Sistema de cultura de órgão de gordura corporal em Aedes Aegypti, um vetor de vírus Zika

Resumo

A gordura corporal é o órgão central metabólico em insetos. Apresentamos um sistema de cultura de órgãos vivos que permite ao usuário estudar as respostas do tecido isolado gordura corporal a vários estímulos.

Resumo

O inseto gordura corporal desempenha um papel central no metabolismo do inseto e armazenamento de nutrientes, funções do fígado e tecido adiposo em vertebrados de espelhamento. Tecido de inseto gordura corporal normalmente é distribuído por todo o corpo do inseto. No entanto, muitas vezes concentrada no abdômen e está ligado à parede abdominal do corpo.

O mosquito gordura corporal é a única fonte de proteínas da gema, que são críticas para a produção de ovos. Portanto, a cultura em vitro de tecidos de gordura corporal de mosquito representa um sistema importante para o estudo da fisiologia do mosquito, metabolismo e, finalmente, a produção de ovos. O processo de cultura de gordura corporal começa com a preparação de soluções e reagentes, incluindo as soluções de aminoácidos, Aedes sal estoque fisiológico (APS), solução estoque de cálcio e gordura corporal meio de cultura. O processo continua com a dissecação de gordura corporal, seguida por um tratamento experimental. Após o tratamento, uma variedade de diferentes análises podem ser executados, incluindo RNA (RNA-Seq) de sequenciamento, qPCR, borrões ocidentais, proteómica e metabolómica.

Na nossa experiência de exemplo, demonstramos o protocolo através da excisão e cultura dos corpos de gordura com o febre amarela mosquito, Aedes aegypti, um vetor principal de arbovírus incluindo dengue e chikungunya Zika. RNA de gordura corpos cultivadas sob uma condição fisiológica conhecida por proteínas de gema upregulate versus o controle foram objecto de análise de RNA-Seq para demonstrar o potencial utilitário deste procedimento para investigações de expressão gênica.

Introdução

Os mosquitos são vetores de doenças humanas devastadoras, incluindo a febre do dengue, malária, chikungunya e Zika^1,2,3. Apesar de intensos esforços internacionais para travar estas doenças e controlar populações de mosquitos transmissores de doenças, surtos epidêmicos de doenças transmitidas por mosquitos são ainda comuns, especialmente nos países em desenvolvimento. Vacinas eficazes contra muitas dessas doenças são indisponíveis ou de eficácia limitada,^4,5. A maneira mais eficaz para prevenir surtos é controlar as populações de mosquito, principalmente através do uso de tratamentos insecticidas. No entanto, resistência inseticida tem desenvolvido em muitas populações de mosquito e tornar-se um problema comum em torno do mundo^6,7,8. O estudo da fisiologia do mosquito é essencial para o desenvolvimento de novas ferramentas e estratégias para controlar a doença.

O mosquito gordura corporal desempenha um papel central no armazenamento de nutrientes, homeostase metabólica, reprodução e catabolismo xenobióticos^9,10,11,12. É o órgão principal de armazenamento de glicogênio, triglicerídeos e aminoácidos em forma de proteínas de armazenamento. Ele também funciona como o local de síntese para a maioria das proteínas hemolinfa e metabólitos. Em mosquitos, a gordura corporal é a única fonte de produção de proteína de gema que ocorre em mulheres, depois que eles tomam uma refeição de sangue^13,14.

O tipo de célula principal da gordura corporal é o trophocyte grande, poliploide ou adipócito^3,9,10,12. Tecido de gordura corporal é organizado em lóbulos ou casacos de pele e pode ser encontrado em todas as partes do corpo do mosquito, com a maior parte localizada no abdômen, onde grandes lóbulos de gordura corporal são anexados à parede abdominal do corpo.

O sistema de cultura de gordura corporal de mosquito aqui apresentado foi desenvolvido nos anos 70 e continua a ser uma poderosa ferramenta para estudar a fisiologia gordura corporal¹⁰, especialmente em combinação com as tecnologias atuais de análise. A fundação desta técnica baseia-se o isolamento das paredes abdominais corpo e o tecido associado gordura corporal. A natureza hidrofóbica da cutícula abdominal faz com que ele flutue na superfície do meio de cultura, com os lóbulos anexados de abdominal gordura corporal imergido. A estrutura tracheolar e espiráculos são mantidas, assegurando a oxigenação do tecido culta. De agora em diante, nos referiremos a estas preparações como "corpos de gordura". Isolada de gordura de corpos permanecem viáveis por mais de 12 h, quando incubados no meio adequado (resultados não publicados). Cultura de gordura corporal é uma ferramenta valiosa que abordou uma variedade de perguntas sobre a gordura corporal Endocrinologia e fisiologia^{9,10,12,15,16, 17}.

Corpos de gordura culturas pode ser submetidos a vários experimental e controlar tratamentos, o sincronismo dos quais pode ser decidido pelo investigador. No final do período de incubação, os corpos de gordura podem ser coletados e processados para análises a jusante, incluindo qPCR^16,17,18,19, mancha^{18 ocidental ,20}, proteomics²¹ou metabolomics²². Experiências podem ser executadas em diferentes escalas, de corpos de gordura individuais para grupos de centenas que podem ser cultivados juntos.

Os resultados representativos aqui incluídos foram derivados de gordura organismos cultivados na presença de aminoácidos e o isoinokosterone 20-hidroxi hormônio esteroide para simular a ativação de refeição de sangue de vitelogênese^{16,17, 23,24}. Analisamos e comparado a expressão diferencial do gene de não-ativado contra corpos de gordura ativados através de análise de sequenciamento de próxima geração.

Protocolo

1. preparar as soluções e reagentes

1. solução de aminoácidos
   1. Prepare um 4 X aminoácidos solução ^{23 , 24} por pesagem e adicionando os 20 aminoácidos diferentes para um Erlenmeyer de acordo com as concentrações dadas na tabela 1.
      Nota: Em alguns casos, amino acid(s) podem ser excluídos a solução e substituído por igual quantidade molar de manitol para manter uma concentração igual de osmólitos.
   2. Adicionar a quantidade apropriada de DDQ ₂ O para produzir o volume desejado da solução.
   3. Para garantir que os aminoácidos têm completamente dissolvido, aquecer suavemente agitando continuamente até que o líquido é completamente desobstruído; tomará em um ligeiro matiz amarelo.
      Nota: Pode ser necessário reduzir o pH para 6 adicionando HCl para permitir que alguns dos aminoácidos hidrofóbicos mais dissolver-se.
   4. Alíquota da solução e estéril-filtro usando um filtro de seringa com um 0,2 µm-pore tamanho.
   5. Loja em um recipiente selado a-20 ° C por até 6 meses.
2. APS
   Nota: ver ²⁵.
   1. Para o 20 X sal solução, combine os sais listados na tabela 2, em 50 mL de água. Mexa até dissolver completamente.
      Nota: Pode ser necessário aquecer ligeiramente a solução até dissolver completamente os sais.
   2. Estéril-filtro usando um filtro de seringa com um 0,2 µm-reduz o tamanho dos poros e armazenar a solução em um tubo de 50 mL em -20 ° C.
3. Solução estoque de cálcio
   1. para o 50 X solução estoque de cálcio, adicionar 100 mL de água (tabela 3) 0,90 g de cloreto de cálcio; mexa até dissolver completamente.
   2. Usando uma seringa estéril-filtro filtro com um tamanho de poro de 0,2 µm, alíquota da solução em tubos de 50 mL e armazenar a -20 ° C.
4. Tampão Tris (pH 7,4)
   1. para os Tris buffer, combinar as soluções listadas na tabela 4 e o sal e adicionar O ddH ₂ até 100 mL.
   2. Usando uma seringa estéril-filtro filtro com um tamanho de poro de 0,2 µm e alíquota da solução em tubos de 50 mL; armazenar à temperatura ambiente.
5. Meio de cultura de gordura corporal
   1. para preparar o meio de cultura de gordura corporal, preparar todas as soluções listadas acima.
   2. Combiná-los conforme os volumes na tabela 5 para fazer 200 mL de meio de cultura de gordura corporal.
   3. Ajustar o pH para 7,2 usando NaOH ou HCl.
   4. Estéril-filtrar a solução através de um filtro de seringa com um tamanho de poro de 0,2 µm.
   5. Dividir a solução em alíquotas de 15 mL e armazenar a-20 ° C por até 6 meses.

2. Preparando-se para dissecação

1. preparar um estereomicroscópio (ampliação de x de 10-20), com iluminação e esquematizar duas pinças ultra fina e um par de tesouras de dissecação micro.
2. Preparar todas as soluções necessárias para o experimento. Descongelar o meio de cultura de gordura corporal a temperatura.
   Nota: Precipitants podem ser dissolvidos ao aquecer a solução para não superior a 30 ° C.
3. Com um aspirador, coletar mosquitos fêmeas adultos (3-7 dias após a emergência) e anestesia usando dióxido de carbono ou gelo
   Nota: Uma vez anestesiado, os mosquitos devem ser mantidos sob CO ₂ para o menor tempo possíveis, não superior a 20 min. como alternativa, os mosquitos podem ser anestesiados em gelo e mantidos por aproximadamente 30 min.
4. Preparar uma placa de 6 com 3 mL de APS por alvéolo.

3. Dissecação de gordura corporal

1. concentrar o dissecação estereomicroscópio e ajustar a cadeira para uma altura confortável.
2. Colocar uma lâmina de microscópio côncava na superfície de microscópio e adicionar duas gotas de APS ao centro.
3. Pegar um mosquito por uma perna, usando uma pinça e transferi-lo para a superfície APS do slide de microscópio.
4. Cuidadosamente pega o mosquito pelo tórax, com a pinça na mão esquerda e gire o mosquito, de modo que o lado ventral para cima é.
5. , Mantendo o corpo firme pelo tórax, segure os dois últimos segmentos abdominais, com a pinça na mão direita e puxe delicadamente.
   Nota: Os dois últimos segmentos abdominais irão separar o abdômen e os ovários anexados, Malpighi túbulos, intestino grosso e intestino; às vezes a colheita irá deslizar fora do abdômen. Se eles não tiverem sido removidos, inserir as pontas fechadas da pinça no pequeno orifício criado e remover os tecidos remanescentes.
6. Anular a pinça direita e pegar a tesoura de mola. Deslize um pino no orifício no abdômen até o segmento abaixo do tórax. Suavemente e rapidamente cortar o abdômen longitudinalmente.
   Nota: Uma vez que o corte foi feito, o abdômen deve começar a expandir para o exterior, embora isto pode não ocorrer imediatamente.
7. Prosseguir para fazer o segundo corte, que será um corte lateral abaixo do tórax e ligeiramente abaixo de onde terminou o primeiro corte.
   Nota: O abdome deve então abrir e dissociar-se do tórax, com a cutícula acima e os corpos de gordura lateral-imerso dentro da APS. Esta parede abdominal do corpo é a preparação de gordura corporal para cultura em vitro.
8. Levantar os corpos de gordura a partir da solução APS usando a ponta de um par de pinças e transferi-los a partir da solução para a placa de 6 contendo APS à temperatura ambiente. Permitir que o tecido repousar antes de avançar para a cultura de gordura corporal com aproximadamente 0,5 h.

4. Gordura corporal cultura

1. incubar os corpos de gordura na APS em temperatura ambiente pelo menos 0,5 h equilibrar os.
2. Transferir os corpos de gordura com a ponta da pinça e retire-lhes fora a solução APS. Abaixe a ponta no meio de cultura de gordura corporal.
   Nota: A gordura corporal deve abrir na superfície do meio e flutuar livremente. A cultura de gordura corporal é normalmente realizada em placas de 96 poços, com 150-200 µ l de meio em cada poço. Um bem pode caber até três corpos individuais de gordura, e são viáveis por mais de 12 h (resultados pessoais inéditos).
3. Após o período de incubação, transferir os corpos de gordura do meio em tubos de centrífuga de 1,5 mL contendo os reagentes apropriados para processamento a jusante.
   Nota: As análises típicas incluem qPCR ^{16 , 17 , 18 , 19}, ^{18 ,} de mancha ocidental ²⁰, transcriptomics ²⁶, proteomics ²¹ ou metabolomics ²².

Resultados

Como exemplo, realizamos um experimento de cultura de gordura corporal e estimulou a corpos de gordura isolados incubando-os em uma solução contendo uma mistura equilibrada de todos os vinte aminoácidos naturais e a isoinokosterone 20-hidroxi inseto hormônio esteroide (10 µM) para 6 h . Como um controle, corpos de gordura foram incubados na APS por uma quantidade igual de tempo.

Após a incubação, o RNA total foi isolado usando um reagente tri²⁷ seguindo as instruções do fabricante. A qualidade e a quantidade de amostras de RNA extraídas foram avaliados usando um espectrofotômetro, fluorométrica quantificação e eletroforese em gel de agarose. Bibliotecas de sequenciamento de RNA foram geradas usando 4 µ g de RNA total e foram quantificadas usando duas técnicas diferentes. Posteriormente, as bibliotecas foram enviadas para um provedor comercial para final-sequenciamento emparelhado.

Os resultados deste experimento são mostrados na tabela 6. Genes, mostrando a mais forte resposta transcricional de aminoácidos e 20-hidroxiecdisona foram principalmente gema proteína genes, que está de acordo com anterior resultados¹¹.

A Figura 1 mostra um mapa de calor, indicando os níveis de expressão de gene de 1.256 diferencialmente expressos genes de corpos de gordura cultivados após dois tratamentos diferentes.

Figura 1 . Mapa de calor dos genes expressado na cultura de gordura corporal. O mapa de calor foi calculado com base no número de transcrições específicos para cada gene nas diferentes bibliotecas usando o pacote heatmap²⁸ que faz parte do ambiente de software a R. O tom mais escuro representa a maior expressão do gene. 1.256 genes com variação estatisticamente significativa na expressão (Q-valores < 0.05) são mostrados. Os genes estão ordenados de acordo com seus níveis de expressão média, indicados pela dendrograma à esquerda (não de acordo com suas relações filogenéticas). Observe o elevado número de genes com expressão de cima ou para baixo-regulado após estimulação com aminoácidos (AA) e 20-hidroxiecdisona (20E). APS = soro fisiológico de Aedes . Ver arquivo suplementar 1 para obter uma lista de genes e seus níveis de expressão relativa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Amino ácido	Peso molecular g/mol	mM concentração	mg por litro	mg para o volume de 300 mL
Alanina	89.1	26.68	2377.19	713.16
Arginina	174.2	26.68	4647.66	1394.3
Asparagina	150.1	26.68	4004.67	1201.4
Ácido aspártico	133	26.68	3548.44	1064.53
Cisteína	121.16	10,68	1293.99	388.2
Ácido glutâmico	147.1	26.68	3924.63	1177.39
Glutamina	146	26.68	3895.28	1168.58
Glicina	75	53.32	3999	1199.7
Histidina	155,16	80	12412.8	3723.84
Isoleucina	131	10,68	1399.08	419.72
Lycine	183	26.68	4882.44	1464.73
Leucina	131	26.68	3495.08	1048.52
Fenilalanina	165	10,68	1762.2	528.66
Prolina	115	26.68	3068.2	920.46
Serina	105	53.32	5598.6	1679.58
Treonina	119	10,68	1270.92	381.28
Triptofano	204	10,68	2178.72	653.62
Tirosina	181	5.32	962.92	288.88
Valina	117	10,68	1249.56	374.87
Metionina	149	10,68	1591.32	477.4

Tabela 1. 4 x solução estoque de ácido aminado.

Componente de	Peso em gramas adicionadas ao 50ml ddH2O
NaCl	8,0 g
KCl	0,074 g
MgCl2-6 H2O	0,120 g
NaHCO3	0,0250 g

Tabela 2. Solução de sal de 20 X.

Componente de	Peso em gramas adicionadas ao ddH2O 100ml
CaCl2-2 H2O	0,90 g

g > tabela 3. 50 x solução cálcio.

Componente de	Concentração da solução-mãe	Estoque de volume para 100 ml de tampão
Tris pH 8.0	1 M	5 mL
EDTA	0,25 M	2 mL
NaCl	AT	0,3 g
ddH2O	AT	a 100 mL (~ 93 mL)

Tabela 4. Tampão Tris.

Componente de	Estoque de volume para 200 ml
Solução de aminoácidos	150 mL
Solução-mãe de sal	10 mL
Solução de reserva de cálcio	4 mL
TES de Buffer	10 mL
ddH2O	26 mL

Tabela 5. Meio de cultura de gordura corporal.

Anotação	Descrição do gene	Dobre a mudança	P-valor
AAEL006138	Vitellogenin-B	3443	2.52E-112
AAEL006126	Vitellogenin-C	2795	8.64E-91
AAEL006563	carboxipeptidase vitelogênicos	1002	2.17E-119
AAEL010434	Vitellogenin-A	220	1.14E-27
AAEL006542	carboxipeptidase vitelogênicos	185	2.14E-65
AAEL012678	AAEL003006-PA [Aedes aegypti](65%)	96	4.00E-70
AAEL000080	proteína hipotética	82	6.69E-188
AAEL015312	Vitelogênicos catepsina B	77	1.27E-15
AAEL009588	receptor nuclear 3	75	4.58E-56
AAEL010529	proteína hipotética	66	1.32E-29

Tabela 6. Resultados experimentais.

Arquivo suplementar 1. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussão

Cultura de inseto órgão foi amplamente utilizada para estudar o inseto Endocrinologia e metabolismo, bem como para investigar a interação entre órgãos específicos e bactérias simbiontes^{29,30,31, desenvolvimento 32,33,34}. In vitro cultura órgão de gordura corporal foi utilizada especificamente para estudar o transporte de aminoácidos e a regulação da produção de proteína de gema em mosquitos e outros Diptera^{16,17,35 , 36}. durante o processo de vitelogênese, o mosquito gordura corporal usa uma matriz de transportadores de aminoácidos de alta especificidade para importar aminoácidos derivados de farinha de sangue da hemolinfa para sintetizar grandes quantidades de proteínas de gema^{12 ,19,35,36}. Cultura de gordura corporal foi fundamental para a delimitação dos requisitos nutricionais gordura corporal neste contexto¹⁸.

A qualidade das matérias-primas, mosquitos fêmeas, é crítica para o sucesso dessas experiências. Larvas de mosquito, erguido em condições sob-lotado e alimentados com dietas de alta-nutriente geralmente produzem os melhores resultados. Existem algumas variáveis importantes a serem considerados ao estabelecer as condições de cultura de gordura corporal de mosquito no laboratório em termos de design experimental. Mostramos em estudos anteriores que a expressão do gene de gordura corporal varia significativamente dependendo da história de vida individual e o estado nutricional do mosquito^11,22. As condições de cultura mosquito devem ser uniformes para reduzir a variabilidade no tamanho e reservas nutricionais dos mosquitos experimentais. Além disso, pessoal, realizando as dissecações deve ser treinado para garantir a dissecações rápidas e exatas com resultados consistentes. Viabilidade celular em corpos isolados de gordura pode ser verificada utilizando diferentes métodos coloração^37,38.

O delineamento experimental de um experimento de cultura de gordura corporal deve levar em consideração o número de dissecações possível em um determinado período de tempo. Quando grandes quantidades de gordura corpos são necessárias, várias sessões de dissecação ou dissectors múltiplo podem ser necessários. Há uma vasta gama de aplicações futuras em vitro cultura de gordura corporal em mosquitos e outros insetos. Será especialmente útil para testar potenciais candidatos a fármacos para controle de insetos. A utilização das técnicas transgênicas em insetos para expressar proteínas específicas repórter na gordura corporal trophocytes abrirá novos métodos para desenvolver os bioensaios poderosos para o estudo da fisiologia de gordura corporal.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Scissors	Fiskars	83872
Fly pad	Genesee Scientific	789060
Battery-powered aspirator w/ collection vial	Hausherrs Machine Works, Inc.	3740-01-210-2368
Fine tip forceps	World Precision Instruments, Inc.	500085
Light microscope	Leica Microsystems
96 well plate	Sigma	CL S3383
Sucrose	Sigma	S9378
Alanine	Sigma	A7627
Arginine	Sigma	A5006
Asparagine	Sigma	A0884
Aspartic Acid	Sigma	A9256
Cysteine	Sigma	W326305
Glutamic Acid	Sigma	G1251
Glutamine	Sigma	G3126
Glycine	Sigma	G2879
Histidine	Sigma	H6034
Isoleucine	Sigma	I2752
Lysine	Sigma	L5501
Leucine	Sigma	L8000
Phenylalanine	Sigma	P2126
Proline	Sigma	P0380
Serine	Sigma	S4500
Threonine	Sigma	T8625
Tryptophan	Sigma	T0254
Tyrosine	Sigma	T3754
Valine	Sigma	V0500
Methionine	Sigma	M9625
NaCl	Sigma	S7653
KCl	Sigma	P9333
MgCl2-6H2O	Sigma	M2670
NaHCO3	Sigma	S5761
CaCl2-2H2O	Sigma	C8106
Tris pH8.0	Sigma	T1503
EDTA	Sigma	E6758
ddH2O	Sigma	W4502