Syntetazy aminoacylo-tRNA są obecne zarówno u eukariontów, jak i bakterii. Chociaż eukarionty mają 20 różnych syntetaz aminoacylo-tRNA, które łączą się z 20 aminokwasami, wiele bakterii nie ma genów dla wszystkich tych syntetaz aminoacylo-tRNA. Mimo to nadal używają wszystkich 20 aminokwasów do syntezy swoich białek. Na przykład niektóre bakterie nie mają genu kodującego enzym, który łączy glutaminę ze swoim partnerskim tRNA. W tych organizmach jeden enzym dodaje kwas glutaminowy do wszystkich cząsteczek tRNA kwasu glutaminowego, a także do wszystkich cząsteczek tRNA glutaminy. Następnie drugi enzym chemicznie modyfikuje kwas glutaminowy w glutaminę na ostatnich cząsteczkach tRNA, tworząc w ten sposób odpowiednią parę.

Równe znaczenie syntetazy tRNA i aminoacylo-tRNA ustalono w wyniku serii eksperymentów, w których jeden aminokwas został chemicznie przekształcony w inny aminokwas po przyłączeniu do sparowanego tRNA. W eksperymencie syntezy białek in vitro te "hybrydowe" cząsteczki aminoacylo-tRNA wprowadziły niewłaściwy aminokwas w każdym punkcie łańcucha peptydowego, w którym zastosowano ten tRNA. Wyniki pokazały, że zarówno tRNA, jak i enzym są w równym stopniu potrzebne do prawidłowej translacji sekwencji aminokwasów kodowanej przez mRNA.

W komórkach syntetazy aminoacylo-tRNA wykorzystują komplementarność strukturalną i chemiczną w celu zidentyfikowania prawidłowego tRNA, które musi być sprzężone z aminokwasem związanym w jego miejscu aktywnym. Większość syntetaz tRNA zawiera trzy sąsiednie kieszenie wiążące nukleotydy, z których każda ma kształt komplementarny i ładunek do nukleotydu w antykodonie. Podczas gdy te kieszenie rozpoznają specyficzne nukleotydy w pętli antykodonu tRNA, dodatkowe aminokwasy oddziałują z ramieniem akceptującym aminokwasy, umożliwiając w ten sposób prawidłowe tRNA dopasowanie się do miejsca syntezy enzymu.