Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Resumo

Um método simples é descrito para a indução de células epiteliais para mesenquimal (EMT) em uma variedade de tipos de células. Métodos de análise de células em EMT estados por imunocitoquímica estão incluídos.

Resumo

Epitelial para mesenquimal (EMT) é essencial para a morfogénese adequada durante o desenvolvimento. A desregulação do processo tem sido implicada como um evento chave na fibrose e a progressão de carcinomas para um estado metastático. Compreender os processos que estão na base EMT é fundamental para o diagnóstico precoce e controle clínico dessas doenças. Indução de confiança de EMT in vitro é uma ferramenta útil para a descoberta de medicamentos, bem como para identificar as assinaturas comuns de expressão gênica para fins de diagnóstico. Aqui demonstramos um método simples para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células. Os métodos para a análise de células de pré-e pós-indução por EMT imunocitoquímica também estão incluídos. Além disso, demonstram a eficácia deste método, através da análise de matriz baseada em anticorpos e ensaios de migração / invasão.

Introdução

Epitelial para mesenquimal (EMT) é o processo pelo qual uma célula epitelial polarizada sofre uma variedade de alterações que resultam em, uma célula mesenquimal altamente móveis do tipo fibroblasto. Este processo ocorre, em parte, através de mudanças de expressão do gene e a degradação das junções aderentes, o que resulta num aumento da capacidade de migrar e invadem. Fisiologicamente, EMT desempenha um papel importante durante o desenvolvimento embrionário e cicatrização de feridas. Perda de controle adequado sobre EMT pode levar a fibrose e metástases de carcinomas ^1,2.

A redução de E-caderina sobre a superfície de células epiteliais é um passo crítico para a progressão de uma célula através de EMT ^3,4. A E-caderina é uma proteína transmembranar com uma única passagem que interage directamente com as proteínas da caderina nas células adjacentes. Em adição ao seu papel na adesão celular, a sinalização de E-caderina influências celular através de interacções entre a cauda citoplasmática de E-caderina umda variedade de proteínas reguladoras, nomeadamente β-catenina. β-catenina desempenha um papel importante na estabilização de junções aderentes. Durante canónica sinalização Wnt, β-catenina é libertado a partir de E-caderina e translocado para o núcleo, onde actua como um factor de transcrição a jusante na via de Wnt ^3,4,5. No núcleo, β-catenina foi mostrada para aumentar a transcrição de diversos factores relacionados com o EMT, incluindo torção, Slug, fibronectina, e uma variedade de metaloproteinases de matriz de ^3,6.

Além Wnts, a sinalização de TGF-β tem mostrado desempenhar um papel significativo na indução de EMT tanto durante o desenvolvimento normal e em estados de doença ^7,8,9. TGF-β está envolvida na EMT que ocorre durante a formação da boca e no coração em desenvolvimento ^10. Também foi implicada na fibrose e na progressão do cancro da metástase ^7.

O procedimento descrito aqui provides indução consistente de EMT em uma variedade de tipos de células, sem a necessidade de manipulação genética. Este processo utiliza uma mistura de E-caderina, sFRP-1, e Dkk-1 e anticorpos bloqueadores de Wnt-5a e proteínas recombinantes de TGF-β1. Este coquetel é projetado para bloquear E-caderina baseada adesão ao realçar Wnt e TGF-β sinalização. A capacidade para a indução de EMT robusta é fundamental para a compreensão da biologia do processo e como manipulá-lo para fins terapêuticos. Marcadores comuns atuais da EMT, E-caderina (downregulated em EMT) e vimentina (regulada em EMT), podem ser encontrados co-expressos em câncer e assim não fornecem os melhores marcadores de diagnóstico de potenciais células metastáticas ^12. Mais importante, a análise de uma variedade de tipos de células que tenham sido submetidos a EMT é útil para o desenvolvimento de assinaturas de expressão de genes comuns que podem ser utilizados para fins de diagnóstico em cancro e fibrose ^11. Além disso, estudos recentes demonstraram que a LMT pode desempenhar um papel na formação de células estaminais de cancro, o que sugere que as células que sofreram EMT pode ser útil para o rastreio de fármacos para identificar compostos que pode ter como alvo estas células ^13.

Protocolo

1. Indução de EMT

1. Meios de cultura de aquecer a 37 ° C em um banho de água. O meio de cultura utilizado é o mesmo que os meios utilizados para a cultura padrão de suas células de interesse. Por exemplo, a linha de células de pulmão humano A549 carcinoma é cultivado em F12 de Kaighn suplementado com 10% de soro fetal bovino e glutamina 2 mM.
2. Células colheita de interesse usando uma solução de dissociação (por exemplo TrypLE Express).
3. Suspender as células em meios de cultura pré-aquecido em um tubo de 15 ml.
4. Centrifugar a suspensão de células a 400 xg durante 5 min.
5. Remova cuidadosamente o sobrenadante por derrama em um recipiente de resíduos.
6. Suspende-se o sedimento de células em meio de cultura de pré-aquecido.
7. Contagem de células viáveis ​​utilizando azul de tripano. Retirar uma amostra de suspensão de células e dilui-se em 0,4% de solução de azul de tripano. Coloque 10 ml da amostra diluída em um hemocitômetro e contagem de células viáveis ​​(células que não ficam azuis). Utilizar a contagem de células para determinar a célula density em sua solução.
8. Células placa sobre placas de cultura de tecidos tratados ou frascos de 0,9-1,0 x 10 ⁴ culas por cm ^2. Por exemplo, 0,5 x 10 ⁶ células plaqueadas numa placa de 100 mm de meio de cultura contendo 1X Suplemento EMT Indução de media (6 ml de meio por placa de 100 mm).
9. Cultura de células plaqueadas numa 37 ° C / 5% de _CO2. Monitorar morfologia celular diariamente.
10. Três dias após o plaqueamento, remover e substituir a mídia com meios de cultura pré-aquecido fresco contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento. Continuar a cultura em um 37 ° C / 5% de _CO2.
11. Cinco dias após o plaqueamento, as células estão prontas para análise. Morfologia celular é visualizado por microscopia de luz invertida.

2. Análise da expressão das proteínas por imunocitoquímica

1. Prepare estéreis lamelas 12 milímetros para uma placa de 24 poços colocando lamelas numa placa de petri contendo 95% de etanol. Remova cuidadosamente lamelas de etanol nosção de uma agulha e uma pinça curva e chama esterilizar. Coloque lamela esterilizada para um poço de uma placa de 24 poços. Repita com lamelas restantes.
2. Prepare a suspensão de células como descrito na seção 1,1-1,7.
3. Placa 1,6 x 10 ⁴ células / poço em 0,5 ml de meio de cultura pré-aquecido contendo 1X EMT Induzir Mídia Suplemento.
4. Crescer e alimentar as células, conforme descrito nas seções 1,9-1,11.
5. Cinco dias após o plaqueamento, retirar o suporte e fixar as células com 300 ^ l / poço de paraformaldeído a 4% em 1X tampão fosfato salino (PBS) durante 20 min à temperatura ambiente.
6. Remover fixador e lavar as células 2x com 1X PBS, 500 ul / poço.
7. Incubar as células em 400 ul / poço de tampão de bloqueio (1X PBS contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA), 10% de soro de burro normal, e 0,3% de Triton X-100) durante 1 hora à temperatura ambiente.
8. Incubar em anticorpo primário em fabricantes concentração recomendada em 400 ul / poço de tampão de bloqueio durante 3 horas a temperatur ambientee ou durante a noite a 4 ° C. Quando se utiliza um anticorpo primário directamente conjugado com um fluorocromo, incubar as amostras no escuro.
9. Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem. Quando se utiliza um anticorpo primário diretamente conjugado a um fluorocromo, prossiga diretamente para o passo 2.12.
10. Incubar as células em anticorpo secundário na concentração recomendada pelo fabricante em 400 ul / poço de 1X PBS contendo 1% de BSA durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro.
11. Lave as células três vezes em 500 ul / poço de 1X PBS contendo BSA a 0,1% durante 5 min cada lavagem.
12. Se se desejar, os núcleos com DAPI contracoloração solução.
13. Lavar as células em água deionizada e montar lamelas de bruços sobre um slide usando a mídia de montagem.

Resultados

. EMT induzem as condições de cultura aqui descritas proporcionam um método fiável para a indução de EMT em uma variedade de tipos de células As Figuras 1 e 2 mostram a morfologia da e os níveis de expressão do marcador de quatro diferentes linhas de células humanas: células de glioblastoma T98G, HT29, células de adenocarcinoma de cólon , células de carcinoma do pulmão A549 e MCF10A células epiteliais mamárias. As células que foram tratados com o suplemento de EMT Induzir Meios mudou de uma morfologia clássica epitelial (Figuras 1A - 1D) para um mesenquimal, morfologia fusiforme (figuras 1E - 1H). Células induzidas EMT apareceu menos densamente embalado em colônias apertados em comparação com células não induzidas. Amostras não induzidas MCF10A contidas aglomerados hermeticamente embalados cercadas por células mais frouxamente embalados. Estes agrupamentos foram hermeticamente embalados E-caderina positivo (Figura 2D) e desapareceu após o tratamento com a EMT Induzir Mídia Supplemento (Figura 2H).

EMT, também foi avaliado pela regulação baixa de marcadores epiteliais e aumento da expressão de marcadores mesenquimais. A regulação negativa da expressão de E-caderina é tipicamente observado após a indução de EMT em diferentes tipos de células de ^3,4 a Figura 2 mostra a expressão da superfície de E-caderina na maioria das células não tratadas (Figuras 2A - 2D; vermelho). Em comparação com a sua ausência depois indução EMT (Figuras 2E - 2H, vermelho). Uma linha celular, T98G, foi encontrado para ter um baixíssimo nível basal de E-caderina antes da indução EMT, o que impedia a sua análise. Upregulation do marcador mesenquimal, fibronectina, também foi visível após a indução com o Suplemento EMT Indução de mídia (Figuras 2A - 2D contra Figuras 2E - 2H; verde).

Os níveis de E-caderina e Fibronectina expressão visto por imunocitoquímicaForam ainda confirmada através de Western blotting de lisados ​​de células totais (Figura 3). O Western blot confirmou a regulação negativa da E-caderina e a regulação positiva da expressão de fibronectina vista por imunocitoquímica. As bandas foram quantificadas utilizando densitometria e normalizados para GAPDH para determinar a mudança vezes em relação após a indução EMT. Níveis de E-caderina foi reduzida de 6,4 e 3,4 vezes na A549 e células MCF10A, respectivamente. Níveis de fibronectina foram aumentadas de 4,6, 4,1, e 2,3 vezes na T98G, A549 e células MCF10A, respectivamente. Embora o Western blot não mostram redução significativa dos níveis da proteína E-caderina nas células HT29 de indução pós-EMT, os resultados imunocitoquímica demonstram uma redução na expressão de superfície de E-caderina (Figura 2B contra 2F), que é capaz de ser distinguida em Western blotting de lisados ​​de células totais.

Para melhor avaliar o estado EMT, conhecido marcador adicionals para EMT foram analisadas pré e pós-indução EMT. Consistente com os resultados anteriores, a E-caderina foi regulada negativamente em todas as linhas celulares examinadas, o que indica que foi induzida EMT. Além disso, os marcadores de mesenquimais, vimentina e caracol, foram regulados positivamente em A549, T98G e MCF10A células após o tratamento com EMT Induzir Meios suplemento (Figura 4). A linha de células HT29 não mostraram expressão destes marcadores mesenquimais com ou sem indução de EMT (dados não mostrados), o que pode indicar que as células utilizam vias alternativas para a indução de EMT.

Embora o TGF-β é suficiente para induzir a EMT em certos contextos célula ^7,8,9, outros tipos de células não respondem exclusivamente para a adição de TGF-β ^14. MCF-7 células de câncer de mama humano e PANC-1 células de carcinoma do pâncreas humanos são ambos relataram não responder a sinalização sozinho ¹⁴ TGF-β. Para determinar se ambas as linhas podem sofrer EMT em VITRo, as células foram cultivadas na presença de suplemento EMT Induzir Media. As células foram estimuladas com proteína recombinante de TGF-β1 sozinho, com a concentração no interior do Suplemento EMT Induzir Media. Estas células mantiveram a sua morfologia epitelial, que consiste em colónias de células embaladas apertadamente (dados não mostrados) e os níveis de E-caderina de superfície foram semelhantes aos observados em células de controlo (Figuras 5C e 5D contra Figuras 5A e 5B). Em contraste, as células estimuladas com o Suplemento EMT Indução de mídia mostraram uma diminuição drástica nos níveis de E-caderina superfície (Figuras 5E e 5F). Estas células também obtida uma morfologia mais mesenquimais, as células tornaram-se menos compacto e mais fusiformes (dados não mostrados). Estes resultados demonstram que o método de indução de EMT aqui descrita é capaz de promover a morfologia EMT e marcadores mudanças de expressão em células normalmente resistentes ao TGF-β-iEMT nduced.

Além de mudanças na expressão do marcador, outra marca registrada de células mesenquimais é a sua capacidade de migrar e invadir. A migração e invasão de células de cultura com ou sem suplemento de EMT Induzir Os meios foram analisados ​​utilizando o bem BME 96 invasão celular Ensaio de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas em placas de 96 poços (50000 células / poço) contendo inserções de filtro com 8,0 mM poros. Após 48 horas, a migração foi avaliada por calceína AM de coloração de células que migraram através do filtro. Cada amostra foi testada em triplicado duas vezes com resultados semelhantes. Os resultados representativos de uma experiência são apresentados na Figura 6A. Aumentos estatisticamente significativos (P-valor <0,003) na migração celular foram vistos com tanto A549 e PANC-1 células após indução EMT. Para avaliar a capacidade destas células para invadir (ou seja, migram através da matriz extracelular), o mesmo ensaio foirealizada com um filtro revestido com extracto de membrana basal. As células induzidas por EMT mostrou um (valor P <0,001) aumento estatisticamente significativo na capacidade de invasão em comparação com células não tratadas, como visto na Figura 6B.

A indução robusta de EMT é útil para a análise de alterações de expressão de genes e de sinalização que ocorrem nestas células. A análise de matriz à base de anticorpo utilizando os lisados ​​de células tratadas e não tratadas, tanto é um método para analisar os níveis de uma variedade de moléculas de expressão numa única amostra. Como exemplo, foram analisados ​​os níveis de fosforilados membros da família MAPK em lisados ​​de un-induzido e EMT-induzida MCF7 e células A549 utilizando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. A matriz foi executado duas vezes a partir de tratamentos independentes EMT-indução, com resultados semelhantes. Figura 7 mostra dados representativos a partir de uma matriz. Ambos os tipos de células exibiram aumento da fosforilação de CREB (S133), a ERK1 (T2 02/Y204) e ERK2 (T185/Y187) em células induzidas por EMT comparação com os controlos. Foram observadas diferenças nos acontecimentos de sinalização entre os dois tipos de células, bem. As células A549 apresentaram um aumento na GSK-3 β (S9) de fosforilação, enquanto que as células MCF-7 mostraram um aumento p70S6K (T421/S424) fosforilação.

Figura 1. Mesenquimais morfologia indução após estimulação com o Suplemento EMT Induzir Mídia (A - D). Morfologia epitelial nos quatro tipos de células indicado seguinte cultura por 5 dias em meio de cultura padrão sem suplemento EMT Indução de mídia (E - H). Morfologia mesenquimais no quatro tipos de células indicado cultivados com suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias.

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Figura 2. Regulação negativa da expressão de marcadores epiteliais e supra-regulação de expressão do marcador mesenquimais em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (vermelho), e o marcador mesenquimal, fibronectina (verde). (A - D) células cultivadas de controle sem suplemento EMT Indução de mídia para 5 dias (E - H.) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. Todas as células são contrastado com DAPI (azul).

Figura 3. A confirmação da expressão do marcador epitelial e mesenquimal com um western blot . alysis Western blot de lisados ​​de células totais dos quatro tipos de células indicado, tratou-se com (EMT) ou sem (-) o suplemento de EMT Induzir meios durante 5 dias. Bandas para a E-caderina, fibronectina, e o controlo de GAPDH carregamento são como indicado no lado esquerdo. O marcador de tamanho é tal como indicado no lado direito.

Figura 4. A sobre-regulação dos marcadores mesenquimais, vimentina e Snail em células induzidas por EMT. Células foram coradas por imuno-fluorescência multicolor para detectar a expressão do marcador epitelial, a E-caderina (cinzento), e os marcadores de mesenquimais, vimentina (verde) e caracol (vermelho) células cultivadas de controle sem o suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias. - (C A). (D - F) Células cultivadas com o Suplemento EMT Indução de mídia durante 5 dias.

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Figura 5. Indução de EMT em células que não respondem TGF-β1. (A e B) Células cultivadas com meio sozinho durante 5 dias. (C e D) Células cultivadas em meio contendo 10 ng / ml de TGF-β1 durante 5 dias. (E e F) células cultivadas em EMT Induzir Mídia Suplemento 5 dias. Todas as células são coradas para a expressão da caderina-E (vermelho) e contrastado com DAPI (azul).

Figura 6. Células induzidas por EMT têm aumentado as capacidades de migração e invasão. A. número de células que migraram através de um filtro de poros 8 mM após incubação de 48 horas. Número médio de B.As células que eram capazes de invadir através de um filtro de poro de 8 um revestidas com extracto de membrana basal, após incubação durante 48 horas. As barras de erro indicam o desvio padrão de 3 poços.

Matriz de análise de expressão baseado no anticorpo Figura 7. De indução EMT. Lisados ​​de A549 (A e C) e MCF7 (B e D), as células cultivadas com ou sem EMT Induzir Mídia Supplement foram utilizados para análise matriz usando o Kit Matriz Proteoma Humano Profiler Phospho-MAPK. Spots em destaque na A e B foram então quantificadas utilizando densitometria. Comparações de induzidas un lisados ​​induzidas a EMT são mostrados nos gráficos de barras correspondentes abaixo (C e D). Clique aqui para ver maior figura </ A>.

Discussão

Os métodos anteriores para a indução de EMT têm geralmente usado estimulação de TGF-β ou modificação genética. Embora o TGF-β sozinho demonstrou induzir EMT em alguns tipos de células, que já foi demonstrado que TGF-β é necessário para EMT, mas não é suficiente em todos os tipos de células de ^6,14. Usando modificação genética para a indução de EMT é demorado e trabalhoso. O método descrito aqui utiliza uma combinação de factores, incluindo, anti-humano de E-caderina, sFRP-1 anti-humano, Dkk-1 anti-humano, recombinante humana de Wnt-5a, e recombinante humana TGF-β1 para induzir de forma fiável EMT. Esta combinação de factores é concebido para bloquear a adesão de E-caderina-base, um passo crítico para a indução de EMT ^4, e melhorar a sinalização de Wnt, adicionando a proteína Wnt-5a, bem como a utilização de anticorpos de bloqueio para os inibidores de Wnt, sFRP-1 e Dkk -1. Wnt e de sinalização de TGF-β foram mostrados para agir em um loop autócrino para induzir e manter a estatística de células mesenquimaise ^6. Este método evita a indução da manipulação genética e é mais eficaz do que a utilização de TGF-β sozinho. Importante, que é capaz de observar a indução de EMT em tipos de células, incluindo MCF7 e PANC-1 de células, que tenham sido previamente demonstrado que não respondem exclusivamente a estimulação de TGF-β (Figura 5) ^14.

As células tratadas com o EMT Induzir Mídia Suplemento show de morfologia fusiforme menos compacto e maior (Figura 1). Além disso, há uma diminuição da superfície de E-caderina expressão concomitante com um aumento na expressão de fibronectina, que são características de EMT (Figuras 2 e 3). Mesenquimais marcadores adicionais tais como vimentina e caracol também são regulados positivamente em células induzidas EMT, em comparação com os controlos não induzidos (Figura 4). Aumento habilidades de migração e invasão são as principais características funcionais das células mesenquimais. Em in vitro Migração e invasão ensaios, as células tratadas com o Suplemento EMT Indução de mídia demonstraram um aumento significativo da capacidade de migrar e invadir (Figura 6).

Este método simples para a indução de EMT é útil para o estudo da sinalização EMT como demonstrado utilizando os dados de expressão de anticorpo de matriz mostradas na Figura 7. Diferentes tipos de células podem ser comparadas e pré-indução de pós-EMT para obter assinaturas de expressão mais comuns associados com EMT, tais como o aumento da CREB fosforilado e ERK1 / 2 observada em ambos MCF7 e de células induzida por EMT A549. S133 fosforilação de CREB estimula a ligação ao ADN e tem sido mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT ^15. ERK1 / 2 fosforilação também foi mostrado que actua a jusante de TGF-induzida por β1 EMT ^16. Diferenças nas vias de sinalização entre os tipos de células também pode ser elucidada como pode ser visto com o aumento na GSK-3β fosforilação em células A549 contra p70S6K fosforilação em MCF7. Fosforilação GSK-3β na serina 9 diminui a função, e GSK-3β foi mostrado para inibir o factor de transcrição pró-EMT, caracol ^17. Em contraste, p70S6K induz actividade de Snail e a sua fosforilação está associada com a activação de esta proteína ^{de 18.}

No geral, a indução simples e confiável de EMT, particularmente em células previamente apresentados não responder unicamente para TGF-β, é útil para a compreensão da biologia da EMT, identificar assinaturas de expressão comuns para o uso como marcadores prognósticos e desenvolvimento e avaliação de novas terapias para o câncer e doença fibrótica.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Epithelial cells of interest			We have tested: A431, A549, HT29, T98G, MCF10A, MCF7, and PANC1
EMT Inducing Media Supplement	R&D Systems	CCM017
Recombinant Human TGF-β1	R&D Systems	240-B	Used at 10ng/ml
Anti-E-Cadherin NL557 conjugated antibody	R&D Systems	NL648R	Used at a 1:10 dilution for immunocytochemistry
Anti-E-Cadherin	R&D Systems	MAB1838	Used at 0.1 μg/ml for western blotting
Anti-Fibronectin	R&D Systems	MAB1918	Used at 10 μg/ml for immunocytochemistry; Used at 0.5 μg/ml for western blotting
Anti-GAPDH	R&D Systems	AF5718	Used at 0.2 μg/ml for western blotting
Goat Anti-Mouse NL493 Secondary Antibody	R&D Systems	NL009	Used at a 1:200 dilution for immunocytochemistry
Donkey Anti-Goat HRP Secondary Antibody	R&D Systems	HAF109	Used at 1:2000 for western blotting
Goat Anti-Mouse HRP Secondary Antibody	R&D Systems	HAF007	Used at 1:2000 for western blotting
EMT 3-Color Immunocytochemistry Kit	R&D Systems	SC026	Used according to the manufacturer’s instructions. This kit contains directly conjugated antibodies against E-cadherin, Vimentin, and Snail.
96 Well BME Cell Invasion Assay	R&D Systems	3455-096-K	This kit was used according to the manufacturer's recommendations.
Proteome Profiler Human Phospho-MAPK Array Kit	R&D Systems	ARY002B	This kit was used according to the manufacturer's recommendations19.
Mounting Media	R&D Systems	CTS011
0.4% Trypan Blue Solution	Life Technologies	15350-061
1X Phosphate Buffered Saline (PBS)
95% Ethanol
Bovine Serum Albumin	Sigma	A3311
Normal Donkey Serum	Jackson Labs	017-000-121
Triton-X-100	Roche Molecular Biochemicals	789-704	Dilute in 1X PBS to make a 10% stock solution
Paraformaldehyde	Sigma	P6148	Dilute in 1X PBS to a 4% working concentration.
DAPI Solution	Sigma	D9542	Make stock solution at 14.3mM by dissolving in water. Working solution is a 1:5000 dilution of the stock solution in 1X PBS.
Fine pointed curved forceps	Thermo-Fisher Scientific	08-875
12 mm coverslips	Carolina Biological	633009
Nonfat dry milk			Used at 5% in TBST for blocking in western blotting
TBST [25mM Tris, pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.1% Tween 20]			For western blotting blocking and washing
PVDF Membrane			For western blotting
4-20% SDS-page gel			For western blotting
ECL substrate			For western blotting
15 ml conical tubes
Plates/flasks, tissue culture treated
24-well plates, tissue culture treated
Pipettes / pipette tips
Pipet Aid / pipets
Hemocytometer
37 °C Water Bath
37 °C/5%CO2 Incubator
Centrifuge
Inverted light microscope
Fluorescence microscope