In This Article

Summary

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Abstract

Oprócz tworzenia bariery o wysokim oporze, przypuszcza się, że naczyn dróg moczowych wyściełający miedniczkę nerkową, moczowody, pęcherz moczowy i bliższą cewkę moczową wyczuwa i przekazuje informacje o swoim otoczeniu do tkanek leżących poniżej, promując funkcję i zachowanie mikcji. Przerwanie bariery urotelialnej lub jej funkcji czuciowej/przetwornikowej może prowadzić do choroby. Badanie tych złożonych zdarzeń jest utrudnione przez brak prostych strategii zmiany ekspresji genów i białek w nabłonku dróg moczowych. Opisano tutaj metody, które pozwalają badaczom generować duże ilości adenowirusa o wysokim mianie, który można następnie wykorzystać do transdukcji nabłonka dróg ciężkich gryzoni z wysoką wydajnością i w stosunkowo prosty sposób. Zarówno cDNA, jak i małe interferujące RNA mogą być wyrażane za pomocą transdukcji adenowirusowej, a wpływ ekspresji transgenu na funkcję urotelialną można ocenić od 12 godzin do kilku dni później. Metody te mają szerokie zastosowanie w badaniach prawidłowej i nieprawidłowej biologii urotelialnej z wykorzystaniem mysich lub szczurzych modeli zwierzęcych.

Introduction

Nabłonek dróg moczowych to wyspecjalizowany nabłonek, który wyściela miedniczkę nerkową, moczowody, pęcherz moczowy i bliższą cewkę moczową1. Składa się z trzech warstw: warstwy wysoce zróżnicowanych i spolaryzowanych, często dwujądrowych komórek parasolowych, których wierzchołkowe powierzchnie są skąpane w moczu; pośrednia warstwa komórkowa z populacją dwujądrowych komórek wzmacniających tranzyt, które mogą dać początek powierzchownym komórkom parasolowym w odpowiedzi na ich ostrą utratę; oraz pojedyncza warstwa komórek podstawnych, których podzbiór funkcjonuje jako komórki macierzyste, które mogą regenerować cały nabłonek dróg moczowych w odpowiedzi na przewlekłe uszkodzenie. Komórki parasolowe są głównie odpowiedzialne za tworzenie bariery urotelialnej o wysokiej odporności, której składniki obejmują błonę wierzchołkową (bogatą w cholesterol i cerebrozydy) o niskiej przepuszczalności dla wody i substancji rozpuszczonych oraz kompleks połączeń wierzchołkowych o wysokiej odporności (składający się z połączeń ścisłych, połączeń adherens, desmosomów i związanego z nimi pierścienia aktomiozyny)1. Zarówno wierzchołkowa powierzchnia komórki parasolowej, jak i jej pierścień łączący rozszerzają się podczas napełniania pęcherza i szybko wracają do stanu wstępnie napełnionego po mikcji1,2,3,4,5. Oprócz roli w funkcji bariery, przypuszcza się również, że nabłonek dróg moczowych pełni funkcje sensoryczne i przetwornikowe, które pozwalają mu wyczuwać zmiany w środowisku zewnątrzkomórkowym (np. rozciąganie) i przekazywać te informacje poprzez uwalnianie mediatorów (w tym ATP, adenozyny i acetylocholiny) do leżących poniżej tkanek, w tym suburotelialnych procesów nerwowych aferentnych6,7,8. Niedawne dowody na tę rolę znaleziono u myszy pozbawionych urotelialnej ekspresji zarówno Piezo1, jak i Piezo2, co powoduje zmienioną funkcję mikcji9. Dodatkowo, u szczurów występuje nadekspresja białka CLDN2 tworzącego pory o ścisłym połączeniu w warstwie komórek parasolowych, u których występuje stan zapalny i ból analogiczny do obserwowanego u pacjentów ze śródmiąższowym zapaleniem pęcherza moczowego10. Przypuszcza się, że zaburzenie funkcji czuciowo-czuciowej/przetwornika urotelialnego lub bariery może przyczyniać się do kilku zaburzeń pęcherza moczowego6,11.

Lepsze zrozumienie biologii nabłonka dróg moczowych w stanach normalnych i chorobowych zależy od dostępności narzędzi, które pozwolą badaczom łatwo obniżyć ekspresję genów endogennych lub umożliwić ekspresję transgenów w tkance natywnej. Podczas gdy jednym z podejść do obniżenia ekspresji genów jest wygenerowanie myszy z warunkowym nokautem urotelialnym, podejście to zależy od dostępności myszy z floksowanymi allelami, jest pracochłonne i może zająć miesiące lub lata, aby je ukończyć12. Nic więc dziwnego, że badacze opracowali techniki transfekcji lub transdukcji nabłonka dróg moczowych, co może prowadzić do wyników w krótszej skali czasowej. Opublikowane metody transfekcji obejmują użycie lipidów kationowych13, antysensownych fosforydowanych oligodeoksynukleotydów14, lub antysensownych kwasów nukleinowych związanych z 11-merowym peptydem penetrującym białko HIV TAT15. Jednak w tym protokole skupiono się na wykorzystaniu transdukcji za pośrednictwem adenowirusa, dobrze zbadanej metodologii, która jest skuteczna w dostarczaniu genów do szerokiego zakresu komórek, została przetestowana w licznych badaniach klinicznych, a ostatnio została wykorzystana do dostarczenia cDNA kodującego białko kapsydu COVID-19 do biorców jednego wariantu szczepionki COVID-1916, 17. W celu uzyskania bardziej szczegółowego opisu cyklu życiowego adenowirusa, wektorów adenowirusowych i klinicznych zastosowań adenowirusów, czytelnik jest kierowany do reference17.

Ważnym kamieniem milowym w użyciu adenowirusów do transdukcji nabłonka dróg moczowych, był raport Ramesha i wsp., który wykazał, że krótkie wstępne leczenie detergentami, w tym N-dodecyl-β-D-maltozydem (DDM), znacznie zwiększyło transdukcję nabłonka dróg moczowych przez adenowirusa kodującego β-galaktozydazę18. Korzystając z tego badania potwierdzającego zasadność jako przewodnika, transdukcja nabłonka dróg moczowych za pośrednictwem adenowirusa została teraz wykorzystana do ekspresji różnych białek, w tym GTPaz rodziny Rab, czynników wymiany guaniny-nukleotydów, fragmentów motorycznych miozyny, tworzących pory klaudyny związanych ze ścisłymi połączeniami i ADAM1710,19,20,21,22. To samo podejście zaadaptowano do ekspresji małych interferujących RNA (siRNA), których efekty zostały uratowane przez koekspresję opornych na siRNA wariantów transgene22. Opisany tutaj protokół obejmuje ogólne metody generowania dużych ilości wysoce skoncentrowanego adenowirusa, co jest wymogiem dla tych technik, a także adaptacje metod Ramesh et al.18 do ekspresji transgenów w nabłonku dróg moczowych z wysoką wydajnością.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

Eksperymenty związane z generowaniem adenowirusów, które wymagają certyfikatu BSL2, zostały przeprowadzone za zgodą biur ds. zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego Uniwersytetu w Pittsburghu oraz Instytucjonalnego Komitetu ds. Bezpieczeństwa Biologicznego. Wszystkie przeprowadzone eksperymenty na zwierzętach, w tym transdukcja adenowirusowa (która wymaga certyfikacji ABSL2), zostały przeprowadzone zgodnie z odpowiednimi wytycznymi/przepisami Polityki Publicznej Służby Zdrowia w zakresie humanitarnej opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych oraz Ustawy o dobrostanie zwierząt, a także za zgodą Komitetu ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt Uniwersytetu w Pittsburghu. Rękawice, okulary ochronne i odpowiedni ubiór są noszone podczas wszystkich zabiegów z udziałem rekombinowanych wirusów. Wszelkie odpady płynne lub stałe należy utylizować w sposób opisany poniżej. Ściółka zwierząt po transdukcji oraz wszelkie powstałe w ten sposób tusze zwierzęce powinny być traktowane jako materiały niebezpieczne biologicznie i unieszkodliwiane zgodnie z polityką instytucjonalną.

1. Przygotowanie zapasów adenowirusów o wysokim mianie

UWAGA: Skuteczna transdukcja pęcherzy gryzoni zależy od użycia oczyszczonych i skoncentrowanych zapasów wirusów, zazwyczaj 1 x 107 do 1 x 108 zakaźnych cząstek wirusa (IVP) na μL. Ta część protokołu koncentruje się na generowaniu zapasów adenowirusa o wysokim mianie z istniejących preparatów wirusowych. Wszystkie kroki należy wykonywać w kapturze do hodowli komórkowych przy użyciu sterylnych odczynników i narzędzi. Chociaż dostępne obecnie szczepy adenowirusa są wadliwe w replikacji, większość instytucji wymaga zgody na stosowanie adenowirusów i rekombinowanego DNA. Często obejmuje to wyznaczenie pomieszczenia do hodowli komórkowych jako zakładu zatwierdzonego przez BSL2 do produkcji i amplifikacji adenowirusów. Niektóre ogólne względy obejmują stosowanie masek, ochrony oczu, rękawiczek i odpowiedniego ubioru na wszystkich etapach produkcji i oczyszczania wirusa. Podczas wirowania zaleca się stosowanie nasadek zabezpieczających, jeśli probówki wirówkowe nie mają szczelnie dopasowanych nasadek. Wszystkie materiały jednorazowego użytku, w tym potencjalnie zanieczyszczone nasadki zabezpieczające wirówki, butelki i wirniki, są traktowane roztworem antywirusowym (patrz Tabela materiałów), a następnie spłukiwane wodą lub 70% etanolem. Odpady płynne są oczyszczane przez dodanie wybielacza do końcowego stężenia 10% (v/v). Utylizacja tych płynnych odpadów będzie zależała od polityki instytucjonalnej. Odpady stałe są zwykle utylizowane wraz z odpadami niebezpiecznymi biologicznie.

  1. Hodowla komórek HEK293T
    1. Rozmrozić zamrożoną fiolkę z HEK293T komórkami w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C i za pomocą pipety o pojemności 5 ml przenieść komórki do naczynia do hodowli komórek o średnicy 15 cm. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml powoli dodaj do naczynia 20 ml zmodyfikowanego podłoża Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco zawierającego 10% (v/v) płodowej surowicy bydlęcej i antybiotyk penicyliny/streptomycyny (DMEM-FBS-PS). Inkubować komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych o temperaturze 37 °C, zagazowanym 5% (v/v) CO2 , aż osiągną 80%-90% konfluencji (~2 x 107 komórek).
    2. Za pomocą szklanej pipety podłączonej do źródła próżni odessać pożywkę, a następnie przepłukać komórki, przenosząc 20 ml sterylnego PBS (2,7 mM KCl, 1,5 mM KH2PO4, 136,9 mM NaCl i 8,9 mM Na2HPO4) do naczynia za pomocą pipety 25 mL. Odessać zużyty PBS, a następnie za pomocą pipety o pojemności 5 ml przenieść 3 ml ciepłego (37 °C) roztworu proteinazy (patrz Tabela Materiałów) do naczynia, inkubując szalkę w inkubatorze do hodowli komórkowych, aż komórki oderwą się (~3-4 min).
      UWAGA: Skuteczną proteolizę można najlepiej ocenić, powoli przechylając naczynie do przodu i do tyłu, szukając uwolnienia komórek ze wszystkich części naczynia do poruszającego się płynu. HEK293T komórki są wrażliwe na przedłużone leczenie proteinazą i umrą, jeśli pozostaną dłużej niż kilka minut w roztworze proteinazy.
    3. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś 7 ml DMEM-FBS-PS do naczynia z odłączonymi komórkami, a następnie użyj tej samej pipety do zasysania komórek i pożywki. Przenieść zawieszone komórki do stożkowej probówki o pojemności 50 ml, a następnie granulować komórki, odwirowując zawiesinę w wirówce klinicznej o niskiej prędkości przy 200 x g przez 5 minut. Odessać supernatant za pomocą szklanej pipety podłączonej do źródła podciśnienia. Użyj pipety o pojemności 25 ml, aby ponownie zawiesić osad komórkowy w 15 ml DMEM-FBS-PS.
    4. Dodać 1 ml zawiesiny komórkowej do każdej z piętnastu 15-centymetrowych szalek zawierających 19 ml DMEM-FBS-PS.
    5. Hoduj komórki w inkubatorze do hodowli tkankowych, aż osiągną 85%-90% konfluencji (~3-4 dni).
  2. Przygotuj rozcieńczony roztwór wirusa
    1. Dodaj ~1,5 x 109 do 3 x 109 IVP istniejącego zapasu wirusa (5-10 IVP / komórkę) do stożkowej probówki o pojemności 50 ml wypełnionej 45 ml DMEM bez FBS lub antybiotyków.
      UWAGA: Możliwe jest użycie niższego stężenia wirusa (1-5 IVP/komórkę); Jednak produkcja wirusa potrwa dłużej.
  3. Zainfekuj wyhodowane komórki wirusem.
    1. Używając szklanej pipety podłączonej do źródła podciśnienia, odessać pożywkę z prawie zlewających się komórek w kroku 1.1.5.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml przenieś 3,0 ml rozcieńczonego roztworu wirusa (przygotowanego w kroku 1.2.1) do każdej płytki do hodowli komórkowych. Następnie użyj pipety o pojemności 10 ml, aby dodać 7,0 ml pożywki DMEM (bez FBS lub antybiotyków) do każdego naczynia. Inkubować przez 60 minut w inkubatorze do hodowli komórkowych, a następnie dodać 10 ml DMEM zawierającego 20% (v/v) FBS i 2x PS do każdej potrawy.
      UWAGA: Użycie jednej z 15 szalek jako płytki kontrolnej (do której wirus nie jest dodawany) ułatwia identyfikację wywołanego przez wirusa zaokrąglenia komórek i śmierci w zakażonych komórkach w następnym kroku.
    3. Inkubuj komórki w inkubatorze do hodowli komórkowych przez 2-4 dni, aż większość z nich zacznie się zaokrąglać i >60% komórek się odczepi.
      UWAGA: W przypadku stosowania niższego miana wirusa może minąć do tygodnia, zanim nastąpi śmierć komórki. Jeśli śmierć komórki nie nastąpi w ciągu tygodnia, prawdopodobnie proces będzie musiał zostać powtórzony przy użyciu wyższego miana wirusa.
  4. Odzyskaj wirusa z lizatów komórkowych
    1. Użyj skrobaka do komórek, aby zeskrobać dno każdego naczynia, uwalniając przyczepione komórki do podłoża.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 25 ml zebrać i zebrać pożywkę, komórki i resztki komórek z każdej płytki do hodowli komórkowych w stożkowej probówce do hodowli komórkowych o pojemności 50 ml.
      UWAGA: Aby oszczędzać zasoby, pożywkę z dwóch szalek można połączyć w jedną probówkę o pojemności 50 ml.
    3. Osadzać materiał komórkowy przez odwirowanie za pomocą wolnoobrotowej wirówki stołowej: 5 minut w temperaturze pokojowej przy 3 000 x g. Użyj szklanej pipety podłączonej do urządzenia próżniowego, aby zassać supernatant.
    4. Użyj pipety o pojemności 10 ml w połączeniu z rozcieraniem, aby skonsolidować cały otrzymany materiał granulowany w sumie 7 ml sterylnie przefiltrowanego 100 mM Tris-HCl pH 7,4 zawierającego 10 mM EDTA (roztwór Tris-EDTA). Przenieś zebrany materiał do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 15 ml do hodowli komórkowych i umieść na lodzie.
      UWAGA: W tym momencie preparat wirusa można zamrozić w temperaturze -80 °C na czas nieokreślony.
  5. Przygotuj lizaty komórkowe
    1. Wykonaj trzy cykle zamrażania i rozmrażania, aby rozbić pozostałe komórki, a tym samym dalej uwolnić powstałe cząsteczki wirusa. Zamrozić zebrany materiał w kroku 1.4.4, zanurzając rurkę w ciekłym azocie (~30-60 s). Szybko rozmrozić próbkę, umieszczając probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C. Wirować próbkę przez 15 s, a następnie powtórzyć procedurę szybkiego zamrażania i rozmrażania dodatkowo 2x,
      UWAGA: Roztwór wirusa można szybko rozmrozić w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej, ale należy zachować ostrożność, ponieważ wahania temperatury mogą spowodować pęknięcie probówki, uwalniając roztwór wirusa do łaźni wodnej. Aby temu zapobiec, należy umieścić probówkę zawierającą supernatant wirusa w większej probówce, którą następnie umieszcza się w łaźni wodnej.
    2. Za pomocą pipety o pojemności 10 ml przenieś trzykrotnie zamrożony i rozmrożony materiał komórkowy do probówki wirówki o dużej szybkości. Odwirować materiał w probówce przez 30 minut w temperaturze 4 °C, wirówka superspeed przy ~18 500 x g.
    3. Odzyskaj ~7 ml supernatantu bogatego w wirusy za pomocą pipety o pojemności 10 ml i przenieś go do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Zatrzymać próbkę na lodzie do następnego etapu.
      UWAGA: W tym momencie rozważ zachowanie podwielokrotności nieoczyszczonego supernatantu wirusowego jako preambuły do rozpoczęcia nowego przygotowania wirusa (lub jako kopii zapasowej). Przechowywać tę podwielokrotność w temperaturze -80 °C.
  6. Wyizolować i oczyścić wirusa za pomocą wirowania w gradiacji gęstości.
    1. Przygotować nieciągły gradient CsCl w cienkościennej, przezroczystej probówce ultrawirówkowej PET o pojemności 12 ml (patrz tabela materiałów) lub równoważnej. Za pomocą strzykawki o pojemności 3 ml wyposażonej w igłę 18 G ostrożnie wprowadzić 2,5 ml roztworu CsCl o stężeniu 1,4 g/ml na dno probówki, a następnie za pomocą nowej strzykawki/igły nałożyć na nią warstwę 2,5 ml roztworu CsCl o stężeniu 1,25 g/mL.
      UWAGA: Upuszczanie roztworów bezpośrednio na istniejącą warstwę spowoduje znaczne i niepożądane mieszanie. Zamiast tego należy przyłożyć ściętą część igły do krawędzi rurki, a następnie bardzo powoli nacisnąć tłok strzykawki, zwiększając położenie igły, gdy roztwór wypełnia probówkę.
    2. Załaduj ~7 ml supernatantu wirusa na wierzch gradientu w podobny sposób za pomocą strzykawki o pojemności 10 ml. Jeśli między supernatantem wirusa a górną częścią probówki jest więcej niż 2-3 mm wolnej przestrzeni, dodaj dodatkowy roztwór Tris-EDTA, aby wypełnić probówkę, aż pozostanie tylko 2-3 mm przestrzeni.
    3. Sporządzić podobnie przygotowaną probówkę balansową, zawierającą warstwy CsCl, ale zastępującą roztwór Tris-EDTA supernatantem wirusa.
      UWAGA: Obie probówki muszą mieć identyczną wagę (i podobną gęstość), aby zapobiec potencjalnie niebezpiecznemu niezrównoważonemu obciążeniu w ultrawirówce.
  7. Wyizolować wirusa za pomocą ultrawirowania strefowego.
    1. Załaduj pochyłki utworzone w krokach 1.6.2-1.6.3 do kubełków wirnika SW41 lub jego odpowiednika. Zakręcić nakrętki wiader, umieścić wirnik w ultrawirówce (wstępnie schłodzonej do 4 °C) i wirować przez 1 godzinę przy ~150 000 x g.
    2. Podczas wirowania należy zrównoważyć kolumnę opisaną w kroku 1.9.1 poniżej.
  8. Odzyskiwanie wyizolowanych cząsteczek wirusa
    1. Pod koniec etapu wirowania ostrożnie odłącz wiadra od wirnika i w kapturze do hodowli komórkowych zdejmij nakrętki wiadra, a następnie wyjmij probówki i umieść je w stojaku.
    2. Zebrać materiał prążkowany, bogaty w cząsteczki wirusa, który unosi się na granicy faz między roztworem CsCl o stężeniu 1,25 g/ml i 1,4 g/ml. Trzymając probówkę zawierającą gradient nad dolną połową naczynia do hodowli komórkowej (która złapie wszelkie rozlane materiały), użyj 1-calowej igły 18 G przymocowanej do strzykawki o pojemności 3 ml, aby ostrożnie przebić probówkę, tuż pod prążkowanym wirusem. Powoli odsysaj wirusa, który zwykle jest odzyskiwany w ~1 ml.
    3. Wyjmij igłę z probówki, co spowoduje, że pozostały materiał w gradiencie wypłynie z probówki do dolnej połowy naczynia do hodowli komórkowej (wszelkie płyny należy traktować jako odpady niebezpieczne).
    4. Przenieść roztwór wirusa w strzykawce do sterylnej probówki do mikrowirówki na lodzie.
      UWAGA: Podczas odzyskiwania wirusa na tym etapie, ustaw igłę tak, aby światło igły było skierowane do góry, a igła otwierała się kilka mm poniżej pasma bogatego w wirusy. Unikaj zanieczyszczenia cienkim pasmem nieprawidłowo złożonego wirusa, który czasami jest obserwowany 2-3 mm powyżej wirusa prążkowanego (patrz cienka strzałka w Rysunek 1A).
  9. Usunąć CsCl z próbki za pomocą filtracji żelowej.
    1. Zrównoważyć kolumnę PD-10 (wstępnie wypełnioną Sephadex G-25M), zaciśniętą na stojaku nośnym, z 50 ml sterylnie przefiltrowanego PBS 0,2 μm zawierającego 10% (v/v) glicerolu.
      UWAGA: Początkowy etap równoważenia trwa 2-3 godziny i jest niezbędny, aby zapewnić całkowite wypłukanie środków konserwujących, które są używane przez producenta do stabilizacji kolumny.
    2. Pozwolić, aby roztwór płuczący cofnął się poniżej fryty (ochronny krążek z białego materiału w górnej części podłoża kolumny), a następnie ostrożnie przenieść oczyszczony roztwór wirusa zebrany w kroku 1.8 na górę kolumny. Pozwolić, aby bogaty w wirusy roztwór cofnął się poniżej fryty, a następnie rozpocząć napełnianie kolumny PBS-glicerolem.
      UWAGA: Jedną z funkcji fryty jest zapobieganie wysuszaniu kolumny. W rezultacie, tolerowane są krótkie opóźnienia, zanim do kolumny zostanie dodana większa ilość eluantu.
    3. Zebrać eluat w 12 sterylnych probówkach do mikrowirówek, po 0,5 ml na frakcję.
  10. Określ wydajność wirusa.
    1. Określić piki frakcji wirusa za pomocą spektrofotometrii. Przygotować rozcieńczenie 1:100 każdej frakcji PBS i zmierzyć OD260 w spektrofotometrze, używając samego buforu rozcieńczonego 1:100 jako próby ślepej. Cząsteczki wirusa powinny wymywać się w pustej objętości, zaczynając od około frakcji 6. Zbierz frakcje zawierające najwyższe odczyty OD260.
    2. Wykonać rozcieńczenie 1:100 połączonych frakcji wirusowych i ponownie zmierzyć OD260. Obliczyć końcowe stężenie cząstek wirusa i liczbę IVP we wspólnych frakcjach, korzystając z następującego wzoru: Cząstki wirusa na ml = OD260 × 100 (koryguje to współczynnik rozcieńczenia) × 1012. Ogólne szacunki mówią, że 1% cząstek wirusa to IVP, w następujący sposób: IVP/ml = OD260 × 100 × 1010 lub IVP/μL = OD260 × 100 × 107.
  11. Podwielokrotność połączonych frakcji wirusa (zawierających 5 x 107 do 1 x 108 IVP) do sterylnych probówek do mikrowirówek lub kriowialiów. Próbki należy przechowywać w temperaturze -80 °C.

2. Transdukcja pęcherza gryzonia

UWAGA: Jeśli nie znasz tej techniki, zaleca się, aby liczba zwierząt transdukowanych jednocześnie była ograniczona do 2-4. Można to osiągnąć poprzez rozłożenie w czasie czasu rozpoczęcia leczenia dla każdego zwierzęcia, szczególnie podczas leczenia detergentem w kroku 2.2, a następnie inkubacji wirusa w kroku 2.3. Doświadczeni badacze mogą transdukować do sześciu zwierząt jednocześnie.

  1. Cewnikowanie pęcherza moczowego
    1. Samice myszy C57Bl/6J (zwykle w wieku 8-10 tygodni, ~20-25 g) lub samice szczurów Sprague Dawley (zwykle w wieku 2-3 miesięcy, ~250 g) należy znieczulić za pomocą waporyzatora z dołączonym stożkiem nosowym. Skalibruj waporyzator, aby wytwarzał 3,0% (v/v) izofluranu, 97% (v/v) O2 dla myszy lub 4,0% (v/v) izofluranu, 96% (v/v) O2 dla szczurów. Upewnij się, że zwierzęta są znieczulone, upewniając się, że nie reagują na szczypanie palców u nóg (zwykle po 1-2 minutach).
    2. Utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia, umieszczając je na podgrzewanej podkładce. Monitoruj zwierzę przez cały protokół transdukcji, aby upewnić się, że zwierzęta są znieczulone i nie odczuwają bólu podczas tej procedury.
    3. Zmniejsz dawkę izofluranu do 1,5% (v/v) u myszy lub 2,0% (v/v) u szczurów i utrzymuj zwierzęta w znieczuleniu przez cały czas trwania protokołu.
    4. Aby zapobiec wprowadzaniu powietrza do pęcherza, napełnij plastikową część cewnika dożylnego (patrz Tabela materiałów) i powiązaną piastę sterylnym PBS za pomocą pipety do przenoszenia.
    5. Gdy zwierzę znajduje się w pozycji leżącej, przetrzyj przewód zewnętrzny 70% alkoholem i wprowadź sterylny cewnik do przewodu zewnętrznego, następnie cewki moczowej, a następnie do pęcherza moczowego.
      1. Aby wykonać to zadanie, użyj cienkich kleszczy, aby delikatnie chwycić tkankę tworzącą zewnętrzny przewód pokarmowy i rozciągnąć ją pionowo, z dala od zwierzęcia. Drugą ręką ostrożnie wprowadź cewnik pionowo na około 3-4 mm do ujścia cewki moczowej (wzgórek mięsa tuż nad otworem pochwy). Następnie, z powodu zgięcia cewki moczowej, opuść cewnik, wprowadzony do zewnętrznego przewodu moczowego, w kierunku ogona zwierzęcia, co ułatwia jego wejście do części cewki moczowej, która przechodzi poniżej kości łonowej, a ostatecznie do pęcherza moczowego
        . UWAGA: Szczególnie w przypadku myszy cewnik może być zbyt długi i nie należy wprowadzać do zwierzęcia więcej niż 1,0-1,1 cm. W przeciwnym razie dojdzie do uszkodzenia błony śluzowej pęcherza moczowego. Aby temu zapobiec, oznacz cewnik ~1 cm poniżej jego końcówki, a następnie nie wkładaj cewnika poza to oznaczenie.
    6. Pozwól, aby mocz z pęcherza wyciekł. Usuń resztki moczu, wykonując manewr Credé: masuj i delikatnie dociśnij guzek pęcherza w dolnej części brzucha.
  2. Spraw, aby nabłonek dróg moczowych był podatny na transdukcję, traktując go roztworem detergentu.
    1. Umyj pęcherz myszy lub szczura, podłączając sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną PBS do piasty cewnika. Wstrzyknąć 100 μl sterylnego PBS do pęcherza myszy (lub 450 μl w przypadku pęcherza szczura). Odłączyć strzykawkę od złączki cewnika i pozwolić na odpływ PBS. W razie potrzeby wykonaj manewr Crede'a, aby usunąć nadmiar płynu z pęcherza.
    2. Wkroplić 100 μl 0,1% (w/v) N-dodecylo-β-D-maltozydu (DDM) (rozpuszczonego w PBS i wysterylizowanego filtrem 0,2 μm) do pęcherza myszy za pomocą sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml. Utrzymuj DDM w pęcherzu moczowym przez 10 minut, pozostawiając strzykawkę na miejscu. U szczurów objętość DDM zwiększa się do 450 μl.
    3. Usunąć DDM z pęcherza, odłączając strzykawkę i pozwalając jej odpłynąć. W razie potrzeby wykonaj manewr Crede'a.
  3. Wprowadzić wirusa do pęcherza moczowego.
    1. Podłączyć sterylną strzykawkę o pojemności 1 ml do węzła cewnika i wkroplić do pęcherza moczowego 0,5 x 107 do 1 x 108 IVP adenowirusa (przygotowanego w kroku 1), rozcieńczonego w 100 μl sterylnego PBS dla myszy lub 450 μl dla szczurów. Pozostawić strzykawkę podłączoną do cewnika, aby zapobiec wydostawaniu się roztworu wirusa.
    2. Po 30 minutach odłączyć strzykawkę i pozwolić, aby roztwór wirusa opróżnił pęcherz moczowy na jednorazową wkładkę. Zetrzyj resztki roztworu wirusa chusteczką chłonną, a następnie wyrzuć podkładkę i wytrzyj do odpadów niebezpiecznych biologicznie.
      UWAGA: Glicerol jest cytotoksyczny. W związku z tym maksymalna objętość roztworu wirusa wkroplonego myszom jest ograniczona do 5 μl (co po rozcieńczeniu do 100 μl PBS dałoby końcowe stężenie glicerolu ~0,5% [v/v]). Dodatkowo możliwe jest zwiększenie wydajności transdukcji poprzez zwiększenie liczby wkraplanych IVP oraz wydłużenie inkubacji wirusa do 45 minut.
    3. Krok opcjonalny: Pęcherz można przepłukać PBS, jak opisano w kroku 2.2.1 powyżej, jednak nie jest to wymagane.
  4. Pozwól zwierzęciu dojść do siebie.
    1. Należy przerwać przepływ izofluranu i pozwolić zwierzęciu na powrót do zdrowia i pełną mobilność przed powrotem do klatki, szczególnie jeżeli zwierzęta są trzymane w grupach.
      UWAGA: Ponieważ transdukcja wirusa sama w sobie nie powoduje obserwowalnych objawów ani bólu ze strony dolnych dróg moczowych, zwykle nie ma potrzeby leczenia pooperacyjnego. Jeśli jednak kodowany transgen jest toksyczny, może być konieczne znieczulenie pozabiegowe lub antybiotyki, zgodnie z wymaganiami instytucji.
  5. Analizuj efekty ekspresji transgenu 12-72 h po leczeniu przy użyciu metod takich jak hybrydyzacja mRNA in situ, western blot lub immunofluorescencja9,10,23 (zobacz reprezentatywne wyniki).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Przygotowanie wirusa
Przykład oczyszczania wirusa przez wirowanie w gradionym gradiacji gęstości jest pokazany na Rysunek 1A. Jasnoróżowy pasek, znajdujący się na granicy załadowanego materiału komórkowego i warstwy CsCl o gramaturze 1,25 g / ml, składa się głównie z uszkodzonych komórek i ich szczątków (patrz purpurowa strzałka w Rysunek 1A). Swój różowawy kolor zawdzięcza niewielkiej ilości pożywki hodowlanej, kt...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Podczas gdy Ramesh i in. koncentrowali się na opracowywaniu strategii wykorzystania transdukcji adenowirusowej w leczeniu raka pęcherza moczowego18, nowsze doniesienia wykazały użyteczność tych technik w badaniu prawidłowej biologii/fizjologii i patofizjologii uroteliów 10,18,19,20,21. Do ważnych cech tego podejścia należą: ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Acknowledgements

Ta praca została wsparta nagrodą za projekt pilotażowy przez P30DK079307 (dla M.G.D.), R01DK119183 grantu NIH (dla G.A. i M.D.C.), R01DK129473 grantu NIH (dla G.A.), nagrodę American Urology Association Career Development oraz grant Fundacji Winters (dla N.M.), przez Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores z Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307), oraz przez S10OD028596 (do G.A.), który sfinansował zakup systemu konfokalnego używanego do uchwycenia niektórych obrazów przedstawionych w tym rękopisie.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Pipeta 10 mlCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4488sterylna, serologiczna pipeta, indywidualnie pakowana
12 ml probówka do ultrawirówekThermoFisher06-752Cienkościenna ultrawirówka PET
stożkowa probówka wirówkowa 15 mlFalcon (Corning)352097sterylna
igła 18 GBD 305196Igła 18 G x 1,5 cala
Pipeta 20 mlCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4489sterylna, serologiczna pipeta, pakowana pojedynczo
Stożkowa probówka wirówkowa 50 mlFalcon (Corning)352098sterylna
pipeta 5 mlCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4487sterylna, serologiczna pipeta, pakowana pojedynczo
CavicideHenry Schein6400012Roztwór przeciwwirusowy
Naczynie do hodowli komórkowych - 15 cmFalcon (Corning)353025sterylne, poddane działaniu hodowli tkankowej  (czasza 150 mm x 25 mm)
Skrobakdo komórek Sarstedt893.1832długość rączki 24 cm, długość ostrza 1,7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306Biologia molekularna klasa ≥ 98%
Pożywka hodowlana DMEM (wysoka glukoza)Gibco (ThermoFisher)11965092z 4,5 g/L glukozy + L-glutamina + czerwień fenolowa
EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra klasa ≥ 99%
Surowica bydlęca płodu Hyclon (Cytiva)SH30070.03zdefiniowana surowica
Szklana pipetaFisher Scientific13-678-20A5,75 cala szklana pipeta, autoklawizowana
glicerolMillipore SigmaG-5516Biologia molekularna klasy ≥ 99%
komórek HEK293HEK293T ATCCCRL-3216są wariantem komórek HEK293, które wyrażają duży antygen T SV40
IzofluranCewnik dożylny Covetrus29405
- myszSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 cala Bezpieczny cewnik dożylny  Nieprzepuszczalny dla promieni rentgenowskich
cewnik dożylny - szczurSmith Medical Jelco306022 G x 1 cal Bezpieczny cewnik dożylny nieprzepuszczający promieni rentgenowskich
KClMillipore SigmaP-9541Biologia molekularna klasa ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655Klasa hodowli komórkowej  ≥ 99%
Na2HPO4• 7 H2OMillipore Sigma431478  ≥ 99,99%
NaClMillipore SigmaS3014Biologia molekularna klasa ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltozyd Millipore SigmaD4641  ≥ 98%
Stożek nosowy dla wielu zwierzątspecjalnie zaprojektowaneopcje komercyjne, w tym jeden z kolumny Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 GE Healthcare17-085-01Fabrycznie zapakowane kolumny wypełnione antybiotykiem Sephadex G-25M
Penicylina/streptomycyna (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x stężony roztwór
SpektrofotometrEppendorf BioPhotometer
Statyw i zaciskFisher Scientific14-679Q i 05-769-8FQdostępne u wielu dostawców
Sterylna jednostka filtrującaFisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0,2 i mikro; m Filtr o szybkim przepływie (150 ml)
Sterylny filtr 0,2 i mikro; m (strzykawka)Fisher Scientific SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0,22 & mikro; m jednostka filtrująca, którą podłącza się do strzykawki
Wirówka superszybkaEppendorf 5810Rz wirnikiem o stałym kącie nachylenia Eppendorf F34-6-38 (12 000 obr./min)
Strzykawka (1 mL)BD 309628Strzykawka 1 ml końcówka Luer-lok - sterylna
strzykawka (3 ml)BD 3096563-mL końcówka strzykawki - sterylna
Wirówka stołowa (niska prędkość)Eppendorf 5702z wahliwym wirnikiem kubełkowym
Pipety transferoweFisher Scientific13-711-9AMpolietylenowa pipeta transferowa 3,4 ml
Tris-baseMillipore Sigma648310-MBiologia molekularna klasa 
TrypLE select roztwór proteazyGibco (ThermoFisher)12604013Enzym ekspresyjny TrypLE (1x), bez czerwieni fenolowej
UltrawirówkaBeckman CoulterOptima L-80 XPz wirnikiem Beckman SW41 (41 000 obr./min)
Waporyzator Usługi w zakresie znieczulenia ogólnego, Inc.Waporyzator Tec 3Isoflurane
Vortex MixerVWR10153-838analogowy mikser wirowy
Komórki ,

References

  1. Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
  2. Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
  3. Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
  4. Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
  5. Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
  6. Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
  7. Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
  8. Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
  9. Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984(2021).
  10. Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
  11. Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463(2014).
  12. Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
  13. Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
  14. Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
  15. Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
  16. Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
  17. Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
  18. Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
  19. Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
  20. Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
  21. Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
  22. Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
  23. Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
  24. Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
  25. Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
  26. Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
  27. Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804(2018).
  28. Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888(2022).
  29. Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

Transgenynab onek dr g moczowych p cherza moczowegotransdukcja za po rednictwem adenowirusaCDNASiRNAcewnikowanieprotok myszyskuteczno transdukcjisterylny PBSuj cie cewki moczowej zewn trznejmanewr Crede aN dodecyl beta D maltozydtechnika znieczuleniaprotok badawczy