Ogólnym celem tej procedury jest pomyślne przeprowadzenie operacji heterotroficznego przeszczepu błony śluzowej w celu dostarczenia związków do mózgu. Osiąga się to poprzez najpierw wyizolowanie przeszczepu przegrody nosowej od myszy dawcy. Drugim krokiem jest przeszczepienie błony śluzowej z przegrody na ubytek czaszki u myszy biorcy.
Następnie mózg jest dawkowany przez przeszczep przez pożądany okres czasu. Ostatnim krokiem jest analiza konsekwencji procedury dawkowania mózgu za pomocą fluorescencji, mikroskopii lub immunohistochemii, aby pokazać dyfuzję dostarczonych związków do mózgu. Parenchyma. Wykorzystanie farmaceutyków neurop jest bardzo ograniczone ze względu na obecność bariery krew-mózg.
Opracowaliśmy technikę opartą na ludzkiej endoskopowej chirurgii przeznosowej, w której możemy wprowadzić błonę śluzową do w barierze krew-mózg i wykorzystać ją jako kanał do dostarczania leków bezpośrednio do mózgu. Richie Komen, doktorant w Han's Lab na Uniwersytecie Bostońskim, zademonstruje tę technikę na modelu mysim. Rozpocznij tę procedurę od usunięcia skóry wokół nosa myszy poddanej eutanazji, aby odsłonić czaszkę.
Następnie zaznacz trzy linie wiertarką pneumatyczną. Dwie linie bocznie flankują obszar nosowy, a trzecia znajduje się w linii z oczami, co łączy dwie linie prostopadle. Następnie przejdź do szczegółów brzusznie.
Aby oddzielić przegrodę nosową od otaczającej tkanki, odetnij przegrodę od wszelkich przylegających do niej tkanek. Następnie przechowuj go w sterylnym roztworze soli fizjologicznej pod mikroskopem, oczyść przeszczep i usuń wszelką połączoną tkankę. Idealną sytuacją jest skuteczne usunięcie całej tkanki łącznej bez uszkadzania błon śluzowych obecnych po obu stronach przegrody chrzęstnej.
Po znieczuleniu myszy za pomocą standardowych aseptycznych procedur chirurgicznych z odwzorowaniem lustrzanym zamontowanych w oprawie teologicznej, nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie odsłoń czaszkę i wypoziomuj głowę. Następnie wytnij okrągły otwór o średnicy 1,25 milimetra w czaszce za pomocą wiertarki pneumatycznej.
Celując w atu, zwilż wywiercony obszar sterylną solą fizjologiczną i użyj żyletki, aby usunąć czaszkę. Następnie ręcznie usuń oponę twardą za pomocą końcówki igły o rozmiarze 30. Następnie umieść błonę śluzową nad powierzchnią mózgu, zwracając szczególną uwagę, aby strona nabłonka była skierowana z dala od rany.
Za pomocą końcówki nożyczek chirurgicznych przytrzymaj błonę z dala od chrząstki i na powierzchni czaszki i mózgu, aby obficie zachodzić na wszystkie kościste krawędzie miejsca kraniotomii. Następnie przykryj przeszczep sterylnym kawałkiem nitrylu. Zapobiega to przyleganiu skóry do przeszczepu podczas gojenia.
W razie potrzeby przyciąć nadmiar błony i unikać wszelkich ruchów nitrylu po zetknięciu się z przeszczepem. Następnie zamknij skórę szwem i pozwól myszy dojść do siebie przez trzy do siedmiu dni przed przejściem do następnego kroku. Upewnij się, że wykonywane są odpowiednie zabiegi pooperacyjne i regularnie podawane są leki przeciwbólowe w celu dozowania zwierzęcia.
Po zabezpieczeniu znieczulonej myszy w ramie stereotaktycznej należy przeciąć szew nożyczkami i usunąć nadmiar skóry wokół czaszki. Usuń barierę nitrylową i oczyść powierzchnię czaszki. Użyj sterylnych wacików z solą fizjologiczną i bawełnianymi wacikami, aby oczyścić obszar, aż przeszczep będzie widoczny.
Może być konieczne przecięcie przeszczepu brzytwą, jeśli rośnie on większy niż pożądana powierzchnia. Następnie umieść studzienkę nad przeszczepem, tak aby krawędzie stykały się z czaszką. Następnie nałóż klej cyjanoakrylowy na styku studni i czaszki.
Napełnij studzienkę sterylną solą fizjologiczną i sprawdź, czy nie ma wycieków. Następnie nałóż cement na czaszkę, aby zabezpieczyć studnię na miejscu. Następnie usuń sól fizjologiczną ze studzienki za pomocą pipety.
Umyj studzienkę kilka razy, aby sprawdzić, czy klej nie wyciekł do środka. Następnie dodaj 50 mikrolitrów dekstranu fluorescencyjnego. Zakryj górną część studzienki za pomocą okrągłego kawałka nitrylu przymocowanego do góry klejem cyjanoakrylowym i upewnij się, że klej nie styka się z zawartością studzienki.
Po upływie pożądanego czasu należy poddać zwierzę eutanazji i usunąć implant oraz mózg. Uważaj, aby utrzymać przeszczep na miejscu. Po wyjęciu flashuj, zamroź mózg W roztworze izobutanu schłodzonym w suchej kąpieli lodowej zanurz mózg w roztworze OCT i pokrój na 50 mikrometrów.
Umieść żądane plasterki bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym. Następnie zobrazuj plasterek za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, gdy tylko roztwór OCT wyschnie. Jest to fluorescencyjny obraz mikroskopowy wycinka mózgu myszy po podaniu przezśluzówkowym.
Po 40 kilodaltonach tetraetylu Rumine sprzężonym z dekstranem przez 24 godziny, przeszczep błony śluzowej jest widoczny na powierzchni mózgu. Po opanowaniu tej techniki powinno zająć łącznie cztery godziny czasu operacji, aby wykonać ją prawidłowo. Po obejrzeniu tego filmu powinno być w stanie wyizolować przegrodę nosową i przenieść błonę śluzówkową przez miejsce kraniotomii w celu dostarczenia leku do mózgu.
