Uma plataforma microfluídica para a isolação de alta taxa de transferência de célula única e Cultura

Resumo

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Resumo

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Introdução

Actualmente colocando células isoladas individualmente num espaço de cultura é geralmente conseguido através de diluição limitante ou de células activadas por fluorescência (FACS). Para muitos laboratórios, diluição limitante é um método conveniente, uma vez que requer apenas uma pipeta e placas de cultura de tecidos, as quais estão prontamente disponíveis. Neste caso, uma suspensão de células é diluída em série até uma densidade celular apropriada, e, em seguida, colocados em poços de cultura, utilizando uma pipeta manual. Estas células individuais compartimentados são então utilizados para análise de células, tais como heterogeneidade genética e rastreio de ^uma colónia ^de formação ^2. No entanto, este método é de baixo rendimento e de trabalho intensivo, sem a utilização de um braço robótico para assistência, devido à natureza distribuição de Poisson do método de diluição limitante restringe eventos de uma única célula a uma probabilidade máxima de 37% ^3. máquinas de FACS com um braço robótico integrado pode superar a limitação da distribuição de Poisson pela precisão placção de uma única célula em um poço de cultura de cada vez ^4. No entanto, a alta tensão de cisalhamento mecânico (assim, reduzido a viabilidade celular) ⁵ e compra da máquina e os custos operacionais têm limitado o seu uso em muitos laboratórios.

Para superar as limitações acima, em microescala dispositivos têm sido desenvolvidos para carregar altamente eficiente de células individuais em micropoços ^6. No entanto, os micropoços não proporcionar um espaço adequado para as células carregadas com a proliferar, devido à necessidade de tornar o tamanho de cada micropoço próximo do de uma única célula de carga para maximizar a probabilidade de uma única célula. Como são necessários ensaios de cultura em muitas aplicações baseadas em células (por exemplo, ensaio clonogénico ^7), micropoços maiores (90-650 um de diâmetro ou de comprimento lateral) também têm sido utilizados para permitir a culturas celulares prolongadas. No entanto, como o método da diluição limitante, eles também possuem baixas eficiências de carga de células individuais, que variam de 10 -. 30% ⁸, 9

Anteriormente, nós desenvolvemos uma plataforma de microfluidos de alto rendimento para isolar células individuais em micropoços individuais e demonstrar a sua aplicação no ensaio clonogénico das células isoladas. ¹⁰ O dispositivo foi feito com poli-dimetilsiloxano (PDMS), e compreende dois conjuntos de matrizes de micropoços com diferentes tamanhos de microcavidades, que podem melhorar em grande medida a eficiência no carregamento de uma única célula em um micropoço cujo tamanho é significativamente maior do que a célula. Notavelmente, este conceito "dupla bem" permite que o tamanho da área de cultura a ser ajustada de forma flexível, sem afectar a eficiência da captação de uma única célula, tornando-a simples de ajustar o desenho do dispositivo para se adequar a diferentes tipos de células e aplicações. Este método de elevada eficiência deveria ser útil para experiências de cultura de células de longo prazo para os estudos de heterogeneidade da célula e estabelecimento linha celular monoclonal.

Protocolo

Nota: Os desenhos fotomáscara para a fabricação de dispositivos microfluídicos foram desenhadas usando um software de desenho assistido por computador (CAD). Os desenhos foram então utilizados para fabricar máscaras de crómio usando um serviço comercial. Os dispositivos PDMS foram feitas usando técnicas de litografia suave ^11.

1. Fabricação de Mestre Moldes por litografia

1. Antes do processo de fotolitografia ^12, utilizar as bolachas de silício de 4 polegadas como um substrato e desidratar as bolachas em um forno convencional a 120 ° C durante 10 min.
2. Limpar as bolachas de silício desidratados usando oxigénio tratamento com plasma a 100 watts durante 30 segundos em um aspirador de plasma.
3. Pré-aqueça duas placas a 65 ° C e 95 ° C, respectivamente, para o seguinte processo de cozimento.
4. Brasão de 5 g de fotorresiste negativo (PR) sobre as pastilhas de silício limpo por um revestidor de rotação; de centrifugação a 1.200 rpm (SU-8 de 50) durante 30 segundos para produzir a camada de microcanais.
5. Coloque o PRrevestidos bolacha numa placa de aquecimento pré-aquecido a 65 ° C durante 12 min e transferi-lo para uma outra placa de aquecimento pré-aquecido a 95 ° C durante 33 min (para os padrões de 100 um de espessura) para executar um processo de cozer macio.
6. Após o cozimento, coloque a pastilha de silício PR revestido sobre o titular de um alinhador semi-automatizado máscara e alinhá-lo a um photomask transparência 25.400 dpi de resolução.
7. Expor a bolacha de silício revestido de RP à luz UV (365 nm) a uma dose de 500 mJ / cm ² para criar o padrão de PR na bolacha de silício.
8. Remova o wafer do alinhador e colocá-lo numa placa de aquecimento para pós-cozimento a 95 ° C por 12 min.
9. Mergulhe as bolachas em SU-8 desenvolvedor de soluções (acetato de éter propilenoglicol monometílico, PGMEA) para lavar PR não reticulada de 12 min e secar delicadamente com azoto para expor as marcas de alinhamento.
10. Mais uma vez, revestimento 5 g de fotorresiste negativo sobre as bolachas por um revestidor de rotação; rotação de 700 rpm (SU-8 100) durante 30 segundos e 1.200 rpm (SU-8 10) por 30 s para 300 &# 181; m padrão de espessura e 27 mm padrão de espessura, respectivamente, para fazer a camada de micropoços.
11. Coloque a bolacha PR revestido numa placa de aquecimento a 65 ° C durante 4 minutos e a 95 ° C durante 8 minutos (para 27 uM camada de captura de poços profundos); e a 65 ° C durante 40 min e a 95 ° C durante 110 minutos (para 300 uM camada cultura poços profundos).
12. Após arrefecimento, colocar a pastilha de silício revestido PR no alinhador máscara equipado com luz UV.
13. Expor a bolacha de silício revestido de PR para a luz UV (365 nm) a uma dose de 250 mJ / cm ² (27 uM para padrão de espessura) e 700 mJ / cm ² (por 300 um de espessura padrão).
14. Coza as bolachas a 95 ° C durante 5 min (27 uM padrão de espessura) e 30 min (300 um de espessura padrão), respectivamente.
15. Lavar o PR não reticulado pela PGMEA durante 6 minutos (27 uM padrão de espessura) e 25 min (300 um de espessura padrão), respectivamente, e em seguida secá-los com azoto gasoso.
16. Medir a altura do padrão apresenta emo wafer com uma profilometer de varredura a laser, colocando a bolacha sobre o xy-estágio de um profilometer de varredura a laser.
    1. Ajuste o plano focal para mostrar claramente o padrão apresenta na bolacha usando o modo de observação "visão da câmera" sob uma lente objetiva de 20X.
    2. Mude o modo de observação de "visão da câmera" para "visão laser", e definir as posições superior e inferior dos recursos.
    3. Defina o modo de medição, área, qualidade, e z-pitch até transparente (em cima), 1 linha (1.024 x 1), de alta precisão e 0,5 mm, respectivamente, e, em seguida, pressione a parte inferior start para iniciar a medição.

2. Preparação de dispositivos PDMS para isolamento de células Individual

1. Antes de fundição PDMS, silanizar os moldes mestres com trichlorosilane para criar uma superfície hidrofóbica, o que torna mais fácil descolar as réplicas PDMS dos moldes mestre.
   1. Coloque os moldes de mestre e um barco ponderação contendo200 ul de triclorossilano num secador, e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 15 min.
   2. Pare o vácuo e, em seguida, deixar os moldes mestres no exsicador para silanizar os moldes mestres à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h.
   3. Retire os moldes mestres do exsicador e coloque cada molde mestre em um 10 centímetros placa de Petri.
2. Misturar uma quantidade total de polímero de PDMS kit de 17,6 g contendo uma base e um agente de cura a uma razão de 10: 1, e em seguida, despejar o PDMS no molde mestre na placa de Petri.
3. Colocar a placa de Petri num exsicador e aplicar vácuo (-85 kPa) durante 1 h para remover as bolhas de ar nas PDMS.
4. Remova a placa de Petri do exsicador e colocá-lo num forno convencional a 65 ° C durante 3-6 horas para curar o PDMS.
5. Retirar as réplicas PDMS curado a partir dos moldes mestres e dois furos como uma entrada e uma saída nas duas extremidades do microcanal no array PDMS réplica captura poços por um perfurador com diâmetro interior de 0.75 mm para o canal de fluidos (Figura 2A).
6. Use fita para limpar a superfície das réplicas de PDMS, e, em seguida, colocar o PDMS réplicas em um produto de limpeza de plasma por tratamento com plasma de oxigénio breve (100 watts durante 14 seg).
7. Remover o PDMS réplicas da máquina de plasma de oxigénio.
8. Alinhar uma réplica superior (contendo os micropoços de captura) e um PDMS inferior (contendo os micropoços de cultura) com a mão sob um microscópio estereoscópico e trazê-los em contato.
9. Coloque as réplicas PDMS alinhados num forno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir a ligação permanente entre as réplicas PDMS para formar o dispositivo final.
10. Embeber o dispositivo PDMS em uma desionizada (DI) -água recipiente cheio e colocar o recipiente em um exsicador sob vácuo (-85 kPa) durante 15 min para remover o ar a partir do microcanal do dispositivo de PDMS.
11. Coloque o dispositivo PDMS cheio de água desionizada em um capuz de cultura de tecidos e utilizam a luz UV (comprimento de onda da luz: 254 nm) para esterilizar o dispositivo para 30 min.
12. Substituir a água Dl no dispositivo de PDMS com uma albumina de soro bovino a 5% (BSA) em solução de PBS 1x e incubar a 37 ° C durante 30 min para evitar que as células se colem à superfície do PDMS.
    Nota: O revestimento de BSA é crítica para melhorar a eficiência da transferência de células isoladas a partir de captura de poços para cultura poços.
13. Substituir a solução de BSA a 5% no dispositivo de PDMS com solução 1x PBS esterilizado.

3. Preparação da suspensão de uma única célula

1. Cultura Neural stem KT98 célula, e A549 de células de carcinoma humano e MDA-MB-435 que, em uma placa de Petri em incubadora de cultura de célula convencional (37 ° C, 5% de CO _2, e 95% de humidade) para preparar as células para a experiência celular dispositivo PDMS .
2. Remover e descartar o meio de cultura gasto (meio basal DMEM fornecido com antibióticos 10% de soro fetal bovino e 1%) a partir do prato de cultura com células crescidas a 70-80% de confluência.
3. Lavar cuidadosamente as células com esterilizados PBS três vezes.
4. Retirar e descartar o PBS e adicionar 2 ml de uma mistura de enzima recombinante com proteolíticas, e atividades DNase colagenolíticas (por favor consulte a lista de materiais para informações detalhadas).
5. Incubar a placa de cultura à temperatura ambiente durante 5 min, e depois toque no prato de cultura para facilitar a separação celular.
6. Adicione 4 ml de PBS esterilizado para dispersar as células, e em seguida, transferir a suspensão celular para um tubo de 15 ml.
7. Centrifuga-se o tubo a 300 xg durante 3 min e remover o sobrenadante.
8. Suavemente ressuspender o sedimento celular em 1 ml de PBS esterilizado e contar o número de células vivas utilizando o método de exclusão com Trypan Blue padrão ^13.
   Nota: Esta etapa de ressuspensão é crítica para a preparação de suspensão de uma única célula bem dissociado para melhorar a eficiência de isolamento de uma única célula.

4. Isolamento de célula única e Cultura Clonal

1. Carga de 50 ul de suspensão celular a uma concentração de 2,2-2,5 x 10 ^{6 células / ml no microcanal do dispositivo PDMS via orifício de saída do dispositivo com uma pipeta de mão.
   Nota: O carregamento de pipeta suspensão de células precisa ser parado e realizada na primeira posição de paragem para evitar a introdução de bolhas de ar dentro do microcanal.}
2. Carregar mais 50 ul de suspensão de células através do orifício de entrada para preencher uniformemente-se todo o microcanal com células.
3. Fecha-se o orifício de saída com uma ficha (A, 1 mm de diâmetro cortado em nylon linha de pesca 3 milímetros de comprimento) para evitar o escoamento induzido pela pressão hidrostática das gotas em orifícios de entrada e de saída.
   Nota: Os tampões foram esterilizados UV dentro de um capuz de cultura de tecidos antes da utilização.
4. Encha uma seringa estéril 1 ml com meio de cultura, retire as bolhas de ar, e configurá-lo em uma bomba de seringa.
5. Ligar a forma carregada seringa para o orifício de entrada do dispositivo de PDMS através de uma agulha G 23 sem corte e uma tubagem de poli-tetrafluoroethene (PTFE).
6. Retire a ficha da furo de saída e todosow um intervalo de tempo de 2 min para permitir que as células a instalar-se nos unicelulares captura de poços por força gravitacional.
7. Lavar as células não confinadas com 300 ul de meio de cultura a uma taxa de fluxo de 600 mL / min impulsionado pela bomba de seringa.
8. Espera durante 2 min para estabilizar o aparelho, e vedar os orifícios de entrada e de saída com fichas de modo a formar um sistema de cultura fechada.
9. Virar o dispositivo com a mão para transferir as células individuais capturados para os micropoços de cultura.
10. Coloque o dispositivo PDMS em uma placa de cultura de tecido de 100-mm, e adicionar 10 ml de PBS esterilizado em torno do dispositivo de cultura para evitar a evaporação do meio do microcanal.
11. Mover o prato de cultura para uma incubadora convencional de cultura de células (37 ° C, 5% de CO _2, e 95% de humidade) para a cultura clonal das células individuais.

5. Meio de Cultura Reposição

1. Depois de 1 d de cultura, substituir o meio de cultura no dispositivo de PDMS com meio fresco para melhorar PR célulaoliferation.
2. Colocar duas gotas de meio de cultura na parte superior do dispositivo de PDMS perto das áreas de entrada e saída de buracos para evitar a introdução de bolhas de ar para dentro do microcanal, enquanto executa o passo seguinte.
3. Perfurar dois buracos da parte superior do dispositivo de PDMS perto das duas extremidades do microcanal como uma entrada e uma saída para o microcanal.
   Nota: Não perfurar toda a duas camadas do dispositivo PDMS; em vez disso, apenas perfurar através da camada superior do PDMS.
4. Conecte uma seringa de plástico de 1 ml contendo meio fresco para a entrada através de um G agulha romba 23 e tubos de PTFE.
5. Fluxo médio de 120 ul fresco para dentro do dispositivo durante 5 minutos para substituir o meio velho.
6. Inserir dois tampões para selar a entrada e a saída de furos, e devolver o dispositivo para a incubadora de cultura de células.
7. Refrescar o meio de cultura a cada 2 d durante o período de cultura, removendo os tampões de vedação, seguido pela repetição dos passos 5,4-5,5.

Resultados

A plataforma de microfluidos para o isolamento de uma única célula e de cultura compreende um micro-canal (200 um de altura) com dois conjuntos de matrizes de micropoços (Figura 2A). Os dois conjuntos de matrizes de micropoços são denominados como captura de poços (25 um de diâmetro e 27 uM em profundidade) e cultura poços (285 um de diâmetro e 300 mm de profundidade) para o isolamento de uma única célula e a cultura, respectivamente, e cada captura-se bem pos...

Discussão

Sistemas de dispositivo baseado em micropoços ^6,14 têm sido utilizados para a manipulação de uma única célula e análise, tal como uma única célula em larga escala prendendo ⁶ e proliferação de células-tronco hematopoiéticas único ^15. Embora o tamanho bem, número e forma podem ser ajustados a aplicações específicas, a eficiência de isolamento de uma única célula está sempre comprometida quando o tamanho do poço é aumentada. ^9,15

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
AutoCAD software	Autodesk	AutoCAD LT 2011	Part No. 057C1-74A111-1001
Silicon wafer	Eltech corperation	SPE0039
Conventional oven	YEONG-SHIN company	ovp45
Plasma cleaner	Nordson	AP-300	Bench-Top Plasma Treatment System
SU-8 50 negative photoresist	MicroChem	Y131269
SU-8 100 negative photoresist	MicroChem	Y131273
Spin coater	Synrex Co., Ltd.	SC-HMI 2" ~ 6"
Hotplate	YOTEC company	YS-300S
Msak aligner	Deya Optronic CO.	A1K-5-MDA
SU-8 developer	Grand Chemical Companies	GP5002-000000-72GC	Propylene glycol monomethyl ether acetate
Scanning laser profilometer	KEYENCE	VK-X 100
Trichlorosilane	Gelest, Inc	SIT8174.0	Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahydrooctyl. Hazardous. Corrosive to the respiratory tract, reacts violently with water.
Desiccator	Bel-Art Products	F42020-0000	Space saver vacuum desiccator 190 mm white base
Polydimethylsiloxane (PDMS) kit	Dow corning	Sylgard 184
Harris Uni-Core puncher	Ted Pella Inc.	15072	with 0.75 mm inner-diameter
Removable tape	3M Company	Scotch Removable Tape 811
Stereomicroscope	Leica Microsystems	Leica E24
Bovine serum albumin (BSA)	Bersing Technology	ALB001.500
DMEM basal medium	Gibco	12800-017
Fetal bovine serum	Thermo Hyclone	SH30071.03HI
Antibiotics	Biowest	L0014-100	Glutamine-Penicillin-Streptomycin
Recombinant enzyme mixture	Innovative cell technology	AM-105	Accumax
DiIC12(3) cell membrane dye	BD Biosciences	354218	Used as a cell tracker
Syringe pump	Harvard Apparatus	703007
Plastic syringe (1 ml)	BD Biosciences	309659
23 gauge blunt needles	Ever Sharp Technology, Inc.	TD21
Poly-tetrafluoroethene (PTFE) tubing	Ever Sharp Technology, Inc.	TFT-23T	inner diameter, 0.51 mm; outer diameter, 0.82 mm