A 96 Bem microtitulação Método da Placa com base para a Formação Monitoramento e Teste de susceptibilidade antifúngica de Candida albicans Biofilmes

Resumo

Nós descrevemos um método simples, rápido e robusto para a formação de Candida albicans Biofilmes usando 96 placas de microtitulação bem e sua utilidade em testes de susceptibilidade antifúngica de células dentro de biofilmes.

Resumo

Candida albicans continua a ser a causa mais freqüente de infecções fúngicas em uma população em expansão de pacientes comprometidos e candidíase é agora o terceiro mais comum de infecção nos hospitais dos EUA. Diferentes manifestações da candidíase são associados com a formação de biofilme, tanto em tecidos do hospedeiro e / ou dispositivos médicos (cateteres, por exemplo). Formação de biofilme carrega negativas implicações clínicas, como as células dentro do biofilme estão protegidos das respostas imune do hospedeiro e da ação de antifúngicos. Nós desenvolvemos um modelo simples, rápido e robusto in vitro para a formação de C. biofilmes albicans utilizando 96 poços de microtitulação-pratos, que também pode ser usado para testes de susceptibilidade antifúngica do biofilme. A leitura deste ensaio é colorimétrico, baseado na redução de XTT (um sal de tetrazólio) por células metabolicamente ativas biofilme fúngicas. Um experimento típico dura cerca de 24 h para a formação de biofilme, com 24 h adicionais para testes de susceptibilidade antifúngica. Devido à sua simplicidade e à utilização de materiais de laboratório comumente disponíveis e equipamento, esta técnica democratiza pesquisa biofilme e representa um passo importante para a padronização dos testes de susceptibilidade antifúngica de biofilmes de fungos.

Protocolo

1. Preparação de C. albicans

C. albicans é um microorganismo 1/BSL1 Risk Group. Lembre-se sempre ao bom uso de técnicas assépticas / estéril para trabalhar com este microorganismo e seguir os procedimentos institucionais para o descarte adequado de materiais de risco biológico.

1. Prepare uma cultura overnight de C. albicans em YPD médio (Yeast peptonada Dextrose) líquido através da inoculação de uma única colônia de C. albicans em 25 mL de YPD.
2. Incubar a cultura em um shaker orbital (cerca de 180 rpm) a 30 ° C durante a noite. Mais C. albicans cepas vai crescer como células de levedura sob essas condições.
3. Centrifugar as culturas durante a noite (cerca de 3.000 rpm, 5-10 minutos), lave as células duas vezes com PBS estéril, e ressuspender o sedimento final em cerca de 20-25 mL de meio RPMI 1640 tamponado com 165 mM de ácido morpholinepropanesulfonic a 7,0 pH e pré-aquecido a 37 ° C (a partir de agora este meio é referido simplesmente como "RPMI 1640").
4. Contagem de células utilizando um hemocitômetro. Após a contagem, prepare uma suspensão de células em uma densidade final de 1,0 x 10 ⁶ células / mL em RPMI 1640.
   Nota: Como as células têm uma tendência a se agregar, é importante vortex vigorosamente entre as lavagens e antes de pipetar.

2. Configurando o de 96 poços da placa de microtitulação para a formação do biofilme

1. Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de C. albicans suspensão em poços selecionados dos 96 poços da placa de microtitulação (-s). Não adicione células para poços na coluna 12, como estes servirão como controles negativos.
2. Cobrir a placa de microtitulação inteiro com sua tampa original, vedação com parafilme, coloque dentro de uma incubadora e incubar por 24 horas a 37 ° C. A duração da incubação pode ser adaptado para o projeto experimental específico. Por exemplo, é possível examinar a cinética de formação de biofilme ao longo de um período de 24-48 horas de semeadura placas múltiplas e processamento de cada placa em momentos diferentes (ie 2, 4, 8, 12, 24 e 48 h)
3. Após a formação de biofilme, usando uma pipeta multicanal aspirar o meio com cuidado de não tocar e interromper os biofilmes que se formaram em cada um dos poços.
4. Usando uma pipeta multicanal placas lavar três vezes em PBS estéril (200 mL por poço). Alternativamente, use uma lavadora automática de microtitulação. Entre as lavagens, e particularmente após a última lavagem, escorrer as placas em posição invertida por blotting com toalhas de papel para remover qualquer PBS residual. Neste ponto biofilmes formados no fundo dos poços deve ser claramente visível mesmo a olho nu e também pode ser visualizado através de um microscópio invertido (Figura 1). Biofilmes está agora pronto para ser processada para os testes de testes de susceptibilidade antifúngica.
   (Se o principal objetivo do experimento é avaliar a extensão da formação de biofilme, as placas estão prontas para serem processadas utilizando o método colorimétrico. Para isso, o reagente XTT / menadiona (consulte a Etapa 3 abaixo) pode ser adicionado ea cor resultante ler usando um leitor de placas de microtitulação).

3. Testes de Susceptibilidade antifúngica de Biofilmes

1. A partir de soluções estoque ou em pó, prepare uma solução de trabalho em meio RPMI 1640 de cada antifúngico a ser testado. Típico altas concentrações são 1.024 mcg / mL para fluconazol, e 16 mcg / mL para ambos anfotericina B e caspofungina. Outras concentrações podem ser usados ​​para diferentes agentes.
2. Usando uma pipeta multicanal, adicione 200 mL da alta concentração de trabalho de antifúngicos aos poços correspondentes na coluna 1 de cada placa de microtitulação contendo biofilmes de fungos.
3. Adicionar 100 mL de RPMI 1640 em cada poço nas colunas 2 a 10.
4. Adicionar 100 mL de RPMI 1640 para poços na coluna 11.
5. Remover 100 mL de agente antifúngico dos poços da coluna 1 e adicione aos poços adjacentes na coluna 2 (já contendo 100 mL de meio).
6. Misture o conteúdo bem pipetando cima e para baixo para realizar uma diluição de duplicação de série, e retire as pontas.
7. Repita se movendo para a direita até os poços da coluna 10, após o qual o volume de 100 mL finais dos poços da coluna 10 após a mistura é descartado. Desta forma, uma série de diluições de seu agente (-s) de interesse foram criados, a partir de mais concentrada em poços da coluna 1 para o menos concentrado em poços da coluna 10. Biofilmes incontestado na coluna 11 servirá como controle positivo, e poços vazios na coluna 12 servirão como controles negativos.
8. Cobrir as placas com suas tampas, vedação com parafilme e incubar por 24 -48 h a 37 ° C.
9. Após o período de incubação, lavar os pratos como na Etapa 2,4 antes (3 x PBS).
10. Usando uma pipeta multicanal adicionar 100 mL de XTT / menadiona solução para cada poço contendo um biofilme pré-lavados, bem como para poços de controlo negativo para a medição de fundo XTT-colorimétrico níveis.
    1. O XTT é preparado como uma solução saturada, 0,5 g / L de lactato Ringer estéril, a PBS ou salina, que precisa ser esterilizada por filtração, usando um filtro de 0,22 mM tamanho de poros. A solução XTT é sensível à luz, por isso deve ser coberto com papel alumínio durante a preparação. Depois de preparado e esterilizada por filtração, alíquota, em 10 mL volumes de trabalho, e armazenar a -70 ° C. Proteger os tubos de luz usando uma folha de alumínio. Descongele somente como tubos que forem necessárias para uma experiência especial pouco antes de usar.
    2. Menadiona é preparado como uma solução estoque 10 mM em acetona 100%, aliquotado em volumes menores (cerca de 50 mL) e armazenados a -70 ° C. Prepare a solução XTT / menadiona pouco antes de usar, adicionando 1 mL da solução estoque de menadiona a um tubo contendo 10 mL da solução XTT descongelado.
11. Cobrir as placas em papel alumínio e incubar no escuro por 2 h, a 37 ° C.
12. Descubra as placas. Usando uma pipeta multicanal remover 80 mL do sobrenadante resultante cor de cada bem e transferir para os poços correspondente de uma nova placa de microtitulação.
13. Leia a placa (-s) em um leitor de placas de microtitulação a 490 nm.
14. Calcular a concentração inibitória mínima sésseis SMIC50 e SMIC80, que são as concentrações antifúngicas em que uma diminuição de 50% ou 80% em leituras colorimétricas são detectados em comparação com o controle de biofilmes formados na ausência de drogas antifúngicas (neste caso, os valores para a coluna 11 , lembre-se também para subtrair valores de controles negativos de poços na coluna 12 XTT contendo apenas). SMIC resultados podem ser apresentados como uma tabela (ou seja, isola múltiplas contra antifúngicos múltipla) ou, alternativamente, os resultados individuais para cada fúngicas isolar uns contra os antifúngicos pode ser apresentado como um gráfico plotando inibição por cento versus concentração de antifúngico.

Exemplo: Depois de subtrair os valores no controle negativo, o OD média de biofilmes controle formado na coluna 11 é 1.32. O SMIC50 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução> 50% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 50/100 = 0,66. Da mesma forma, o SMIC80 é a menor concentração antifúngicos levando a uma redução> 80% em leituras colorimétricas, neste caso, menos de 1,32 x 20/100 = 0,264.

4. Resultados representante

A Figura 1 mostra uma microfotografia de um C. albicans biofilme formado no fundo de um poço em uma placa de microtitulação de 96 poços realizadas em microscópio invertido. A Figura 2 mostra XTT-colorimétrico leituras (OD ₄₉₀ valores) para cada um dos 11 biofilmes de C. albicans cepa selvagem formado em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. A Figura 3 mostra a atividade de anfotericina B em diferentes concentrações contra C. albicans biofilmes; setas indicam SMIC50 e SMIC80 valores.

Figura 1. (A) Painel A mostra uma microfotografia tiradas com uma câmera acoplada a um microscópio invertido de um C. albicans biofilme formado no fundo do poço após a aspiração de meio RPMI e lavagens subsequentes com PBS. (B) A micrografia de um típico C. albicans biofilme visualizados através de microscopia eletrônica de varredura. Barras são 100 mm e 10 mm para os painéis A e B, respectivamente.

Figura 2. Formação de múltiplas equivalente C. albicans biofilmes em placas de 96 poços de microtitulação. leituras colorimétrico (OD ₄₉₀ valores) de XTT-redução de ensaios de biofilmes formados por um C. albicans tipo selvagem em poços de placas de microtitulação. Os valores são de 11 biofilmes independente formada em cada uma das 8 linhas diferentes da mesma placa de microtitulação de 96 poços. Resultados para as linhas diferentes foram comparados por meio da análise de variância e pelo teste de Bartlett para homogeneidade de variâncias e comparação múltipla de Bonferroni pós-teste. Diferenças estatisticamente significativas foram observadas quando se comparam todos os pares de linhas entre si (P> 0,05).

Figura 3. Os resultados típicos dos testes de susceptibilidade antifúngica contra C. albicans biofilmes Gráfico. retratando os resultados típicos da eficácia de diferentes concentrações de anfotericina B contra biofilmes de C. albicans cepa selvagem. Os valores estão expressos em porcentagem média leituras colorimétrico para XTT redução de ensaios em relação ao controle de poços. SMIC50 e SMIC80 valores são indicados por setas.

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Discussão

Aqui nós descrevemos um método simples, rápido, econômico e altamente reprodutível 96 modelo da placa de microtitulação bem para a formação de biofilmes de Candida juntamente com um método colorimétrico que mede a atividade metabólica de células dentro do biofilme usando XTT. Este modelo de 96 placa de microtitulação bem para a formação de biofilme foi originalmente desenvolvido para C. albicans, mas pode ser usado para outras Candida spp. e facilmente adaptado para outros org...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sabouraud-dextrose agar	BD Biosciences	211584	To prepare plates for fresh subcultures of fungal isolates
YPD: Yeast peptone dextrose	US Biological	Y2076	Medium for propagation of overnight liquid cultures
RPMI-1640 without sodium bicarbonate supplemented with L-glutamine	Cellgro	50-020-PB	Liquid medium for biofilm formation
Morpholinepropanesulfonic acid (MOPS)	Fisher Scientific	BP308	To buffer RPMI 1640
Phosphate buffered saline, PBS	Sigma-Aldrich	P4417	Buffer for washes
XTT sodium salt	Sigma-Aldrich	X4251	See above for preparation instructions
Ringer’s lactate	Hospira Inc.	NDC0409-7953-09	For preparation of XTT solution
Menadione	Sigma-Aldrich	M5625	Caution: hazardous by skin contact, inhalation or ingestion
Petri dishes	Fisher Scientific	08-757-12
15 ml conical centrifuge tubes	Corning	430790
50 ml conical centrifuge tubes	Corning	430828
96 well microtiter plates: Polystyrene, flat-bottomed, tissue culture treated	Corning	3595
Multichannel pipette and tips	Eppendorf
Incubator	Any Supplier
Microtiter plate reader	Any Supplier