Heterotópico mucosa enxertando Procedimento para entrega da droga direto para o cérebro em ratos

Resumo

Um modelo do rato de reconstrução endoscópica da base do crânio humano foi desenvolvido que cria uma interface semipermeável entre o cérebro eo nariz com enxertos mucosas nasais. Este método permite que os investigadores a estudar a libertação no sistema nervoso central de terapêutica de elevado peso molecular, que são de outro modo excluídos pela barreira sangue-cérebro, quando administrado sistemicamente.

Resumo

A entrega de agentes terapêuticos para o cérebro é impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), o que restringe a passagem de compostos polares e de elevado peso molecular a partir da corrente sanguínea e no tecido cerebral. Algum sucesso entrega direta em seres humanos tem sido alcançado através de implantação de cateteres transcraniana; no entanto, este método é altamente invasivo e associado a várias complicações. Uma alternativa menos invasiva seria a dose do cérebro através de um implantado cirurgicamente, membrana semi-permeável, tal como a mucosa nasal, que é usado para reparar defeitos da base do crânio seguinte cirurgia endoscópica tumor remoção em humanos. Transferência da droga que esta membrana seria efectivamente desviar o BBB e difundem directamente no cérebro e no fluido cerebrospinal. Inspirado por essa abordagem, uma abordagem cirúrgica em ratos foi desenvolvido que utiliza uma membrana mucosa septal doador enxertada sobre um defeito extracraniana BBB cirúrgico. Este modelo tem sido demonstrado eficazpermitir a passagem de compostos de alto peso molecular para o cérebro. Desde inúmeros candidatos a fármacos são incapazes de atravessar a certificação, este modelo é valiosa para a realização de testes pré-clínicos de novas terapias para doenças neurológicas e psiquiátricas.

Introdução

O tratamento da doença neurológica e psiquiátrica é severamente impedida pela presença da barreira sangue-cérebro (BBB), que impede que mais de 95% de todos os potenciais agentes farmacêuticos de atingir o sistema nervoso central ^1-3. Por exemplo, factor neurotrófico derivado da glia (GDNF) foi demonstrado ser eficaz no tratamento da doença de Parkinson, quando injectado directamente no cérebro, no entanto, não é eficaz quando entregues sistemicamente porque não pode penetrar a BBB ^4-6.

Numerosos abordado foram desenvolvidas para tentar ultrapassar este problema. Melhoria na administração sistémica de neurotheraputics foi demonstrada usando conjugados de medicamentos contendo anticorpos selectivos para as proteínas de transporte localizados no endotélio capilar cerebral; no entanto, este método não tem sido mostrado para ser aplicável a uma ampla gama de produtos farmacêuticos ^7,8. Além disso, a abertura osmótica da BHE foi usado clínicaaliado, no entanto, este método sofre de dosagem sistémica de fármacos, em oposição a uma distribuição mais directa para a região do cérebro de interesse ^9. Esforço considerável tem sido posta em otimização de entrega transnasal na esperança de atacar directamente o cérebro ^10-12. Embora tenha sido alcançado algum sucesso, resultados conclusivos só foram obtidos para as drogas que possuem receptores endógenos, como a insulina ^13,14. Além disso, o mecanismo de entrega transnasal tem sido controversa com indícios de entrada indireta para o cérebro por meio de captação de neurônio olfativo ou através da corrente sanguínea ^11. A entrega directa, transcraniana utilizando cateteres implantados tem sido conseguida, no entanto este processo é altamente invasivo e associada a numerosas complicações ^15,16. Até à data, não existe um método geral, minimamente invasiva para entregar os compostos de elevado peso molecular para o cérebro.

Aqui apresentada é um procedimento cirúrgico murinoque cria uma interface semipermeável com o cérebro. Isto é conseguido por um enxertando explante membrana mucosa ¹⁷ ao longo de um defeito craniotomia cirúrgica em um rato. Usando este procedimento, tem sido demonstrado que os compostos solúveis de até 500 kDa pode ser entregue no sistema nervoso central (directamente no parênquima cerebral, assim como em fluido cerebrospinal), em ambos tempo e um peso molecular dependente da forma ^18. Este método de contornar o BBB é um modelo para reparos de defeitos da base do crânio em seres humanos, que utiliza enxertos vascularizados da mucosa para reparar buracos no crânio após a cirurgia endoscópica transnasal ^19,20.

Protocolo

Antes da cirurgia certificar-se de todos os procedimentos a serem feitas são aprovados pelo IACUC e quaisquer autoridades éticas ou legais adicionais e utilizar práticas de tratamento de animais sem crueldade. Isso inclui o uso de cirurgia condições estéreis, anestesiar o mouse usando o método IACUC aprovado, lubrificando ratos olhos com pomada veterinário durante a cirurgia, e prestação de cuidados pós-cirúrgico. Não prossiga com a cirurgia se houver qualquer questão de saber se os aspectos do processo são aprovados. Todos os procedimentos aqui realizados foram aprovados pelo Comitê Institucional Universidade Animal Care e Use o Boston.

1. Preparação de Animais e suprimentos cirúrgicos

1. Autoclave todo instrumento cirúrgico que será usado durante a cirurgia.
2. Certifique-se de todas as técnicas que estão a ser realizadas são aprovados pelas agências reguladoras de animais.

2. Colheita da mucosa Graft

1. Escolheu um rato geneticamente idênticos da mesma idade comoo mouse experimental e sacrificá-lo em um método IACUC aprovado (aqui: asfixia isoflurano seguido por deslocamento cervical).
2. Usando uma tesoura cirúrgica, retire a pele ao redor da região nasal de cabeça de rato expondo o crânio.
3. Com um martelo pneumático, marca com três linhas de dois dos quais lateralmente ladeiam a região nasal e um terceiro em linha com os olhos que conecta as duas linhas perpendiculares.
4. Broca para baixo ventralmente, a fim de separar o septo nasal a partir do tecido circundante. Um caminho mais largo, evitará danos à membrana mucosa no entanto, também vai tornar mais difícil para isolar a membrana. Um corte estreito mais perto da linha média é recomendado.
5. Use a tesoura para cortar o septo livre de qualquer tecido aderido a ele e armazená-lo em uma solução salina estéril. Neste momento, o enxerto pode ser limpa para remover qualquer tecido ligado. O ideal é ter membranas mucosas intactas exposta em ambos os lados da cartilagem do septo. Um grré pode fornecer membrana para dois ratinhos desde que a área da superfície da membrana é suficiente para cobrir os locais craniotomia. Recomenda-se que o enxerto é utilizada tão depressa quanto possível e o investigador prossegue para o passo 3, logo que o enxerto é isolado.

3. Implantação cirúrgica de mucosa Graft

1. Usando procedimentos padrão, assépticas murino cirúrgicos, anestesiar e montar um mouse no quadro estereológica. Use cerca de 2% de isoflurano em oxigênio puro através de um aparelho de anestesia de roedores.
2. Imobilizar o mouse em um aparelho estereotáxico com barras de ouvido e um suporte de nariz. Aplicar pomada oftálmica para os olhos e esfregue o couro cabeludo com betadine e álcool 75% por três rodadas. Usando qualquer uma tesoura ou um aparador de cabelo, retire a pele na cabeça. Exponha o crânio com uma lâmina de barbear e nível da cabeça. Realizar uma craniotomia sobre o local do cérebro que vai ser administrado. Por exemplo, quando visando o striatum cortar 1,25 milímetrosdiâmetro do furo circular no crânio (centrado no AP: 1.00 mm; ML: 0,88 mm) usando um martelo pneumático. Molhar a área perfurada com solução salina estéril e utilizar uma lâmina de barbear para remover o crânio.
3. Remova cuidadosamente a dura usando a ponta de uma agulha. Além disso, isto pode ser conseguido pela aplicação de uma quantidade mínima de adesivo para o tecido da superfície da dura-máter húmido. Uma vez que esta camada tenha endurecido, com um movimento lateral da ponta da lâmina de barbear pode ser usado para remover a membrana.
4. Colocar a membrana mucosa acima da superfície do cérebro, tendo cuidado para manter o lado epitelial virada para fora da ferida. Isto é melhor realizado por transferência de todo o septo sobre a superfície do crânio adjacente ao local da craniotomia com pinças. Com a ponta de um par de tesouras cirúrgicas, puxar a membrana fora da cartilagem e para a superfície do crânio e no cérebro. Não deixe que a membrana secar ou tocá-lo com qualquer material absorvente. O enxerto deve sobrepor-se generosamente todas as extremidades ósseas da craniotomia site.
5. Cubra o enxerto com um pedaço estéril de borracha nitrílica. Isto actua de modo a evitar a aderência da pele no enxerto durante a cicatrização. O nitrilo precisa de ser grande o suficiente para cobrir toda a membrana mucosa. Apare membrana excessiva, se necessário. Evite qualquer movimento do nitrilo, uma vez que tenha entrado em contato com o enxerto.
6. Feche a pele com um 5-0 sutura estéril correndo e deixar o mouse recuperar para 3-7 dias antes de prosseguir para a próxima etapa. Tome cuidado para não perturbar a barreira nitrílica ou o enxerto gengival durante o fechamento da pele.

4. Administração da Solução de Dosagem

1. Depois de garantir o rato anestesiado no quadro estereotáxico, corte a sutura com uma tesoura e retire o excesso de pele ao redor do crânio.
2. Retirar a barreira nitrilo e limpar a superfície do crânio. Use soro fisiológico e cotonetes estéreis para limpar a área até que o enxerto é visível. Pode ser necessário cortar o enxerto com uma lâmina de barbear se tem crescido muito mais do que a desired área de superfície.
3. Se a experiência será mais longo do que alguns dias, é sábio para implantar pelo menos dois parafusos crânio para reforçar o implante cabeça.
4. Colocar o bem acima do enxerto, de modo que as extremidades estão em contacto com o crânio. Aplique cola de cianoacrilato na junção entre o bem eo crânio. Encha o bem com solução salina estéril e verifique se não há vazamentos. Wells são feitos de agulhas de corte de seringa.
5. Aplicar cimento ósseo no crânio para garantir o bem no lugar.
6. Remover a solução salina a partir do poço com uma pipeta. Lavar as bem várias vezes para verificar que o adesivo não vazou dentro Adicionar a solução desejada; neste caso, 50 ul de dextrano fluorescente é usado. Espera-se que os compostos solúveis em água de uma polaridade semelhante que se comportam da mesma como dextrano. Entrega de compostos hidrofóbicos ou suspensões não foi explorada com este método.
7. Tapar o topo do poço, usando um pedaço circular de nitrilo fixada aotopo usando adesivo de cianoacrilato. Certifique-se de que o adesivo não entra em contacto com o conteúdo também.

5. Análise de entrega transmucosa

1. Depois da quantidade desejada de tempo tiver passado, anestesiar o rato e trocar o conteúdo do poço com uma solução de corante azul de Evan. Este corante é usado para verificar que o enxerto estava intacta.
2. Após 30 min, anestesiar o rato fortemente, remover a solução de corante, e a eutanásia através de decapitação.
3. Manualmente remover o implante e retire o cérebro usando uma tesoura cirúrgica. Tenha cuidado para manter o enxerto no lugar.
4. Uma vez removido, flash congelar o cérebro em solução de isobutano arrefecido em um banho de gelo seco.
5. Incorporar o cérebro em solução (OCT) e fatia de 50 mm Temperatura ideal de corte.
6. Coloque as fatias desejadas diretamente em uma lâmina de microscópio.
7. Imagem da fatia utilizando um microscópio de fluorescência, logo que a solução tenha secado outubro.

Resultados

A obtenção de um grande o suficiente explante septo nasal é fundamental para as etapas subseqüentes. Isto pode ser conseguido através da perfuração no local no crânio do rato doador mostrada na Figura 1a. Corte ao longo deste caminho irá produzir um explante de tamanho suficiente, como mostrado na Figura 1b. Se a profundidade da perfuração não é profundo o suficiente, o enxerto será truncado e será difícil obter uma grande membrana suficiente para cobrir a superfície do...

Discussão

A etapa mais difícil do processo aqui descrito é o sucesso da transferência de uma membrana mucosa de tamanho adequado para a superfície do cérebro. Este passo é feita significativamente mais fácil se o septo nasal colhido é suficientemente grande e bem limpos. Se a porção ventral do septo é truncado, um novo enxerto deve ser obtida. O ângulo de perfuração deve ser perpendicular à cabeça de rato para assegurar que a membrana da mucosa não é danificado pela broca. Se um caminho mais largo do que a perfu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice	Taconic	C57BL/6
Isoflurane	Piramal Healthcare
Student fine scissors	Fine Science Tools	91461-11
Pneumatic drill	MTI Dental	333-CB
Drill bit
Forceps	Fine Science Tools	91106-12
0.9% Sodium chloride injection USP	Abbott Laboratories	4925
Polystyrene Petri dish	Fisher	08-757-12	for temporarily storing graft
Bead sterilizer	Fine Science Tools	18000-45
Oxygen/Isoflurane System	SurgiVet	V720100
Temperature Control System	Physitemp	TCAT-2LV
Small animal stereotaxic instrument	KOPF	Model 940
Eye ointment
Electric shaver
Cotton-tipped applicators	Fisher	23-400-106
7.5% Providone iodine			Betadine surgical scrub
70% Ethanol
Surgical blade stainless	Feather	2976#10
Scalpel handle - #3	Fine Science Tools	10003-12
3% Hydogen peroxide			for cleaning the skull
Vetbond tissue adhesive	3M	1469SB
Needles	Becton, Dickinson and Company	305176	needle tip cut off and used as well
Syringes	Becton, Dickinson and Company	309597
Nitrile gloves	Denville Scientific Inc	G4162	for well closure and protection of graft
5-0 Nylon suture thread
Student Halsey needle holder	Fine Science Tools	91201-13
Cyanoacrylate adhesive			commecially available super glue
Dental cement kit, 1 lb, pink opaque	Stoelting	51458
Isobutane (2-methylbutane)	Aldrich	M32631	for dry ice bath
Dry ice