Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through <em>In utero</em> Electroporation

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

University of Heidelberg 

Pax6 transcription factor is required for islet cell number, morphology, and hormone gene expression. The perinatal lethality of Pax6 null mutants has restricted investigation of the role of Pax6 in normal endocrine cell function. Therefore, we devised the conditional inactivation of Pax6 using the Pdx1 and Pax6 regulatory domains to activate Cre in cells of either the entire pancreatic bud or only in endocrine cell lineages, respectively. Mutant pups died few days after birth, suffering from an overt diabetic phenotype that includes hyperglycemia, hypoinsulinemia, weight loss, and ketosis, indicating an essential role for Pax6 in beta cell function. Glucose-transporter type-2 expression was downregulated, but expression of several transcription factors essential for endocrine development was maintained. Our findings support a role for Pax6 activity in maintaining normal beta cell function after birth, but not for beta cell neogenesis during late embryonic development and early postnatal stages.

Conditional inactivation of Pax6 in the pancreas causes early onset of diabetes.

Facteur de transcription Pax6 est n&eacute;cessaire pour le nombre de cellules d&#39;&icirc;lot, morphologie et expression de g&egrave;ne de l&#39;hormone. La l&eacute;talit&eacute; p&eacute;rinatale de Pax6 mutants nuls a restreint l&#39;&eacute;tude du r&ocirc;le de Pax6 en fonction des cellules endocriniennes normales. Par cons&eacute;quent, nous avons con&ccedil;u l&#39;inactivation conditionnelle de Pax6 utilisant les domaines r&eacute;glementaires Pdx1 et Pax6 pour activer la Cre dans les cellules du bourgeon pancr&eacute;atique soit enti&egrave;re ou seulement dans des lign&eacute;es de cellules endocrines, respectivement. Pup mutant mourut quelques jours apr&egrave;s la naissance, souffrant d&#39;un ph&eacute;notype diab&eacute;tique Patent qui inclut une hyperglyc&eacute;mie, hypoinsulin&eacute;mie, perte de poids et la c&eacute;tose, indiquant un r&ocirc;le essentiel pour Pax6 en fonction des cellules b&ecirc;ta. Expression de type 2 de transporteur de glucose a &eacute;t&eacute; diminu&eacute;e, mais l&#39;expression de plusieurs facteurs de transcription essentiels pour le d&eacute;veloppement de syst&egrave;me endocrinien a &eacute;t&eacute; maintenue. Nos r&eacute;sultats supportent un r&ocirc;le pour l&#39;activit&eacute; de Pax6 dans le maintien de la fonction cellulaire b&ecirc;ta normale apr&egrave;s la naissance, mais pas pour les cellules b&ecirc;ta neogenesis durant le d&eacute;veloppement embryonnaire fin et d&eacute;but postnatal.

Inactivation conditionnelle de Pax6 dans le pancr&eacute;as provoque l&#39;apparition pr&eacute;coce du diab&egrave;te.

Fattore di trascrizione di PAX6 &egrave; richiesto per islet cell numero, morfologia ed espressione del gene dell&#39;ormone. La mortalit&agrave; perinatale di Pax6 null mutanti ha limitato indagine del ruolo di Pax6 nella funzione normale delle cellule endocrine. Pertanto, abbiamo ideato l&#39;inattivazione condizionale di Pax6 utilizzando i domini Pdx1 e Pax6 normativi per attivare Cre in cellule di entrambi il germoglio pancreatico intero o solo in linee cellulari endocrini, rispettivamente. Cuccioli mutanti morirono pochi giorni dopo la nascita, soffrono di un fenotipo diabetico palese che include iperglicemia, hypoinsulinemia, perdita di peso e chetosi, indicando un ruolo essenziale per Pax6 nella funzione delle cellule beta. Espressione di tipo 2 del trasportatore di glucosio era downregolata, ma espressione di diversi fattori di trascrizione essenziale per sviluppo endocrino &egrave; stato mantenuto. I nostri risultati supportano un ruolo per attivit&agrave; di Pax6 nel mantenimento della funzione delle cellule beta normale dopo la nascita, ma non per beta cell neogenesis durante lo sviluppo embrionale tardo e prime fasi postnatali.

Inattivazione condizionale di Pax6 nel pancreas provoca precoce insorgenza del diabete.

Automated in situ hybridization enables the construction of comprehensive atlases of gene expression patterns in mammals. Such atlases can become Web-searchable digital expression maps of individual genes and thus offer an entryway to elucidate genetic interactions and signaling pathways. Towards this end, an atlas housing approximately 1,000 spatial gene expression patterns of the midgestation mouse embryo was generated. Patterns were textually annotated using a controlled vocabulary comprising >90 anatomical features. Hierarchical clustering of annotations was carried out using distance scores calculated from the similarity between pairs of patterns across all anatomical structures. This process ordered hundreds of complex expression patterns into a matrix that reflects the embryonic architecture and the relatedness of patterns of expression. Clustering yielded 12 distinct groups of expression patterns. Because of the similarity of expression patterns within a group, members of each group may be components of regulatory cascades. We focused on the group containing Pax6, an evolutionary conserved transcriptional master mediator of development. Seventeen of the 82 genes in this group showed a change of expression in the developing neocortex of Pax6-deficient embryos. Electromobility shift assays were used to test for the presence of Pax6-paired domain binding sites. This led to the identification of 12 genes not previously known as potential targets of Pax6 regulation. These findings suggest that cluster analysis of annotated gene expression patterns obtained by automated in situ hybridization is a novel approach for identifying components of signaling cascades.

Regulatory pathway analysis by high-throughput in situ hybridization.

L&#39;hybridation in situ automatis&eacute;e permet la construction d&#39;Atlas complets des profils d&#39;expression g&eacute;nique chez les mammif&egrave;res. Ces Atlas peuvent devenir Web consultable cartes num&eacute;riques d&#39;expression de g&egrave;nes individuels et ainsi offrir une porte d&#39;entr&eacute;e afin d&#39;&eacute;lucider les interactions g&eacute;n&eacute;tiques et voies de signalisation. &Agrave; cette fin, un atlas abritant environ 1 000 mod&egrave;les d&#39;expression de g&egrave;ne spatiale de l&#39;embryon de souris il a &eacute;t&eacute; g&eacute;n&eacute;r&eacute;. Mod&egrave;les ont &eacute;t&eacute; annot&eacute;s textuellement en utilisant un vocabulaire contr&ocirc;l&eacute; comprenant &gt; 90 caract&eacute;ristiques anatomiques. Regroupement hi&eacute;rarchique des annotations a &eacute;t&eacute; r&eacute;alis&eacute;e &agrave; l&#39;aide des scores de distance calcul&eacute;es &agrave; partir de la similitude entre les paires de mod&egrave;les dans l&#39;ensemble de toutes les structures anatomiques. Ce processus a ordonn&eacute; &agrave; des centaines de mod&egrave;les d&#39;expressions complexes dans une matrice qui refl&egrave;te l&#39;architecture embryonnaire et la parent&eacute; des modes d&#39;expression. Regroupement a donn&eacute; 12 groupes distincts des mod&egrave;les d&#39;expression. En raison de la similitude des mod&egrave;les d&#39;expression au sein d&#39;un groupe, les membres de chaque groupe peuvent &ecirc;tre composants de cascades r&eacute;glementaires. Nous nous sommes concentr&eacute;s sur le groupe contenant Pax6, un m&eacute;diateur de ma&icirc;tre transcription conserv&eacute; &eacute;volutif du d&eacute;veloppement. Dix-sept des 82 g&egrave;nes dans ce groupe a montr&eacute; un changement d&#39;expression dans le n&eacute;ocortex en d&eacute;veloppement des embryons de Pax6 d&eacute;ficient. &Eacute;lectromobilit&eacute; Maj essais ont &eacute;t&eacute; utilis&eacute;s pour tester la pr&eacute;sence de sites de liaison domaine Pax6 appari&eacute;s. Cela a conduit &agrave; l&#39;identification de 12 g&egrave;nes pas pr&eacute;c&eacute;demment connu comme cibles potentielles du r&egrave;glement Pax6. Ces r&eacute;sultats sugg&egrave;rent que l&#39;analyse des mod&egrave;les d&#39;expression de g&egrave;nes annot&eacute;s obtenue par hybridation in situ automatis&eacute;e est une nouvelle approche pour identifier les composants des cascades de signalisation.

Analyse du processus r&eacute;glementaire par hybridation in situ de haut d&eacute;bit.

Automatizzato l&#39;ibridazione in situ consente la realizzazione di atlanti complete dei pattern di espressione genica in mammiferi. Tali atlanti possono diventare Web-searchable mappe digitali espressione dei singoli geni e quindi offrire un ingresso per delucidare le interazioni genetiche e vie di segnalazione. A tal fine, &egrave; stato generato un atlante ospita circa 1.000 spaziale gene modelli di espressione dell&#39;embrione del mouse midgestation. Modelli erano testualmente annotati utilizzando un vocabolario controllato composto da &amp;gt; 90 caratteristiche anatomiche. Clustering gerarchico delle annotazioni &egrave; stata effettuata utilizzando gol di distanza calcolata dalla somiglianza tra le coppie di modelli in tutte le strutture anatomiche. Questo processo ordinato centinaia di modelli di espressione complessa in una matrice che riflette l&#39;architettura embrionale e la parentela di pattern di espressione. Clustering ceduto 12 gruppi distinti di modelli di espressione. A causa della somiglianza dei pattern di espressione all&#39;interno di un gruppo, i membri di ciascun gruppo possono essere componenti della regolamentazione cascades. Ci siamo concentrati sul gruppo contenente Pax6, un evolutivo transcriptional conservato master mediatore di sviluppo. Diciassette dei 82 geni in questo gruppo ha mostrato un cambiamento di espressione nella neocorteccia in via di sviluppo degli embrioni di Pax6-carenti. Elettromobilit&agrave; shift i dosaggi sono stati utilizzati per verificare la presenza di siti di legame del dominio Pax6-accoppiato. Questo ha portato all&#39;identificazione di 12 geni non precedentemente noto come potenziali obiettivi del regolamento Pax6. Questi risultati suggeriscono che la cluster analysis dei modelli di espressione del gene annotata ottenuti tramite l&#39;ibridazione in situ automatizzato &egrave; un nuovo approccio per identificare i componenti di cascate di segnalazione.

Analisi del percorso normativo di ibridazione in situ di alto-rendimento.

We have knocked-in Cre-IRES-EGFP in the Foxb1 locus by homologous recombination in embryonic stem cells. We removed the PGK-neo cassette (which was flanked by FRT sequences) by crossing with the FLPeR deleter mouse. The Foxb1(Cre) line showed Cre recombinase activity as well as EGFP fluorescence reproducing Foxb1 expression accurately. By crossing Foxb1(Cre) mice with the ROSA26R and Z/AP mouse reporter lines we have been able to trace the lineage of Foxb1-expressing cells. Early transient expression of Foxb1 in the paraxial mesoderm translates into labeling of the somites. In the central nervous system (CNS), the Foxb1 lineage includes the thalamus and mammillary body (hypothalamus), brainstem, and the ventral spinal cord and floor plate.

Foxb1-driven Cre expression in somites and the neuroepithelium of diencephalon, brainstem, and spinal cord.

Nous avons frapp&eacute; &agrave; Cre-IRES-EGFP dans le locus Foxb1 par recombinaison homologue dans les cellules souches embryonnaires. Nous avons supprim&eacute; la cassette PGK-n&eacute;o (qui &eacute;tait flanqu&eacute;e par des s&eacute;quences FRT) par croisement avec la souris de deleter FLPeR. La ligne Foxb1(Cre) a montr&eacute; l&#39;activit&eacute; recombinase Cre ainsi que fluorescence EGFP reproduisant l&#39;expression Foxb1 avec pr&eacute;cision. En croisant des souris Foxb1(Cre) avec les lignes de journaliste de souris ROSA26R et Z/AP, nous avons &eacute;t&eacute; en mesure de remonter la lign&eacute;e de cellules exprimant Foxb1. Expression transitoire au d&eacute;but de Foxb1 dans le m&eacute;soderme paraxial traduit par &eacute;tiquetage des somites. Dans le syst&egrave;me nerveux central (SNC), la lign&eacute;e de Foxb1 comprend le thalamus et corps mamillaires (hypothalamus), tronc c&eacute;r&eacute;bral et la moelle &eacute;pini&egrave;re ventrale et plaque de sol.

Pilot&eacute;e par Foxb1 Cre expression dans les somites et le neuro&eacute;pith&eacute;lium du dienc&eacute;phale, tronc c&eacute;r&eacute;bral et la moelle &eacute;pini&egrave;re.

Noi abbiamo bussato in Cre-IRES-EGFP nel locus Foxb1 di ricombinazione omologa in cellule staminali embrionali. Abbiamo rimosso la cassetta PGK-neo (che era fiancheggiata da sequenze FRT) dall&#39;incrocio con il mouse deleter FLPeR. La linea Foxb1(Cre) ha mostrato attivit&agrave; ricombinasi Cre come fluorescenza EGFP riproduce accuratamente Foxb1 espressione. Incrociando topi Foxb1(Cre) con le linee di reporter del mouse ROSA26R e Z/AP siamo stati in grado di tracciare il lignaggio di cellule che esprimono Foxb1. Precoce espressione transitoria di Foxb1 nel mesoderma parassiale si traduce in etichettatura dei somiti. Nel sistema nervoso centrale (CNS), il lignaggio di Foxb1 include il talamo e mammillary corpo (ipotalamo), tronco encefalico e il ventrale del midollo spinale e piatto piano.

Foxb1-driven Cre espressione in somiti e il neuroepithelium del diencefalo, del tronco cerebrale e del midollo spinale.

L&#39;hypothalamus est une r&eacute;gion du cerveau avec les fonctions vitales, et son d&eacute;veloppement peut causer des maladies humaines. Cependant, nous n&#39;avons toujours pas une description compl&egrave;te de la fa&ccedil;on dont cette structure complexe est remont&eacute;e stades embryonnaires et d&eacute;but postnatal. Radialement orient&eacute;e, ext&eacute;rieur-int&eacute;rieur la migration des cellules est r&eacute;pandue dans l&#39;hypothalamus en d&eacute;veloppement. Malgr&eacute; cela, la cellule contingents venus en dehors de l&#39;hypothalamus ainsi que migrations hypothalamiques tangentielles ont &eacute;galement un r&ocirc;le important. Ici, nous &eacute;tudions les migrations dans le primordium hypothalamique par marquage g&eacute;n&eacute;tiquement la lign&eacute;e dienc&eacute;phale Foxb1. Foxb1 est un g&egrave;ne de facteur de transcription exprim&eacute;es dans le neuro&eacute;pith&eacute;lium du tube neural en d&eacute;veloppement avec la limite entre le dienc&eacute;phale caudale et rostrale rostrale expression et par cons&eacute;quent appropri&eacute; pour le marquage des migrations &agrave; partir des niveaux caudales dans l&#39;hypothalamus. Nous avons trouv&eacute; un flux de migration importante, orient&eacute;es longitudinalement, apparemment originaire de la r&eacute;gion thalamique et suite &agrave; un bundle axonale pour mettre fin &agrave; la partie ant&eacute;rieure de l&#39;aire hypothalamique lat&eacute;rale. En outre, nous avons cartographi&eacute; une expansion sp&eacute;cifique du neuro&eacute;pith&eacute;lium dans le dienc&eacute;phale rostral. Le neuro&eacute;pith&eacute;lium &eacute;largi g&eacute;n&egrave;re des neurones abondantes pour l&#39;hypothalamus m&eacute;dial au niveau un. Enfin, nous avons d&eacute;couvert les nouvelles migrations de dienc&eacute;phale-&agrave;-t&eacute;lenc&eacute;phale dans septum, cortex piriforme et l&#39;amygdale.

La cartographie g&eacute;n&eacute;tique de la lign&eacute;e de cellules Foxb1 montre la migration du dienc&eacute;phale caudale vers t&eacute;lenc&eacute;phale et hypothalamus lat&eacute;ral.

The hypothalamus is a brain region with vital functions, and alterations in its development can cause human disease. However, we still do not have a complete description of how this complex structure is put together during embryonic and early postnatal stages. Radially oriented, outside-in migration of cells is prevalent in the developing hypothalamus. In spite of this, cell contingents from outside the hypothalamus as well as tangential hypothalamic migrations also have an important role. Here we study migrations in the hypothalamic primordium by genetically labeling the Foxb1 diencephalic lineage. Foxb1 is a transcription factor gene expressed in the neuroepithelium of the developing neural tube with a rostral expression boundary between caudal and rostral diencephalon, and therefore appropriate for marking migrations from caudal levels into the hypothalamus. We have found a large, longitudinally oriented migration stream apparently originating in the thalamic region and following an axonal bundle to end in the anterior portion of the lateral hypothalamic area. Additionally, we have mapped a specific expansion of the neuroepithelium into the rostral diencephalon. The expanded neuroepithelium generates abundant neurons for the medial hypothalamus at the tuberal level. Finally, we have uncovered novel diencephalon-to-telencephalon migrations into septum, piriform cortex and amygdala.

Genetic mapping of Foxb1-cell lineage shows migration from caudal diencephalon to telencephalon and lateral hypothalamus.

L&#39;ipotalamo &egrave; una regione del cervello con funzioni vitali, e alterazioni nel suo sviluppo possono causare la malattia umana. Tuttavia, ancora non abbiamo una descrizione completa di come questa struttura complessa &egrave; messo insieme in fase embrionale e precoce postnatale. Orientati radialmente, outside-in migrazione delle cellule &egrave; prevalente nell&#39;ipotalamo in via di sviluppo. Ci&ograve; nonostante, cell contingenti da fuori l&#39;ipotalamo cos&igrave; come tangenziali ipotalamiche migrazioni hanno anche un ruolo importante. Qui studiamo le migrazioni nei primordi dell&#39;ipotalamo etichettando geneticamente il lignaggio Diencefalica Foxb1. Foxb1 &egrave; un gene del fattore di trascrizione espresso in neuroepithelium del tubo neurale in via di sviluppo con un limite di espressione rostrale tra diencefalo rostrale e caudale e pertanto appropriato per la marcatura di migrazioni da livelli caudale nell&#39;ipotalamo. Abbiamo trovato un flusso orientato longitudinalmente, grande migrazione apparentemente originarie della regione talamica e a seguito di un bundle assonale alla fine nella parte anteriore dell&#39;area ipotalamica laterale. Inoltre, noi abbiamo mappato una specifica espansione del neuroepithelium in diencefalo rostrale. Il neuroepithelium espanso genera abbondanti neuroni per l&#39;ipotalamo mediale a livello tuberal. Infine, noi abbiamo scoperto romanzo diencefalo-telencefalo migrazioni nel setto, amigdala e corteccia piriforme.

Mappatura genetica del lignaggio Foxb1-cella Mostra migrazione dal diencefalo caudale al telencefalo e ipotalamo laterale.

The specification of the intricate neuronal assemblies that characterize the forebrain is not well understood. The ventral spinal cord is specified through a concentration gradient of Sonic hedgehog (Shh) protein secreted by the notochord. Shh is expressed also in the forebrain neuroepithelium (neural Shh) and the underlying notochord and prechordal plate. Neural Shh is essential for the development of the prethalamus (ventral thalamus), but its effects on the thalamus (dorsal thalamus) are still unclear. We hypothesized that neural Shh would act on a previously regionalized dorsal diencephalic region to promote the emergence of specific thalamic nuclear and histological traits. To find out, we generated a conditional mouse mutant line specifically lacking Shh expression in the diencephalic neuroepithelium. We show that the transcription factor Gbx2, required for thalamic development downstream Shh, is expressed in our mutant in a restricted thalamic region and is necessary and sufficient for the differentiation of the medial and intralaminar thalamic nuclei. In the rest of the thalamus, neural Shh is required to promote neuronal aggregation into nuclei as well as axonal extension. In this way, the individual thalamic nuclei show differential dependence on Shh, Gbx2, or both for their differentiation. Additionally, Gbx2 is required for the survival of thalamic neurons.

The role of Sonic hedgehog of neural origin in thalamic differentiation in the mouse.

La sp&eacute;cification des assembl&eacute;es neuronales complexes qui caract&eacute;risent le cerveau ant&eacute;rieur n&#39;est pas bien comprise. La moelle &eacute;pini&egrave;re ventrale est sp&eacute;cifi&eacute;e par un gradient de concentration de la prot&eacute;ine Sonic hedgehog (Shh) s&eacute;cr&eacute;t&eacute;e par la notochorde. SHH s&#39;exprime &eacute;galement dans le neuro&eacute;pith&eacute;lium du cerveau (neurones Shh) et la notochorde sous-jacente et la plaque prechordal. Neural Shh est essentielle pour le d&eacute;veloppement de la prethalamus (thalamus ventrale), mais ses effets sur le thalamus (thalamus dorsal) sont encore peu clairs. Nous avons &eacute;mis l&#39;hypoth&egrave;se que Shh neural agirait sur une r&eacute;gion dienc&eacute;phale dorsale pr&eacute;c&eacute;demment r&eacute;gionalis&eacute;e pour favoriser l&#39;&eacute;mergence des traits sp&eacute;cifiques de nucl&eacute;aires et histologiques thalamiques. Pour en savoir, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; une lign&eacute;e mutante conditionnelle souris manquant sp&eacute;cifiquement l&#39;expression Shh dans le dienc&eacute;phale neuro&eacute;pith&eacute;lium. Nous montrons que le facteur de transcription Gbx2, n&eacute;cessaire pour le d&eacute;veloppement thalamique en aval Shh, s&#39;exprime dans notre mutant dans une r&eacute;gion restreinte thalamique et est n&eacute;cessaire et suffisant pour la diff&eacute;renciation des noyaux thalamiques m&eacute;diaux et intralaminaires. Dans le reste du thalamus, neural Shh est n&eacute;cessaire pour promouvoir l&#39;agr&eacute;gation neuronale en noyaux comme extension axonale. De cette fa&ccedil;on, les noyaux thalamiques individuels montrent diff&eacute;rentielle d&eacute;pendent de Shh Gbx2 ou/et de leur diff&eacute;renciation. En outre, Gbx2 est n&eacute;cessaire pour la survie des neurones thalamiques.

Le r&ocirc;le de Sonic hedgehog d&#39;origine neurale dans thalamique diff&eacute;renciation chez la souris.

La specifica delle assemblee neuronali intricate che caratterizzano il proencefalo non &egrave; ben compreso. Il midollo spinale ventrale viene specificato mediante un gradiente di concentrazione di proteina di Sonic hedgehog (Shh) secernuto dalla notocorda. Shh &egrave; espresso anche il proencefalo neuroepithelium (Shh neurale) sottostante notocorda e piastra prechordal. Shh neurale &egrave; essenziale per lo sviluppo di prethalamus (talamo ventrale), ma i suoi effetti sul talamo (talamo dorsale) sono ancora poco chiari. Abbiamo ipotizzato che Shh neurale agirebbe su una precedentemente regionalizzata regione Diencefalica dorsale per promuovere l&#39;emergere di specifici tratti talamiche nucleare e istologiche. Per scoprirlo, abbiamo generato una linea mutante del mouse condizionali specificamente carente espressione di Shh nel neuroepithelium Diencefalica. Dimostriamo che il fattore di trascrizione Gbx2, necessaria per lo sviluppo talamico a valle Shh, &egrave; espressa nel nostro mutante in una ristretta regione talamica ed &egrave; necessario e sufficiente per la differenziazione dei nuclei talamici mediale e intralaminari. Nel resto del talamo, Shh neurale &egrave; necessaria per promuovere l&#39;aggregazione neuronale in nuclei cos&igrave; come estensione assonale. In questo modo, i singoli nuclei talamici mostrano dipendenza differenziale Shh, Gbx2 o entrambi per la loro differenziazione. Inoltre, Gbx2 &egrave; necessaria per la sopravvivenza dei neuroni talamici.

Il ruolo di Sonic hedgehog di origine neurale nella differenziazione talamico nel topo.

The hypothalamus is a region of the diencephalon with particularly complex patterning. Sonic hedgehog (Shh), encoding a protein with key developmental roles, shows a peculiar and dynamic diencephalic expression pattern. Here, we use transgenic strategies and in vitro experiments to test the hypothesis that Shh expressed in the diencephalic neuroepithelium (neural Shh) coordinates tissue growth and patterning in the hypothalamus. Our results show that neural Shh coordinates anteroposterior and dorsoventral patterning in the hypothalamus and in the diencephalon-telencephalon junction. Neural Shh also coordinates mediolateral hypothalamic patterning, since it is necessary for the lateral hypothalamus to attain proper size and is required for the specification of hypocretin/orexin cells. Finally, neural Shh is necessary to maintain expression of differentiation markers including survival factor Foxb1.

Role of neuroepithelial Sonic hedgehog in hypothalamic patterning.

L&#39;hypothalamus est une r&eacute;gion du dienc&eacute;phale avec structuration particuli&egrave;rement complexe. Sonic hedgehog (Shh), codant pour une prot&eacute;ine avec des r&ocirc;les cl&eacute;s du d&eacute;veloppement, pr&eacute;sente un mod&egrave;le d&#39;expression dienc&eacute;phale particuli&egrave;re et dynamique. Ici, nous utilisons des strat&eacute;gies transg&eacute;niques et des exp&eacute;riences in vitro pour tester l&#39;hypoth&egrave;se selon laquelle Shh exprim&eacute;e dans le dienc&eacute;phale neuro&eacute;pith&eacute;lium (neural Shh) coordonne le d&eacute;veloppement tissulaire et la structuration dans l&#39;hypothalamus. Nos r&eacute;sultats montrent que Shh neural coordonne ant&eacute;ro-post&eacute;rieure et le patterning dorsoventral dans l&#39;hypothalamus et dans la jonction du dienc&eacute;phale-t&eacute;lenc&eacute;phale. Shh neural coordonne m&eacute;diolat&eacute;rale le patterning hypothalamique, puisqu&#39;il est n&eacute;cessaire que l&#39;hypothalamus lat&eacute;ral atteindre une taille appropri&eacute;e et est requis par la sp&eacute;cification des cellules de l&#39;hypocr&eacute;tine/orexine. Enfin, neural Shh est n&eacute;cessaire pour maintenir l&#39;expression des marqueurs de diff&eacute;renciation dont le facteur de survie Foxb1.

R&ocirc;le de neuro-&eacute;pith&eacute;liale Sonic hedgehog en structuration hypothalamique.

L&#39;ipotalamo &egrave; una regione del diencefalo con patterning particolarmente complessi. Sonic hedgehog (Shh), codifica per una proteina con ruoli chiave dello sviluppo, mostra un modello dinamico e peculiare espressione Diencefalica. Qui, usiamo strategie transgenici e gli esperimenti in vitro per testare l&#39;ipotesi che Shh espressa nel Diencefalica neuroepithelium (Shh neurale) coordina la crescita dei tessuti e patterning nell&#39;ipotalamo. I nostri risultati mostrano che Shh neurale coordinate anteroposteriore e patterning dorsoventral nell&#39;ipotalamo e nella giunzione telencefalo diencefalo. Shh neurali anche coordina mediolaterale ipotalamico creazione, poich&eacute; &egrave; necessario che l&#39;ipotalamo laterale raggiungere dimensioni adeguate ed &egrave; necessaria per la specifica delle cellule orexina/ipocretina. Infine, Shh neurale &egrave; necessario mantenere espressione di marcatori di differenziazione tra cui fattore di sopravvivenza Foxb1.

Ruolo di Sonic hedgehog neuroepithelial nel patterning ipotalamico.

Polycomb proteins are epigenetic regulators of gene expression. Human central nervous system (CNS) malformations are congenital defects of the brain and spinal cord. One example of a human CNS malformation is Chiari malformation (CM), which presents as abnormal brainstem growth and cerebellar herniation, sometimes accompanied by spina bifida and cortical defects; it can occur in families. Clinically, CM ranges from an asymptomatic condition to one with incapacitating or lethal symptoms, including neural tube defects and hydrocephalus. However, no genes that are causally involved in any manifestation of CM or similar malformations have been identified. Here, we show that a pathway that involves Zac1 (also known as Plagl1 or Lot1) and controls neuronal proliferation is altered in mice that are heterozygous for the polycomb gene Suz12, resulting in a phenotype that overlaps with some clinical manifestations of the CM spectrum. Suz12 heterozygotes show cerebellar herniation and an enlarged brainstem, accompanied by occipital cortical alterations and spina bifida. Downward displacement of the cerebellum causes hydrocephalus in the most severely impaired cases. Although the involvement of polycomb genes in human disease is starting to be recognized, this is the first demonstration of their role in nervous system malformations. Our work strongly suggests that brain malformations such as CM can result from altered epigenetic regulation of genes involved in cell proliferation in the brain.

Haploinsufficiency of the murine polycomb gene Suz12 results in diverse malformations of the brain and neural tube.

Prot&eacute;ines Polycomb sont des r&eacute;gulateurs &eacute;pig&eacute;n&eacute;tiques de l&#39;expression g&eacute;nique. Des malformations du syst&egrave;me nerveux central (CNS) humaine sont des malformations cong&eacute;nitales du cerveau et la moelle &eacute;pini&egrave;re. Un exemple d&#39;une malformation humaine de CNS est une malformation de Chiari (CM), qui se pr&eacute;sente comme la croissance du tronc c&eacute;r&eacute;bral anormal et hernie c&eacute;r&eacute;belleuse, parfois accompagn&eacute;es de spina bifida et les anomalies corticales ; Il peut se produire dans les familles. Sur le plan clinique, CM varie d&#39;une condition asymptomatique &agrave; l&#39;un des sympt&ocirc;mes invalidantes ou mortelles, y compris les anomalies du tube neural et l&#39;hydroc&eacute;phalie. Toutefois, aucun g&egrave;ne causal impliqu&eacute;s dans toute manifestation de CM ou des malformations semblables n&#39;ont &eacute;t&eacute; identifi&eacute;s. Ici, nous montrons qu&#39;une voie qui implique la Zac1 (&eacute;galement connu comme Plagl1 ou Lot1) et contr&ocirc;le de la prolif&eacute;ration neuronale est alt&eacute;r&eacute;e chez les souris qui sont h&eacute;t&eacute;rozygotes pour le g&egrave;ne polycomb Suz12, ce qui entra&icirc;ne un ph&eacute;notype qui fait double emploi avec certaines manifestations cliniques du spectre CM. Suz12 h&eacute;t&eacute;rozygotes montrent hernie c&eacute;r&eacute;belleuse et un tronc c&eacute;r&eacute;bral &eacute;largi, accompagn&eacute;e d&#39;alt&eacute;rations corticales occipitales et le spina bifida. D&eacute;placement vers le bas du cervelet entra&icirc;ne l&#39;hydroc&eacute;phalie dans les cas plus gravement alt&eacute;r&eacute;es. Bien que l&#39;implication des g&egrave;nes polycomb dans la maladie humaine commence &agrave; &ecirc;tre reconnu, c&#39;est la premi&egrave;re d&eacute;monstration de leur r&ocirc;le dans des malformations du syst&egrave;me nerveux. Notre travail sugg&egrave;re fortement que malformations du cerveau telles que CM peut r&eacute;sulter de modifi&eacute; r&eacute;gulation &eacute;pig&eacute;n&eacute;tique des g&egrave;nes impliqu&eacute;s dans la prolif&eacute;ration des cellules dans le cerveau.

Sim1 du g&egrave;ne murin polycomb Suz12 se traduit par diverses malformations du cerveau et du tube neural.

Proteine Polycomb sono regolatori epigenetici dell&#39;espressione genica. Malformazioni umane del sistema nervoso centrale (SNC) sono difetti congeniti del cervello e del midollo spinale. Un esempio di una malformazione umana CNS &egrave; la malformazione di Chiari (CM), che presenta come crescita anormale del tronco cerebrale e cerebellare ernia, a volte accompagnati da spina bifida e difetti corticali; pu&ograve; verificarsi in famiglie. Clinicamente, CM varia da una condizione asintomatica ad uno con sintomi invalidante o mortali, compresi i difetti del tubo neurale e l&#39;idrocefalo. Tuttavia, nessun gene causale coinvolti in qualsiasi manifestazione di CM o malformazioni simili sono stato identificato. Qui, ci mostra che un percorso che coinvolge Zac1 (anche conosciuto come Plagl1 o Lot1) e controlla la proliferazione neuronale &egrave; alterato in topi che sono eterozigoti per il gene polycomb Suz12, risultante in un fenotipo che si sovrappone con alcune manifestazioni cliniche dello spettro CM. Suz12 eterozigoti mostrano erniazione cerebellare e un tronco encefalico allargata, accompagnata da alterazioni corticali occipitali e la spina bifida. Spostamento verso il basso del cervelletto provoca Idrocefalo nei casi pi&ugrave; gravemente compromessa. Anche se il coinvolgimento dei geni polycomb nella malattia umana sta cominciando ad essere riconosciuto, questa &egrave; la prima dimostrazione del loro ruolo nelle malformazioni del sistema nervoso. Il nostro lavoro suggerisce fortemente che le malformazioni cerebrali come CM pu&ograve; derivare da alterata regolazione epigenetica di geni coinvolti nella proliferazione delle cellule nel cervello.

Aploinsufficienza del gene murino polycomb Suz12 risultati in diverse malformazioni del cervello e del tubo neurale.

Un ph&eacute;nom&egrave;ne essentiel pendant le d&eacute;veloppement du cerveau est l&#39;extension des branches collat&eacute;rales longtemps par les axones. Ne sait pas comment l&#39;environnement cellulaire local contribue &agrave; la germination initial de ces branches sur des points particuliers d&#39;un arbre axonal.

Interaction entre les axones et populations sp&eacute;cifiques de cellules environnantes est indispensable pour la formation de collat&eacute;rale dans le syst&egrave;me mamillaires.

Un fenomeno essenziale durante lo sviluppo del cervello &egrave; l&#39;estensione dei rami lunghi collaterale di assoni. Come l&#39;ambiente cellulare locale contribuisce per la germinazione iniziale di questi rami in punti specifici di un albero assonale rimane poco chiaro.

Interazione tra assoni e specifiche popolazioni di cellule circostanti &egrave; indispensabile per la formazione collaterale del sistema mammillary.

An essential phenomenon during brain development is the extension of long collateral branches by axons. How the local cellular environment contributes to the initial sprouting of these branches in specific points of an axonal shaft remains unclear.

Interaction between axons and specific populations of surrounding cells is indispensable for collateral formation in the mammillary system.

Surgical lesion of the suprachiasmatic nuclei (SCN) profoundly affects the circadian timing system. A complication of SCN ablations is the concomitant scission of SCN afferents and efferents. Genetic disruption of the molecular clockwork in the SCN provides a complementary, less invasive experimental approach. The authors report the generation and functional analysis of a new Cre recombinase driver mouse that evokes homologous recombination with high efficiency in the SCN. They inserted the Cre recombinase cDNA into the Synaptotagmin10 (Syt10) locus, a gene strongly expressed in the SCN. Heterozygous Synaptotagmin10-Cre (Syt10(Cre)) mice have no obvious circadian locomotor phenotype, and homozygous animals show slightly reduced light-induced phase delays. Crosses of Syt10(Cre) mice with Î²-galactosidase reporter animals revealed strong Cre activity in the vast majority of SCN cells. Cre activity is not detected in nonneuronal tissues with the exception of the testis. The authors demonstrate that conditionally deleting the clock gene Bmal1 using the Syt10(Cre) driver renders animals arrhythmic.

Synaptotagmin10-Cre, a driver to disrupt clock genes in the SCN.

L&eacute;sion chirurgicale des noyaux suprachiasmatiques (SCN) affecte profond&eacute;ment le syst&egrave;me d&#39;horloge circadienne. Une complication des ablations de SCN est la scission concomitante de SCN aff&eacute;rents et eff&eacute;rents. Perturbation g&eacute;n&eacute;tique de la m&eacute;canique mol&eacute;culaire dans le SCN fournit une compl&eacute;mentaire, moins invasive approche exp&eacute;rimentale. Les auteurs rapportent la g&eacute;n&eacute;ration et l&#39;analyse fonctionnelle d&#39;une nouvelle souris de pilote Cre recombinase qui &eacute;voque la recombinaison homologue &agrave; haut rendement dans le SCN. Ils ont ins&eacute;r&eacute; le cDNA de recombinase Cre dans le Synaptotagmin10 (Syt10) locus, un g&egrave;ne fortement exprim&eacute; dans le SCN. Synaptotagmin10-Cre h&eacute;t&eacute;rozygote (Syt10(Cre)) souris n&#39;ont aucun ph&eacute;notype locomotrice circadienne &eacute;vidente et animaux homozygotes spectacle r&eacute;duit l&eacute;g&egrave;rement les retards de phase induite par la lumi&egrave;re. Les croisements des souris Syt10(Cre) avec des animaux de journaliste de &beta;-galactosidase ont r&eacute;v&eacute;l&eacute; forte activit&eacute; de la Cre dans la grande majorit&eacute; des cellules de la SCN. Activit&eacute; de la cre n&#39;est pas d&eacute;tect&eacute;e dans les tissus neuronaux &agrave; l&#39;exception des testicules. Les auteurs montrent que conditionnellement la suppression du g&egrave;ne horloge Bmal1 utilisant le pilote Syt10(Cre) rend les animaux arythmique.

Synaptotagmin10-Cre, un pilote de perturber des g&egrave;nes de l&#39;horloge dans le SCN.

Lesione chirurgica dei nuclei suprachiasmatic (SCN) colpisce profondamente il sistema di temporizzazione circadiano. Una complicazione di ablazioni di SCN &egrave; la scissione concomitante di SCN afferenze ed efferenti. Genetica interruzione dell&#39;orologio molecolare in SCN fornisce un complementare, meno invasivo approccio sperimentale. Gli autori riportano la generazione e l&#39;analisi funzionale di un nuovo mouse driver Cre recombinase che evoca la ricombinazione omologa con alta efficienza in SCN. Hanno inserito il cDNA ricombinasi Cre il Synaptotagmin10 locus (Syt10), un gene fortemente espresso in SCN. Synaptotagmin10-Cre eterozigoti (Syt10(Cre)) topi non hanno nessun ovvio fenotipo circadiano dell&#39;apparato locomotore, e animali omozigoti Visualizza leggermente ridotto ritardi di fase luce-indotta. Croci di topi Syt10(Cre) con animali reporter di &beta;-galattosidasi rivelarono forte Cre attivit&agrave; nella maggior parte delle cellule SCN. CRE attivit&agrave; non viene rilevato nei tessuti nonneuronal con l&#39;eccezione del testicolo. Gli autori dimostrano che condizionalmente l&#39;eliminazione del gene dell&#39;orologio Bmal1 utilizzando il driver Syt10(Cre) rende gli animali aritmici.

Synaptotagmin10-Cre, un driver a disturbare i geni dell&#39;orologio in SCN.

Sonic hedgehog (Shh) signaling is essential for thalamic development. The Gli transcription factors act downstream of Shh - while Gli2 is the major activator (GliA), Gli3 acts primarily as a repressor (GliR). The thalamus is remarkable among dorsal structures because of its proximity to the mid-diencephalic organizer, a unique dorsal Shh source. This lends complexity to the interactions between Shh, Gli2, and Gli3, suggesting the presence of a dorsal Gli activator which elsewhere is found only ventrally, and making the dissection of thalamic Gli functions particularly interesting. A current model based on mutant phenotypes in telencephalon and midbrain postulates a degree of reciprocal antagonism of Shh and Gli3 in dorsal brain regions. To approach the role of Gli factors in thalamic specification we first analyzed mice deficient in Gli2 or Gli3. In Gli2 mutants, the thalamus is small and poorly differentiated with the exception of the medial and intralaminar nuclei which, in contrast, are specifically and severely affected by Gli3 inactivation. Gbx2 expression is very reduced in the Gli3 mutant. Most thalamic nuclei are present in both mutants, although incompletely differentiated, as reflected by the loss of specific markers. The ventral posterior group, revealed by novel specific marker Hes1, is present in both mutants and extends axons to the telencephalon. To test the Gli3/Shh interaction we generated a novel mutant deficient in Gli3 and neuroepithelial Shh. The thalamus of the n-Shh/Gli3 double mutants is very large and very poorly differentiated except for a broad domain of Gbx2, Lhx2, and Calb2 expression. In utero electroporation experiments on wild type embryos suggest that a stage-specific factor acting early is responsible for this prepattern. We show that, in the thalamus, GliA acts downstream of Shh to specify pattern and size of the thalamic nuclei to the exception of the medial and intralaminar groups. Gli3A can partially substitute for Gli2A in the Gli2 mutant. GliR is essential for specification and growth of the medial and intralaminar nuclei, contributes to the specification of other thalamic nuclei and reduces thalamic size. GliA (from neuroepithelial Shh signaling) and GliR do not show reciprocal antagonism in the thalamus, and their joint abolition does not rescue the wild type phenotype.

Mouse thalamic differentiation: gli-dependent pattern and gli-independent prepattern.

Signalisation de Sonic hedgehog (Shh) est essentiel pour le d&eacute;veloppement thalamique. La Loi sur des facteurs de transcription de Gli en aval de Shh - tandis que Gli2 est l&#39;activateur majeur (GliA), g&egrave;ne Gli3 agit principalement comme un r&eacute;presseur (GliR). Le thalamus est remarquable entre les structures dorsales en raison de sa proximit&eacute; avec le milieu-dienc&eacute;phale organisateur, une source unique de Shh dorsale. Ceci conf&egrave;re complexit&eacute; aux interactions entre Shh, Gli2 et g&egrave;ne Gli3, sugg&eacute;rant la pr&eacute;sence d&#39;un activateur de Gli dorsale qui ailleurs se trouve uniquement sur le ventre et rendant la dissection de thalamiques Gli fonctions particuli&egrave;rement int&eacute;ressante. Un mod&egrave;le actuel bas&eacute; sur les ph&eacute;notypes mutants dans le t&eacute;lenc&eacute;phale et le m&eacute;senc&eacute;phale postule un certain antagonisme r&eacute;ciproque de Shh et g&egrave;ne Gli3 dans des r&eacute;gions du cerveau dorsale. Pour aborder le r&ocirc;le des facteurs de Gli dans thalamique sp&eacute;cification, nous avons tout d&#39;abord analys&eacute; souris d&eacute;ficientes en Gli2 ou g&egrave;ne Gli3. Chez les mutants Gli2, le thalamus est petite et mal diff&eacute;renci&eacute;s &agrave; l&#39;exception des m&eacute;diale et intralaminaires noyaux qui, en revanche, sont sp&eacute;cifiquement et s&eacute;v&egrave;rement touch&eacute;es par l&#39;inactivation du g&egrave;ne Gli3. Expression Gbx2 est tr&egrave;s r&eacute;duite dans le mutant g&egrave;ne Gli3. Plus les noyaux thalamiques sont pr&eacute;sents dans les deux mutants, bien qu&#39;incompl&egrave;tement diff&eacute;renci&eacute;s, comme en t&eacute;moigne la perte de marqueurs sp&eacute;cifiques. Le groupe post&eacute;rieur ventral, a r&eacute;v&eacute;l&eacute; de nouveaux marqueurs sp&eacute;cifiques Hes1, est pr&eacute;sent dans les deux mutants et s&#39;&eacute;tend des axones vers le t&eacute;lenc&eacute;phale. Pour tester l&#39;interaction g&egrave;ne Gli3/Shh, nous avons g&eacute;n&eacute;r&eacute; un nouveau mutant d&eacute;ficient en g&egrave;ne Gli3 et neuro&eacute;pith&eacute;liales Shh. Le thalamus des mutants doubles g&egrave;ne n-Shh/Gli3 est tr&egrave;s grand et tr&egrave;s peu diff&eacute;renci&eacute; &agrave; l&#39;exception d&#39;un vaste domaine d&#39;expression Gbx2, Lhx2 et Calb2. &Eacute;lectroporation in utero des exp&eacute;riences sur des embryons de type sauvage sugg&egrave;rent qu&#39;un facteur sp&eacute;cifique au stade agissant au d&eacute;but est responsable de cette pr&eacute;-patron. Nous montrons que, dans le thalamus, actes de cellules gliales en aval de Shh pour sp&eacute;cifier le mod&egrave;le et la taille des noyaux thalamiques &agrave; l&#39;exception des groupes m&eacute;diale et intralaminaires. Gli3A peut remplacer partiellement Gli2A chez le mutant Gli2. GliR est essentiel pour la sp&eacute;cification et la croissance des noyaux m&eacute;diaux et intralaminaires, contribue &agrave; la sp&eacute;cification d&#39;autres noyaux thalamiques et r&eacute;duit la taille de thalamique. Cellules gliales (de neuro&eacute;pith&eacute;liales Shh signaling) et GliR ne montrent pas d&#39;antagonisme r&eacute;ciproque dans le thalamus, et leur suppression conjointe ne pas sauver le ph&eacute;notype sauvage.

Souris diff&eacute;renciation thalamique : mod&egrave;le de gli-d&eacute;pendante et ind&eacute;pendante de gli pr&eacute;-patron.

Sonic hedgehog (Shh) segnalazione &egrave; essenziale per lo sviluppo talamico. Gli trascrizione fattori atto a valle di Shh - mentre Gli2 &egrave; il principale attivatore (GliA), Gli3 agisce principalmente come un repressore (lagelig). Il talamo &egrave; notevole tra le strutture dorsali a causa della sua vicinanza all&#39;organizzatore della met&agrave;-Diencefalica, una fonte unica di Shh dorsale. Questo conferisce complessit&agrave; di interazioni tra Shh, Gli2 e Gli3, suggerendo la presenza di un attivatore Gli dorsale che altrove si trova solo ventralmente e rendendo la dissezione di talamiche Gli funzioni particolarmente interessanti. Un modello attuale basato su fenotipi mutanti nel telencefalo e il mesencefalo postula un grado di reciproco antagonismo di Shh e Gli3 in regioni del cervello dorsale. Per avvicinare il ruolo dei fattori Gli nella specifica talamica abbiamo analizzato prima topi carenti di Gli2 o Gli3. Gli2 mutanti, il talamo &egrave; piccola e scarsamente differenziato ad eccezione dei nuclei mediale e intralaminari che, al contrario, sono specificamente e gravemente risentiti Gli3 inattivazione. Gbx2 espressione &egrave; molto ridotto in Gli3 mutante. Pi&ugrave; nuclei talamici sono presenti in entrambi mutanti, anche se non completamente differenziate, come riflesso dalla perdita dei marcatori specifici. Il gruppo posteriore ventrale, rivelato da romanzo specifico marcatore Hes1, &egrave; presente in entrambi mutanti ed estende assoni al telencefalo. Per testare l&#39;interazione Gli3/Shh abbiamo generato un romanzo mutanti carenti di Gli3 e neuroepithelial Shh. Il talamo dei mutanti n-Shh/Gli3 doppie &egrave; molto grande e molto scarsamente differenziati ad eccezione di un vasto dominio di espressione Gbx2, Lhx2 e Calb2. Elettroporazione in utero esperimenti sugli embrioni di tipo selvatico suggeriscono che un fattore di fase-specifici che agiscono precocemente &egrave; responsabile per questo prepattern. Ci mostrano che, nel talamo, atti GliA a valle di Shh per specificare il modello e le dimensioni dei nuclei talamici ad eccezione dei gruppi mediale e intralaminari. Gli3A pu&ograve; sostituire parzialmente Gli2A in Gli2 mutante. Lagelig &egrave; essenziale per la crescita dei nuclei mediale e intralaminari e specifica contribuisce alla specifica di altri nuclei talamici e riduce la dimensione del talamo. GliA (da neuroepithelial Shh signaling) e lagelig non mostrano antagonismo reciproco nel talamo, e la loro abolizione congiunta non rescue il fenotipo wild type.

Xunlei Zhou

Institute of Anatomy and Cell Biology

University of Heidelberg

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Xunlei Zhou

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University of Heidelberg

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Institute of Anatomy and Cell Biology