하의 실험실에서 Bradysia coprophila를 유지하기 위한 튜토리얼 역할을 할 것입니다.

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Research

JoVE Journal

Biology

Laboratory Maintenance of the Lower Dipteran Fly Bradysia (Sciara) coprophila: A New/Old Emerging Model Organism

577 조회수.  Brown University. 우리는 감수 분열, 염색체 각인, 생식세포 특이적 염색체, 염색체 제거, 모계 성 결정 및 오염 염색체 DNA 퍼프에서의 DNA 증폭에서 단극 방추체 및 x-dyad 비 분리를 포함하는 독특한 생물학적 특성 중 일부를 연구하기 위해 Sciara coprophila로도 알려진 lower dipteran fly, Bradysia를 유지합니다. 우리 연구실에서는 유타카 야마모토(Yutaka Yamamoto)가 브라디시아 코프로필라(Bradysia coprophila)의...

비디오: Author Spotlight: Exploring Bradysia coprophila's Unique Biology &#8211; A Guide to Laboratory Maintenance

Laboratory stocks of the lower dipteran fly, Bradysia (Sciara) coprophila, have been maintained for over a century. Protocols for laboratory upkeep of B. coprophila are presented here. These protocols will be useful for the rapidly increasing number of laboratories studying B. coprophila to take advantage of its unique biological features, which include (1) a monopolar spindle in male meiosis I; (2) non-disjunction of the X dyad in male meiosis II; (3) chromosome imprinting to distinguish maternal from paternal homologs; (4) germ line-limited (L) chromosomes; (5) chromosome elimination (paternal chromosomes in male meiosis I; one to two X chromosomes in early embryos; L chromosomes from the soma in early embryos); (6) sex determination by the mother (there is no Y chromosome); and (7) developmentally regulated DNA amplification at the DNA puff loci in larval salivary gland polytene chromosomes. 
It is now possible to explore these many unique features of chromosome mechanics by using the recent advances in sequencing and assembly of the B. coprophila genome and the development of transformation methodology for genomic engineering. The growing scientific community that uses B. coprophila for research will benefit from the protocols described here for mating the flies (phenotypic markers for mothers that will have only sons or only daughters; details of mass mating for biochemical experiments), checking embryo hatch, feeding larvae, and other comments on its rearing.

This paper outlines the laboratory maintenance (including mating and feeding) of the lower dipteran fly Bradysia (Sciara) coprophila.

연구

생물학

Maintenance and Rearing of Bradysia (Sciara) coprophila Larvae in a Laboratory Setup

To set up the mating crosses, place the Bradysia coprophila adult male flies on a white fly pad. Use fine tipped forceps to gently pick up the fattest adult by its middle or hind leg. Then place the anesthetized adult female flies on a white fly pad.Using fine tipped forceps, pick up an adult female by its hind leg. One day after mating, push the wings of the anesthetized adult females into 2.2%agar in a Petri plate. Once all the female flies are impaled on the agar, gently squeeze the thorax with forceps.The female will lay a cluster of fertilized eggs within 30 to 60 minutes. Use a dissecting microscope to score the newly emerged larvae. Observe the inch worm-like motion of the newly emerged larvae as they crawl on the surface of the 2.2%agar.After removing the vial plug, examine the vial for the age and number of larvae. Pick up some straw between the second and third fingers or between the thumb and second fingers, and rotate the fingers against each other to deposit the appropriate amount of straw into the vial. On the same day that the larvae emerged, or up to two days later, sprinkle in a tiny bit of food that has been poured into a small bowl for easier access, and replace the gauze plug.For one week old larvae, add more food to just cover the surface of the agar and replace the gauze plug. For the two week old larvae, sprinkle in a generous amount of food to cover the agar surface and replace the gauze plug. Once the larvae attain the late fourth instar stage and begin to pupate, add a generous amount of food on the agar surface.Stop feeding once adults begin to emerge. Do not feed vials with adult flies and do not remove the gauze plug. If there is white mold in the vial, use 70%ethanol on a laboratory wipe to clean a long metal probe.Insert the clean probe into the vial to tap down the mold on the surface of the agar. Then clean the probe with a laboratory wipe dampened with 70%ethanol before storing or using it on another vial. Add only a small amount of food without disturbing the top of the agar, and replace the plug.