Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis para dissociar os efeitos de Mecanotransdução Sugestões

Resumo

Apresentamos um novo hidrogel de poliacrilamida, chamada hidroxi-PAAm, que permite uma ligação direta das proteínas da MEC com custo ou experiência mínima. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact facilita o controlo independente das muitas pistas de o microambiente celular natural para estudar mechanostransduction celular.

Resumo

Está agora bem estabelecido que muitas funções celulares são reguladas por interacções de células com pistas físico-químicas e mecânicas do seu ambiente de matriz extracelular (ECM). As células eucarióticas sentir constantemente seu microambiente local através mechanosensors de superfície para a transdução de mudanças físicas de ECM em sinais bioquímicos, e integrar esses sinais para alcançar mudanças específicas na expressão gênica. Curiosamente, os parâmetros físico-químicas e mecânicas do casal ECM lata uns com os outros para regular o destino celular. Portanto, a chave para a compreensão Mecanotransdução é dissociar a contribuição relativa dos sinais de ECM sobre as funções celulares.

Aqui apresentamos um protocolo experimental detalhado para gerar rapidamente e facilmente hidrogéis biologicamente relevantes para a afinação independente de pistas Mecanotransdução in vitro. Nós, os hidrogéis de poliacrilamida quimicamente modificados (Paam) para ultrapassarem as suas intrinsecamente não-Adhesive propriedades, incorporando monómeros de acrilamida funcionalizado com hidroxilo, durante a polimerização. Obtivemos um romance PAAm hidrogel, chamado hidroxi-PAAm, que permite a imobilização de qualquer natureza desejada das proteínas da MEC. A combinação de hidroxi-PAAm hidrogéis com impressão microcontact permite controlar de forma independente a morfologia das células individuais, a rigidez da matriz, a natureza e a densidade das proteínas da MEC. Nós fornecemos um método simples e rápido que pode ser configurado em cada laboratório de biologia para estudar em processos Mecanotransdução células in vitro. Nós validar este romance plataforma bidimensional através da realização de experimentos em células endoteliais que demonstram uma ligação mecânica entre rigidez ECM eo núcleo.

Introdução

Muitos aspectos do microambiente celular local (por exemplo, rigidez, tamanho de poro, a natureza das proteínas, ou a densidade de célula-ligando) fornecer um conjunto de coordenadas de sinais de regulação que controlam os processos celulares tais como a motilidade, a proliferação celular, diferenciação, e a expressão do gene. As modificações das propriedades físico-químicas do ambiente extracelular pode ser percebida por células e provocar consequências fisiológicas diferentes, incluindo deformação da polarização celular, migração, e diferenciação. Ainda não está claro, no entanto, como as células traduzir modificações ECM em sinais bioquímicos celulares. Por isso, é de grande importância para engenheiro controlado em microambientes in vitro que podem reproduzir as interações entre células e seu microambiente para estudar vias Mecanotransdução. Para resolver este problema, que recentemente introduziu um novo método ^1, chamado de hidrogéis-PAAm hidroxi, para gerar facilmente de dois centavomatrizes nsional suaves que permitem controlar de forma independente pistas Mecanotransdução importantes: a rigidez da matriz, geometria celular e confinamento, da natureza da proteína e densidade de células-ligante.

MEC orienta processos celulares através de gradientes em morphogens (quimiotaxia), proteínas adesivas (haptotaxia) e rigidez (durotaxis). Ao longo das últimas décadas, avançado em plataformas in vitro têm sido desenvolvidos para isolar esses sinais extracelulares, a fim de trazer à tona como as células são capazes de traduzir características bioquímicas e biofísicas em processos fisiológicos ^2-5. Foram desenvolvidos por feixe de elétrons ^{6, 7} fotolitografia, imobilização fotoquímica ^{de 8,} ou técnicas assistidos por plasma ⁹ para dirigir o crescimento de células vivas nos substratos micropatterned. Embora essas técnicas tiveram resultados importantes, a maioria deles não permitem a discriminação entre a influência individual de diferentes pistas sobre o comportamento das célulase requerem instalações técnicas que alguns laboratórios podem pagar. Entre estas técnicas, a impressão microcontact (μCP), tem surgido como um método robusto e acessível para a criação de células-adesiva micro-ilhas ^10. Mais recentemente, os esforços extensos ^11-14 foram feitos para desenvolver hidrogéis com μCP em rigidez ajustáveis, a fim de reproduzir a vasta gama de rigidez observados em tecidos vivos. Entre essas obras, poliacrilamida (PAAm) tornou-se popular ¹⁵ e já é uma das matrizes à base de polímeros mais utilizados para estudos biomecânicos celulares ensaios.

PAAm superfícies são geralmente funcionalizada com o agente de reticulação heterobifuncional proteínas-sulfossuccinimidil-6-N [4'-azido-2'-nitrophenylamido] (sulfo-SANPAH) e de ECM são ligados à superfície através da activação de UV do nitrofenil sulfo-SANPAH grupos azida ^16. Uma outra técnica consiste no acoplamento de hidrazina para proteínas que têm sido severamente oxidadocom periodato ^17. Hynd e colaboradores introduzida uma técnica para padronizar as superfícies de hidrogel biomiméticos com proteínas e peptídeos que requer a fotopolimerização na presença de um monómero acroyl-estreptavidina ^18. Mais recentemente, Tseng et al. Relataram um novo método micropatterning ¹⁹ com base na exposição à radiação UV profunda de PAAm através de uma máscara de quartzo óptico que requer a incubar geles PA activado com 1-etil-3-[3-dimetilaminopropil] carbodiimida (EDC) e soluções aquosas de N-hidroxissuccinimida (NHS) antes de adicionar a proteína. Apesar da capacidade destas técnicas para criar proteínas homogéneas e reprodutíveis micropadrões, a maior parte deles sofrem grandes limitações: os processos de síntese de longo (por exemplo, a diálise, liofilização, etc), compostos químicos caros (por exemplo, ácido hialurónico, sulfo-SANPAH) ou UV profundo irradiação. Além disso, estas técnicas não permitem a modulação independente de rigidez do substrato, micropatterngeometria, ECM natureza proteica, e a densidade celular-ligando.

Tendo em conta estas limitações, temos desenvolvido uma abordagem base de acrilamida e novos simples que permite a imobilização de uma variedade de proteínas e biomoléculas em hidrogéis macios e permite sintonia independente de sinais Mecanotransdução a fim de decifrar o seu papel em funções celulares. Em vez de tratar hidrogéis PAAm com compostos químicos agressivos, introduzimos um monômero acrilamida comercial com grupos hidroxila durante a polimerização PAAm. Esta operação simples supera a propriedade anti-aderente intrínseca de hidrogéis PAAm sem quaisquer outros requisitos técnicos.

A presença de grupos hidroxilo conduz a uma elevada afinidade de hidrogéis PAAm-hidroxi para proteínas e biomoléculas que formam interacções hidrogénio por entrelaçamento. Em combinação com μCP, hidrogéis-hidroxi PAAm permitir a rápida geração de plataforma cultura bidimensional com um controlo independentesobre a rigidez da matriz, o tipo de proteínas de ECM, a densidade celular ligando-confinado e adesividade, que está previsto para ser uma plataforma poderosa para o estudo Mecanotransdução.

O objectivo deste protocolo é fornecer as informações necessárias para a tomada facilmente hidrogéis-PAAm hidroxi sem qualquer experiência em ciências de materiais. O objetivo final é fornecer um meio para que os pesquisadores fazem perguntas fisiologicamente relevantes nos níveis celulares e teciduais que podem levar a uma melhor compreensão das vias Mecanotransdução envolvidas em mecanismos fisiopatológicos.

Protocolo

1. Ativando a superfície de lamelas de vidro

1. Lugar de vidro lamelas circulares (25 mm de diâmetro) em uma placa de Petri e smear solução de NaOH 0,1 M nele por 5 min (Cobertura de vapores químicos recomendado).
2. Remover a solução de NaOH e mergulhar totalmente lamelas com DDH ₂ O estéril por 20 min enquanto balançando suavemente sobre uma placa de balanço em uma capa de cultura estéril.
3. Escorra estéril DDH ₂ O e repita o passo 1.2.
4. Retirar as lamelas com pinças estéreis e colocá-los em uma nova placa de Petri com a face para cima ativado.
5. Lamelas secas sob um fluxo constante de elevada pureza do gás de azoto.
6. Num capuz de cultura estéril, esfregaço de uma fina camada de acrilato de 3 (trimetoxissilil) propilo (92%) do lado da lamela activado durante 1 h.
7. Extensivamente lavar lamelas de vidro com 3 lavagens de DDH ₂ O estéril e mergulha-as na DDH ₂ O estéril em uma nova placa de Petri.
8. Toque na placa de Petricom Parafilm e colocá-lo em uma placa oscilante sob agitação suave durante 10 min.
9. Retirar as lamelas DDH ₂ O, com uma pinça estéreis com pontas finas e coloque-os em uma nova placa de Petri com a face para cima ativado.
10. Armazenar à temperatura ambiente, em local seco com papel alumínio para evitar que a poeira grude as lamelas.

2 Preparação de Hidroxi-PAAm hidrogéis

1. Prepara-se uma massa de 65 mg de acrilamida de N-hidroxietil (HEA) num tubo Eppendorf de 1,5 ml. É importante para preparar uma solução de HEA fresco.
2. Adicionar 1 ml de tampão HEPES 50 mM de HEA e misture utilizando um agitador até à dissolução completa do HEA.
3. Adicionar 400 ul de 40% w / w em solução de HEPES acrilamida e o volume necessário de 2% w / w em solução de HEPES bis-acrilamida (ver Tabela 1) para atingir a rigidez do hidrogel desejada. Ajustar com HEPES 50 mM a um volume final de 5 ml.
4. Misture a solução com um agitador e degas TInuma câmara de vácuo durante 20 minutos, a fim de reduzir a concentração de oxigénio na solução, que evita a polimerização hidroxi-PAAm.
5. Dentro de uma câmara estéril, filtrar a solução desgaseificados com um filtro de 0,2 um de tamanho de poro, de modo a esterilizar.
6. Ative lamínulas de vidro circulares (22 mm de diâmetro), em um aspirador de UV / ozônio durante 7 min.
7. Prepare a 100 ul de solução de persulfato de amónio (APS) 10%, que é de 10 mg de EPA 100 ul ddH ₂ O. É importante para preparar uma solução de APS fresco.
8. Adicionar 2,5 mL de tetrametilenodiamina (TEMED) e 25 ul de solução de APS ao hidroxi-PAAm solução esterilizada (passo 2.5), para iniciar a polimerização. Misture a solução por 3 pipettings sucessivas sem introdução de bolhas, em condições estéreis.
9. Dentro de uma câmara esterilizada, colocar uma gota de 25 ul da solução de hidroxi-PAAm sobre uma lamela de 25 mm (disponível a partir do passo 1.9) e colocar imediatamente a gl 22 milímetroslamela de burro (preparado no passo 2.5) em cima da gota para espremer a solução de hidroxi-PAAm. Centralize a lamela de vidro 22 mm com pinças estéreis e eliminar possíveis bolhas.
10. Permitir hidrogéis PAAm-hidroxi para polimerizar à temperatura ambiente durante 15 min. Inverta manualmente a solução restante hidroxi-PAAm no tubo Eppendorf a seguir à realização do processo de polimerização.
11. Mergulhar totalmente lamelas com _ddH2O estéril, e cuidadosamente separar as lamelas 22 mm de vidro através da introdução da extremidade de uma lâmina de barbear entre as lamelas de 22 mm de vidro e a camada de hidrogel hidroxi-PAAm.
12. Lave hidrogéis-PAAm hidroxi com PBS estéril (3 trocas de PBS) e deixe o gel totalmente imersos em PBS estéril para manter a hidratação.
13. Armazenar hidrogéis PAAm-hidroxi em PBS estéril, a 4 ° C durante até 3 dias.

3. polidimetilsiloxano (PDMS) Microstamp Fabrication

NOTA: A fabricação de um mestre de silício é necessária antes de start o PDMS fabricação microstamp. Este microfabricação de um mestre de silício pode ser feito por meio de técnicas de litografia, que requer equipamentos e treinamento especializado. Colaborações com uma instalação de nanofabricação são incentivados a fabricar o mestre de silício. Alternativamente, entre em contato com a empresa que fabrica os mestres de silício microestruturada feitos sob demanda. É importante notar que a fabricação do mestre de silício só precisa ser feito uma vez. Na verdade, os mestres de silício microstructured pode ser usado indefinidamente para produzir selos elastoméricos.

1. Mistura de PDMS e o agente de cura em um proporção de 10: 1, num copo de plástico e homogeneizar utilizando uma pipeta de 10 min.
2. Desgaseificar a mistura PDMS sob vácuo para remover as bolhas de ar que se formaram durante o passo 3.1.
3. Coloque o mestre de silício microestruturada em uma placa de Petri e lançou a 10 mm de espessura da mistura de PDMS desgasado nele sem formar bolhas.
4. Let curar o PDMS durante 2 horas a 60 ° C numaforno.
5. Em um ambiente livre de poeira, peel-off da camada de PDMS e impostos especiais de consumo 1 cm ² microstamps com um bisturi.
6. Utilizando uma pinça, coloque PDMS microstamps padrão-up em uma placa de Petri.

4. micropatterning Hidroxi-PAAm hidrogéis

1. Colocar solução PDMS microstamps em uma mistura de etanol / água (50/50) e sonicado durante 15 minutos.
2. Secar os selos com uma corrente de fluxo de azoto, e colocá-los padrão-se num dispositivo de limpeza de UV / Ozono (λ <200 nm) durante 7 min.
3. Dentro de uma câmara esterilizada, colocar uma gota de 150 mL de uma solução de proteína desejada (por exemplo, 100 ug / ml de laminina em PBS ou 25 ug / ml de fibronectina em PBS) para a superfície de uma microestrutura de 1 cm ² de PDMS selo.
4. Opcional: modificar a concentração da solução de proteínas para modular a densidade celular-ligando.
5. Espalhar a solução de proteína através da superfície do selo, movendo-a com a ponta de uma pipeta estéril para cada cantoo selo.
6. Deixar a solução de proteína para adsorver sobre o selo PDMS durante 60 minutos sob uma cobertura estéril. Desligue lâmpadas para evitar danos proteína.
7. Dentro de uma câmara estéril, transferem-hidroxi PAAm lamelas revestidas (disponíveis a partir do passo 2.13) em uma placa de Petri.
8. Remover o excesso de PBS a partir da superfície de substratos hidroxi-PAAm com um fluxo baixo de azoto sob condições estéreis. Parar o processo logo que há evidência de água que está sobre a superfície do gel é observado. O gel não deve ser completamente seca nesta fase.
9. Secar cuidadosamente a superfície estruturada do PDMS selo com um fluxo constante de elevada pureza do gás de azoto.
10. Segure o selo revestido de proteína com uma pinça de vestir e colocar a superfície estruturada em contato com a superfície do hidrogel seco. Aplicar os pontos de pressão breves com a ponta da pinça sobre a parte superior do selo PDMS para assegurar um bom contacto entre as microestruturas do selo e a superfície do hidrogel.
11. Deixe o selo PDMS em the superfície do hidrogel durante 1 hora à temperatura ambiente.
12. Remova cuidadosamente PDMS selos a partir de hidrogéis hidroxi-PAAm com uma pinça de vestir e seguir o passo 4.1 para limpar o selo.
13. Lave exaustivamente os hidrogéis-PAAm hidroxi estampadas por 3 trocas de PBS (pH = 7,4) em condições estéreis por 10 minutos por troca.
14. Opcional: micropadrões adicionais de outras proteínas de ECM podem ser adicionados ao PAAm hidroxi-superfície, seguindo passos 4,5-4,11.
15. As zonas não impressas passivar com uma solução estéril de BSA a 5 mg / ml em PBS durante uma noite a 4 ° C, sob uma agitação suave em uma placa de balanço.
16. Lave extensivamente por 3 trocas de PBS (pH = 7,4) em condições estéreis por 10 minutos por troca. Nesta fase, os hidrogéis-hidroxi PAAm estampadas podem ser armazenadas a 4 ° C até uma semana.

5. Deposição celular em micropatterned hidroxi-PAAm hidrogéis

1. Incubar lamelas em mídia celular para 30-45 min antes de chapeamento cvaras.
2. Lave as células aderentes cultivadas num frasco de ² 75 centímetros cultura com PBS estéril a 37 ° C e separá-lo com 3 ml de tripsina-EDTA ou Accutase durante 10 min.
3. Transferir a quantidade desejada de pré-aquecido completa de meio de crescimento apropriado para a sua linha de células para dentro do frasco contendo as células destacadas e centrifugar a suspensão de células durante 3 minutos a 650 x g.
4. Retirar o sobrenadante com uma micropipeta e ressuspender as células em meio de cultura completo às 15-20,000 células / ml.
5. Adicionar 4 ml da solução de células para uma lamela micropadronadas (obtido a partir do Passo 5.1) e colocar a lamela coberta por células em cultura numa incubadora a 37 ° C e 5% de humidade durante 1-2 horas.
6. Aspirar delicadamente as células solto e substituir meio de cultura. Devolver as células ligadas à incubadora e deixá-los totalmente espalhar (3-6 horas, dependendo do tipo de célula).

Resultados

A Figura 1A apresenta a co-polimerização de acrilamida (AAm) e bisacrilamida (bis-AAm) com N-hydroxyethylacrylamide (HEA) monómeros contendo um grupo hidroxilo primário formado por polimerização por radicais de uma rede aleatória hidrófila de poliacrilamida com grupos hidroxilo incorporados (hidroxi-PAAm) . Neste protocolo, um peso de 65 mg de HEA deve ser diluída num volume de 1 ml de HEPES. Sabendo-se que a densidade da HEA é aproximadamente igual a um, vamos supor que obtemos um volume de t...

Discussão

Muitos em observações in vitro em moderna biologia celular ter sido realizada em lamelas de vidro rígidas, muitas vezes revestidos com uma fina camada de proteínas de ECM ou de péptidos sintéticos contendo a sequência RGD. No entanto, tais substratos de cultura básicos não recapitular toda a complexidade físico-química da ECM e, portanto, não fornecem um modelo exato para o estudo de processos Mecanotransdução celulares. Para resolver este problema, propomos uma alternativa simples para f...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
UV/Ozone Photoreactor	Ultra-Violet Products	Model PR-100
Rocking plate	IKAcWerke	Model KS 130 Basic
Vortexer	Scientific Industries	Model Vortex Genie2
Vacuum degassing chamber	Applied Vacuum Engineering	DP- 8-KIT
Parafilm	Sigma-Aldrich	P7793-1EA
Stainless steel forceps with fine tip	Sigma-Aldrich	Z225304-1EA
Dressing tissue forceps	Sigma-Aldrich	F4392-1EA
Petri dishes in polystyrene	Sigma-Aldrich	P5731-500EA
Aluminium foil, thickness 0.5 mm	Sigma-Aldrich	266574-3.4G
Isopore membrane filter (0.2 µm pore size)	Millipore	GTTP Filter code
Round glass coverslip (22 mm diameter)	Neuvitro	GG-22
Round glass coverslip (25 mm diameter)	Neuvitro	GG-25
Variable volume micropipette	Sigma-Aldrich	Z114820
Protein microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505-100EA
Scalpel handles	Sigma-Aldrich	S2896-1EA
Scalpel blades	Sigma-Aldrich	S2771-100EA
Cell culture flasks (75 cm2)	Sigma-Aldrich	CLS430641
Ultrasonic bath tray, solid (stainless steel)	Sigma-Aldrich	Z613983-1EA
Polydimethylsiloxane	Dow Corning	Sylgard 184 silicone elastomer kit
Acrylamide (powder)	Sigma-Aldrich	A3553
N,N’-Methylenebis(acrylamide)	Sigma-Aldrich	146072
N-Hydroxyethylacrylamide	Sigma-Aldrich	697931
N,N,N’,N’-Tetramethylethylenediamine	Sigma-Aldrich	T9281
Amonium PerSulfate (APS)	Sigma-Aldrich	A3678
3-(Trimetoxysilyl)propyle acrylate	Sigma-Aldrich	1805
Human Plasma Fibronectin	Millipore	FC010
Laminin from EHS	Sigma-Aldrich	L2020
Sodium hydroxyde	Sigma-Aldrich	221465-25G
Double-distilled water (ddH2O)
Endothelial cell growth medium	Cells Applications	211K-500
Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)	Invitrogen	C-003-5C
Accutase	PAA laboratories	L11-007
HEPES buffer solution 1 M in H2O	Sigma-Aldrich	83264-500ML-F
Antibiotics-antimycotics	PAA laboratories	P11-002
Phosphate Buffer Saline solution	PAA laboratories	H15-002
Alexa Fluor 488 Phaloidin	Molecular Probes	A12379
Anti-vinculin antibody produced in mouse	Sigma-Aldrich	V9131
Goat anti-mouse antibody-tetramethylrhodamine	Molecular Probes	T-2762
Anti-Fibronectin (rabbit)	Sigma-Aldrich	F3648
Streptavidin	Sigma-Aldrich	41469
Anti-Laminin antibody (rabbit)	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-rabbit IgG-FITC	Sigma-Aldrich	F7512
Trypsin-EDTA solution	Sigma-Aldrich	T3924-100ML
Absolute ethanol	Sigma-Aldrich	459844-2.5L