Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Resumo

Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

Resumo

Com precisão e confiabilidade identificar a orientação espacial da retina do rato isolado é importante para muitos estudos em neurociência visual, incluindo a análise da densidade e tamanho gradientes de tipos de células da retina, a direção de afinação de direção-seletivo células ganglionares e o exame dos padrões topográficos degeneração em algumas doenças da retina. No entanto, existem muitos métodos diferentes de dissecação ocular relatados na literatura que são usados para identificar e rotular a orientação da retina na retina do rato. Enquanto o método de orientação utilizado em tais estudos é muitas vezes esquecido, não relata como retinal orientação é determinada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são comumente usados, mas recentemente foram mostrados para ser menos confiáveis do que os marcos mais profundos, como os músculos reto, fissura coroide ou gradiente s-opsina. Aqui, nós fornecemos um guia completo para o uso do fundo oculares Marcos de precisão de dissecar e documentar a orientação espacial de uma retina de rato isolado. Temos também comparou a eficácia de dois anticorpos s-opsin e incluiu um protocolo para s-opsin immunohistochemistry. Porque a orientação da retina de acordo com o gradiente s-opsin requer reconstrução da retina com o software Retistruct e rotação com código personalizado, apresentamos os passos importantes necessários para usar os dois destes programas. No geral, o objetivo do presente protocolo é entregar um conjunto confiável e reproduzível de métodos para exata orientação da retina que é adaptável aos protocolos mais experimentais. Um objectivo fundamental deste trabalho é a padronização de métodos de orientação da retina para futuros estudos.

Introdução

Um aspecto importante e às vezes negligenciado da neurociência da retina é a orientação correta e a análise da retina toda montagem isolada, seja a orientação de uma retina em uma câmara de gravação de eletrofisiologia ou sobre lâmina histológica. Isto é particularmente importante para os estudos envolvendo a retina do rato, que é atualmente o modelo mais amplamente utilizado para investigações do sistema visual de mamíferos. Descobertas recentes revelam que a retina do rato não é espacialmente uniforme mas tem gradientes de densidade e tamanho dos tipos de células da retina funcionalmente distintos, tais como células ganglionares de melanopsina, transientes células ganglionares de OFF-alfa e opsins cone^{1,2 ,3,4,5}. Por conseguinte, o método utilizado para determinar a orientação da retina pode afetar os resultados experimentais envolvendo a célula tipo ou opsina distribuições^2,3,6, direção ajuste de direção-seletivo gânglio células^7,8,9e padrões topográficos de degeneração da retina^{10,11,12,13,14} . Na verdade, não relatório orientação como da retina é relatada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Portanto, é vital que os investigadores relatam o método para identificar a orientação da retina para que os resultados de tais estudos podem ser interpretados com precisão.

Orientação da retina é geralmente identificada, marcando a córnea dorsal, ventral, nasal ou temporal antes da Enucleação ocular^{1,3,12,15,16,17 ,18,19} ou por corte ou coloração marcos anatômicos profundos olhos tais como os músculos extra-oculares^6,7, a coroide fissura^20,21, ou o s-opsin gradiente^2,3. Os músculos retos podem ser usados para identificar o dorsal, ventral, nasais e a retina temporal, fazendo um corte profundo alívio que corta a ligação de qualquer um o reto superior, reto inferior, reto medial, o músculo reto lateral, respectivamente. No entanto, para a maioria dos experimentos, usar um músculo reto é suficiente para orientar a retina²². A fissura coroide, que é um remanescente do desenvolvimento do olho, pode ser vista como uma ténue linha horizontal na parte de trás do olho. Cada extremidade desta linha termina na nasal ou polo temporal do globo,²³. Finalmente, expressão de s-opsin assimetricamente é distribuído para a retina ventral em camundongos, e anticorpos opsin-s podem ser usados para revelar a retina ventral em imuno-histoquímica experiências¹.

Trabalho recente de Stabio, et al ²² demonstraram que Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são um método menos confiável para orientar a retina no espaço anatômico, provavelmente devido a erro humano e variabilidade em fazer a queimadura da córnea quando usando o temporal e medial canthi como pontos de referência. Em contraste, Marcos profundos, tais como o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina, foram mostrados para ser mais confiáveis e precisos para orientar a retina²²Marcos. No entanto, a identificação destes pontos anatômicos requer etapas de dissecação exclusivos que não são descritas em detalhes na literatura. Assim, o objetivo do presente protocolo é fornecer um tutorial completo sobre como usar o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina para identificar com precisão a orientação espacial da retina do rato. Além disso, incluímos uma comparação da eficácia dos dois anticorpos s-opsina, bem como um protocolo para s-opsin immunohistochemistry.

Um desafio adicional para estudos baseando-se na orientação precisa da retina é os grandes cortes de alívio necessários para achatar as retinas wholemount em uma câmara de gravação, prato ou slide. Isto pode apresentar desafios para a análise do que é naturalmente uma estrutura tridimensional, quando ela é imaginada como uma estrutura bidimensional plana. Um programa chamado Retistruct²⁴ pode ser usado para retornar uma retina plana wholemount a sua estrutura tridimensional antes dos dados coletados a partir dele são analisados. Assim, uma seção do presente protocolo é dedicada a destacar as etapas que são necessárias para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas de rato de immunostained s-opsina. Também incluímos uma seção de protocolo para usar nosso script personalizado do MATLAB, que foi desenvolvido para rato com precisão girar e orientar as retinas manchadas com s-opsina.

Protocolo

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (IACUC) de The Universidade de Akron e institucional Cuidado Animal.

1. usando o marco do músculo reto Superior para identificar a orientação da retina

Nota: O músculo reto superior é um marco para a retina dorsal (tabela 1). Se o experimento não requer a marcação da retina dorsal, ignorar a etapa 1 e continuar para o passo 2.

1. Siga seu protocolo institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado para eutanásia de rato.
2. Para identificar a orientação geral do globo, fazer uma queimadura marcar na córnea dorsal diretamente entre os canthi nasal e temporal, perto da fronteira de córnea-esclera imediatamente após eutanásia (Figura 1A). Deixar a queimadura marca por aquecer uma caneta de cautério por dez segundos e então tocar a ponta da caneta para a dorsal córnea por menos de um segundo.
   Nota: Segurando a caneta de cautério para a córnea por muito tempo fará com que o globo para punção.
   Nota: Enquanto algumas canetas de cautério emitir luz, a caneta de cautério, constantes da Tabela de materiais não emite qualquer luz quando aquecido, tornando-se uma opção segura para experimentos de vez.
3. Para Enucleação, use pinça curva suavemente empurre o olho fora de seu soquete e aderência do globo da debaixo. Não corte o nervo óptico para remover o globo; em vez disso, lentamente, levante o globo da tomada enquanto simultaneamente movê-lo suavemente da esquerda para a direita até que a globo é liberado do soquete.
   Nota: Esta proposta permitirá que os músculos reto permanecer anexado ao Globo quando o mundo finalmente retirar completamente da tomada. O nervo óptico também frequentemente permanecerá presa ao globo.
4. Transferi o globo com os músculos reto anexado em uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Certifique-se de manter o controle de qual olho é o olho esquerdo e que é o olho direito.
   Nota: O Dissecador deve usar um meio apropriado de dissecação que se alinha com seu protocolo experimental.
5. No âmbito da dissecação, localizar visualmente a queimadura da córnea dorsal e identificar o músculo reto superior com qual é associado (Figura 1A).
6. Usando uma tesoura de dissecação ou 20 G (0,9 x 25 mm) agulha (ver Tabela de materiais), punção da córnea com a marca de queimadura. Fazer um profundo alívio da corte no globo em direção do nervo óptico que dividem o músculo superior. Uma retina isolado e reconstruído com esse corte é mostrada nas Figuras 1B e 1C.
7. Comece a isolar a retina usando dois conjuntos de pinças (ver Tabela de materiais) para arrancar suavemente o buraco feito com a punção na etapa 1.6 até parte da retina é exposta.
   Nota: É importante que isto seja feito suavemente, como rasgar demasiada força pode causar o corte aliviando a rasgar ainda mais.
8. Use fórceps para arreliar distante a retina da esclera até a esclera foi completamente removida. Remova a íris, lente, vítreo e todas as restantes estruturas com pinça até a retina é completamente isolada.
   Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Se o tecido é fixado para s-opsin immunohistochemistry, vá para a etapa 3.5.

2. usando o marco da fissura coroide para identificar a orientação da retina

Nota: A fissura coroide está presente na esclera na parte de trás do olho e é executado do polo temporal ao polo nasal (figuras 2B e 2C; Tabela 1).

1. Siga o protocolo institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado para eutanásia de rato.
2. Para identificar a orientação geral do globo, fazer uma queimadura marcar na córnea dorsal diretamente entre os canthi nasal e temporal, perto da fronteira de córnea-esclera imediatamente após eutanásia(Figura 2). Deixar a queimadura marca por aquecer uma caneta de cautério por dez segundos e então tocar a ponta da caneta para a dorsal córnea por menos de um segundo.
   Nota: Segurando a caneta de cautério para a córnea por muito tempo fará com que o globo para punção.
3. Enucleate o olho e transferir o globo em uma placa de Petri contendo meio de dissecação. Certifique-se de manter o controle de qual olho é o olho esquerdo e que é o olho direito.
   Nota: O Dissecador deve usar um meio apropriado de dissecação que se alinha com seu protocolo experimental.
4. Visualmente, localizar e identificar a fissura coroide na parte de trás do olho (Figura 2B, 2C).
   Nota: A fissura coroide é também visível dentro a viseira sob luz de infravermelhos²⁰.
5. Oriente o globo na prato de Petri de modo que a queimadura dorsal situa-se no polo superior, como seria se os olhos estavam ainda no mouse.
   Nota: A presença de dorsal queimadura permite a identificação do lado nasal e temporal do globo, desde que seja um olho direito ou esquerdo tem sido documentada: é o olho direito, a fissura coroide nasal se à direita da queimadura e a tempora fissura coroide l será para a esquerda da queimadura. Se é um olho esquerdo, a fissura coroide temporal será para a direita da queimadura e a fissura coroide nasal será para a esquerda da queimadura.
   Usando uma tesoura de dissecação ou 20 G (0,9 x 25mm) agulha (ver Tabela de materiais), fazer uma punção no globo onde se situa a queimadura dorsal.
6. Fazer um alívio raso corte em direção ao nervo óptico onde se situa a queimadura da córnea dorsal. Este corte será perpendicular à fissura coroide, permitindo a identificação da retina dorsal após isolamento (Figura 2D).
7. Fazer os seguintes dois cortes profundo alívio em direção ao nervo óptico: um alinhando as lâminas da dissecação tesouras acima com a linha temporal fissura coroide na parte de trás do olho, e um alinhando as lâminas da dissecação tesouras acima com a coroide nasal linha de fissura na parte de trás do olho. Estes cortes são mostrados em uma retina isolado e reconstruído em Figura 2D e 2E.
   Nota: Como alternativa, um corte profundo pode ser feito no temporal fissura coroide e um corte superficial pode ser feito na fissura coroide nasal, fazendo com que a queimadura da córnea dorsal corte desnecessário. Isto permite a orientação exata da retina com menos cortes de alívio.
8. Comece a isolar a retina usando dois conjuntos de pinças (ver Tabela de materiais) para arrancar suavemente o buraco feito com a punção nas etapas 2.7 e 2.8 até parte da retina é exposta.
   Nota: É importante que isto seja feito suavemente, como rasgar demasiada força pode causar o alívio cut(s) rasgar mais.
9. Use fórceps para arreliar distante a retina da esclera até a esclera foi completamente removida. Remova a íris, lente, vítreo e todas as restantes estruturas com pinça até a retina é completamente isolada.
   Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Se o tecido é fixado para s-opsin immunohistochemistry, vá para a etapa 3.5.

3. rotulagem gradiente S-opsin na Retina do rato

Nota: A expressão de fotopigmento s-opsin é assimetricamente distribuída à retina ventral¹, tornando-se um excelente marcador para a metade ventral da retina. Este método só é útil para fixo e tecido immunostained (tabela 1). As etapas a seguir podem ser aplicadas a retina que têm sido dissecada usando qualquer um dos métodos acima mencionados.

1. Siga o protocolo institucional Cuidado Animal e Comitê de uso aprovado para eutanásia de rato.
2. Imediatamente após a eutanásia, enucleate o olho e coloque o globo em uma placa de Petri com meio de dissecação. Certifique-se de manter o controle de qual olho é o olho esquerdo e que é o olho direito a fim de identificar a orientação da retina a retina é dissected.
   Nota: O Dissecador deve usar um meio apropriado de dissecação que se alinha com seu protocolo experimental.
3. Comece a isolar a retina usando dois conjuntos de pinças (tabela de materiais) suavemente vasculhar um buraco na córnea até parte da retina é exposta.
   Nota: É importante que isto seja feito suavemente, como rasgar demasiada força pode causar a retina para rasgar.
4. Use fórceps para arreliar distante a retina da esclera até a esclera foi completamente removida. Remova a íris, lente, vítreo e todas as restantes estruturas com pinça até a retina é completamente isolada.
   Nota: O protocolo pode ser uma pausa aqui. Se usar a retina para um ex vivo experimentar, realizar o experimento antes de executar as etapas a seguir.
5. Usando tesouras de dissecação, faça quatro cortes alívio na retina para que ela fica plana. Monte do retina gânglio célula-lado na membrana de nitrocelulose (Tabela de materiais) pressionando suavemente cada canto da retina para a membrana com fórceps.
   Nota: A localização dos cortes alívio pode ser arbitrária quando usando o gradiente s-opsina para orientação da retina.
6. Transferência da retina montada para o primeiro poço em uma placa de 24 (Tabela de materiais) usando fórceps, preenchido com 1 mL de paraformaldeído 4% (Tabela de materiais) para fixação. A placa de 24 em um agitador orbital à temperatura ambiente (Tabela de materiais) e fixar a retina para exatamente 40 min.
   Nota: Todas as seguintes etapas de lavagem e incubação devem ser preenchidas com a placa de 24 em um agitador orbital.
7. Lave a retina durante 15 minutos à temperatura ambiente por transferi-lo para o segundo bem preenchido com 1 mL de PBS 0,1 M. Repita duas vezes por sequencialmente, transferindo a retina para 0,1 M PBS-enchido terceiros e quarto poços.
8. Transferir a retina montada para o quinto bem contendo 1 mL de bloqueio solução (1,7% Triton X-100 e 5,2% burro soro normal em PBS 0,1 M; ver Tabela de materiais) e incubar durante a noite a 4 ° C.
9. Adicione o anticorpo primário de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) para a solução de bloqueio em uma concentração de 1: 500 e incubar durante três dias a 4 ° C.
10. Lave o excesso anticorpo primário da retina seis vezes, sequencialmente, colocando-o em seis poços preenchidos com 1 mL de PBS 0,1 M durante 10 minutos à temperatura ambiente.
11. Coloque a retina em um poço com solução fresca de bloqueio (1,7% Triton X-100 e 5,2% burro soro normal em PBS 0,1 M) e adicione o anticorpo secundário da burro anti-coelho Alexa-594 (ver Tabela de materiais). Incubar a retina com o anticorpo secundário durante a noite a 4 ° C.
12. Lave o excesso anticorpo secundário da retina seis vezes, em sequência, colocando-o em seis poços preenchidos com 1 mL de PBS fresco de 0,1 M por 10 min à temperatura ambiente.
13. Usando fórceps, transferi a retina montada para uma placa de Petri contendo PBS 0,1 M. Lançamento da retina pela membrana de nitrocelulose, inserindo suavemente as pontas da pinça entre a retina e a membrana até a retina já não está ligada.
14. Montar a retina em um vidro de microscópio por suavemente examiná-lo com pinça até a retina adere ao vidro e retirar a lâmina da caixa de Petri.
15. Cobrir a retina do slide com Aquamount e cubra-o com uma lamela #1.5. Coloque o slide em uma bandeja de slide (ver Tabela de materiais) e deixe-o sentar-se à temperatura ambiente por uma hora.
16. Retornar o escorrega para o frigorífico e a loja em uma bandeja de slide (ver Tabela de materiais) a 4 ° C, quando não estiver em uso. Depois que o slide foi coverslipped por 24 horas, use esmaltes para selar os lados da lâmina para evitar a dessecação.
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.

4. usando reconstruída Retinas Immunostained com S-opsina para identificar a orientação da retina

1. Visualizar o gradiente s-opsina com um microscópio confocal ou um microscópio de epifluorescente com um acessório da câmera (consulte Tabela de materiais) e a imagem da retina para que a retina inteira é visível em uma imagem (Figuras 1B, 2D, 3A e 3D). isso pode ser feito pela imagem da retina em seções na ampliação baixa e depois costura as imagens juntos.
2. Nome as retinas, então eles são identificáveis. Por exemplo, nomeie a primeira retina para ser reconstruído "Retina1".
3. Baixe e instale o ImageJ em https://imagej.nih.gov/ij/download.html.
4. Crie uma pasta individual para cada retina que precisa ser reconstruída, mas deixar as pastas vazias. Por exemplo, crie uma pasta intitulada "Retina1". Todos os arquivos necessários para reconstruir este retina serão colocados nesta pasta nas etapas subsequentes.
   Nota: Os únicos arquivos que nessas pastas devem conter são os arquivos que estão a ser analisados pela Retistruct. Quaisquer arquivos que não sejam aqueles detalhada abaixo fará com que a retina incapaz de ser aberto pelo software Retistruct.
5. Abra a imagem da retina no ImageJ selecionando arquivo → abrir e em seguida, escolhendo "Retina1".
6. Sem fazer nenhuma alteração na imagem, salve-o como "Image. png" para a pasta intitulada "Retina 1", selecionando o arquivo, → → salvar como PNG.
   Nota: O arquivo deve ser nomeado "Image. png" para que o software Retistruct reconhecer o arquivo como uma retina para reconstrução.
7. Use a ferramenta de linha segmentada para delinear as bordas da retina. Clicando-se em dois pontos adjacentes na fronteira da retina, a ferramenta de linha segmentada será essencialmente "ligar os pontos" entre os dois pontos adjacentes, criando uma estrutura de tópicos. Repita até que a retina inteira tem sido descrita. Salvar o contorno de retina como "outline.roi" para a pasta intitulada "Retina1" selecionando Analyze → ferramentas → → Gerenciador de ROI adicionar [t] → mais → salvar.
   Nota: A borda da retina pode ser identificada onde o s-opsin coloração transições para o fundo.
8. Use a ferramenta de linha segmentada conforme instruído na etapa 4.7 para delinear a fronteira do disco óptico. Salvar o contorno do disco óptico como "od.roi" para a pasta intitulada "Retina1" selecionando Analyze → ferramentas → → Gerenciador de ROI adicionar [t] → mais → salvar.
   Nota: O disco óptico é identificado como um pequeno buraco no meio da retina e irá variar com base na qualidade de dissecação.
   Nota: Todos os arquivos necessários para a reconstrução de Retistruct ("Image. png", "outline.roi" e "od.roi") devem agora ser salvo na pasta "Retina1".
9. Para baixar, instalar e abrir o programa Retistruct, siga as instruções descritas no guia do usuário Retistruct encontrado na seção de materiais suplementares de Sterratt, et al ²⁴
10. Uma vez que o Retistruct apareceu a janela, clique no ícone "Open" no topo esquerdo da janela do e selecione a pasta do diretório "Retina1".
11. Uma janela de imagem irá aparecer indicando que nenhuma barra de escala existe. Clique em "Fechar" e uma imagem da retina irá aparecer na caixa. Visualizar o contorno da retina, clicando no botão "Propriedades" na parte superior direita da cor de contorno da janela e mudança para uma cor visível (Figura 5A).
12. IMPORTANTE: Especifica se a retina de um olho direito ou o olho esquerdo no painel da esquerda (Figura 5A).
13. Clique no botão "Adicionar Tear" à esquerda e especificar onde uma lágrima ou corte é na retina, clicando sobre os três vértices do rasgo (Figura 5A). Isto irá criar linhas que conectam os três vértices do corte. Repita para todos os cortes na retina.
14. Especifica a retina dorsal clicando em um ponto arbitrário do contorno da retina. Uma letra maiuscula "D" aparecerá nesse ponto no contorno (Figura 5B).
    Nota: A retina dorsal será a parte mais escura da retina, em frente o gradiente s-opsina. No entanto, marcando a retina dorsal em Retistruct não é um método confiável para identificar a metade dorsal da retina, para a marcação de "dorsal" possa ser arbitrária nesta etapa.
15. Reconstruir a retina clicando no botão "Retina reconstruir" no topo esquerda da tela (Figura 5B). Uma trama polar da retina reconstruída será exibida com os cortes visíveis na mesma cor como o contorno (Figura 5-C).
16. Clique no botão "Salvar" no lado direito da tela para que a retina reconstruída e todos os dados associados a ele é salvo no diretório pasta "Retina1" (Figura 5-D).
17. Salve a retina reconstruída clicando no botão "PDF" no painel da direita (Figura 5-D). Uma caixa aparecerá pedindo especificações de tamanho. O tamanho padrão é aceitável para as etapas seguintes. Esta ação irá salvar a retina reconstruída como "image.polar.pdf" no diretório pasta "Retina1".
18. Abra o "image.polar.pdf" em um programa de pintura (ou outro programa de manipulação de imagem) e usar a ferramenta "Paint Bucket" (ou similar) para mudar o fundo da retina reconstruído para preto. Salve a retina reconstruída como um arquivo. tif, como "Retina1_reconstructed.tif" no diretório pasta "Retina1".
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
19. Baixe o código MATLAB para rotativas da retina chamada "Retina_Rotator.m" (ver materiais suplementares). Coloque o arquivo de código em sua própria pasta com nenhum outros arquivos na pasta.
20. Abrir o MATLAB, versão 2007b ou mais tarde. Clique duas vezes sobre o arquivo de código para abri-lo no MATLAB. Na janela comando, digite "Retina_Rotator" e em seguida pressionar a tecla enter. Aparecerá uma janela de pesquisa.
    Nota: O código é específico para arquivos. tif. Se o arquivo a ser girados não está no formato correto, o código não rodará a retina corretamente. Consulte as etapas 4.17 e 4.18. para salvar a retina reconstruída no formato adequado.
21. Abra o arquivo a ser girados. Por exemplo, escolha "Retina1_reconstructed.tif". O código então irá analisar a retina reconstruída e salvará automaticamente a retina girada como "Retina1_reconstructed_rotated.tif" na pasta onde se encontra o arquivo original.
22. Após o código terminou de analisar a retina, uma janela aparecerá também mostrando as imagens da retina antes e após a rotação para comparação (figuras 3B e 3C; Figuras 3E e 3F).
    Nota: Este código gira a retina reconstruída para que a metade (mais brilhante) ventral é na parte inferior e a metade dorsal (mais escuro) é na parte superior, assim, orientando com precisão a retina de acordo com o gradiente s-opsin¹. Se se a retina é de um olho direito ou o olho esquerdo tem sido documentado, a localização dos polos nasais e temporais também pode ser extrapolada deste método de orientação (Figura 3).

Resultados

Um único corte de alívio que corta o músculo reto superior com precisão e confiantemente identifica a retina dorsal (Figura 1). A fissura coroide com precisão e confiabilidade identifica a retina nasal e temporal com cortes profundos de alívio ao longo da fissura coroide temporal e nasal (Figura 2). Neste exemplo, um corte de alívio também fez na retina dorsal a fim de identificar o eixo dorsal/ventral da retina (Figura 2D, seta vertical). As etapas destes processos são mostradas com fins de replicação por futuros dissectors. Uma combinação de imuno-histoquímica s-opsina (Figura 3A e 3D), reconstrução com software Retistruct (3B, 3E) e rotação exata com um código personalizado do MATLAB (3 C, 3F) permitem a identificação das metades ventrais e dorsais da retina, bem como os polos nasais e temporais se sabe se a retina é de um olho esquerdo ou direito (Figura 3). Nós também comparamos dois anticorpos primários de s-opsin comumente usados para a eficácia da rotulagem cones s-opsina (Figura 4A-D): ambos o bode anticorpo primário anti-s-opsin e o anticorpo primário de coelho anti-s-opsin efetivamente etiqueta s-opsin conoides (Figura 4E) o mouse mesmo.

Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas à orientação determinada pelo gradiente s-opsina. Usando nosso personalizado MATLAB código as retinas (ver Materiais suplementares), com precisão foram girados para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada ventralmente, colocando, assim, verdadeira dorsal em 90 ° (para reto superior), verdadeiro nasal em 0 ° (para nasal fissura coroide) e verdadeiro temporal em 180 ° (para temporal fissura coroide). O valor de cada indivíduo aliviar corte ângulo foi determinado usando a ferramenta de ângulo no ImageJ após as retinas foram giradas de acordo com o gradiente s-opsina. Um ângulo médio foi calculado para cada alívio cortar o tipo e o valor médio de cada tipo de corte alívio foi então plotado em um terreno polar (Figura 6). Em média, cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; A Figura 6).

Figura 1: usando o músculo reto superior para identificar com precisão a retina de um olho direito dorsal. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização (seta branca). O músculo reto superior é também visível neste modo de exibição (seta branca). (B) um exemplo de um todo montado retina com um alívio de corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. Seta retrata o profundo alívio corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. A retina está manchada com o anticorpo primário cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (C), A retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver Material suplementar) com o reto superior muscular aliviando corte visível (seta branca). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: usando a fissura coroide para identificar com precisão os polos nasais e temporais da retina de um olho direito. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização. (B) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera (seta branca). A queimadura da córnea dorsal é também visível neste ponto de vista, localizado a cerca de 90° a partir da fissura coroide temporal. (C) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera, viajando do nervo óptico à fronteira córneo-escleral. (D), A retina manchada de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano), com cortes de fissura coroide (horizontal as setas) e o alívio dorsal corte (seta vertical). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (E) uma retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver material suplementar) com o corte de alívio dorsal e os cortes nasal e temporal fissura coroide visíveis (setas brancas). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: usando o gradiente s-opsina para identificar todos os quatro polos da retina. (A), um exemplo de uma retina dissecado de um olho direito que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (B) os resultados da reconstrução da retina em A com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi executada através do código personalizado do MATLAB (ver Materiais suplementares). (C) os resultados da retina na com o código personalizado de giro. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho direito, o polo temporal está localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo nasal é localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. (D) um exemplo de uma retina dissecado de um olho esquerdo que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (E) os resultados da reconstrução digitalmente a retina em D com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi girada pelo código personalizado. (F) os resultados de rotativas da retina em D com código personalizado. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho esquerdo, o polo nasal é localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo temporal está localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: comparação de dois anticorpos primários s-opsin na rotulagem cones s-opsin. (A), A retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (B) outra retina do rato mesmo corados com anticorpo primário de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (C) A região representativa (0,1 x 0,1 mm²) de uma retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina. Imagem tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (D) A região representativa (0,1 x 0,1 mm²) de uma retina manchada de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais), uma alternativa de anticorpo primário. Imagem foi tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (E) ambos os anticorpos rotular o mesmo número de segmentos de s-cone exterior porque não há nenhuma diferença significativa no número de immunopositive s-cones que estão manchadas de cabra anti-s-opsin e anti-s-opsin do coelho em qualquer um do retinal testado excentricidades (n = 2; ANOVA com teste post hoc de Bonferroni; p > 0,05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: um guia visual para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas immunostained com s-opsin. (A), A retina, inaugurado em Retistruct com o contorno visível e um "rasgo" adicionado. Pontos do "Rasgo" são indicados com setas brancas sobrepostas. Todos os cortes neste retina são arbitrários, como nenhum Marco particular foi usado para marcar a orientação da retina durante a dissecção. Botões importantes são descritas em vermelho. (B), A retina com todas as "lágrimas" adicionado e a retina dorsal identificada com "D" na periferia da retina. Observe que o botão de "Retina reconstruir" agora é visível. Botões importantes são descritas em vermelho. (C) o processo de reconstrução de uma retina. A trama do polar da retina reconstruída aparecerá à direita, mostrando que a aliviar cortes em ciano (setas azuis sobrepostos para esclarecer locais de corte). (D) o resultado final da execução uma retina através de Retistruct. A retina wholemount original permanece no lado esquerdo e reconstruída retina aparece no lado direito. Os cortes de alívio são visíveis em ciano (setas brancas sobrepostas para esclarecer locais de corte). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: A fissura de músculo e coroide reto superior pode ser usada para orientar com precisão a retina do rato. Uma trama polar dos ângulos obtidos a partir de qualquer músculo reto superior aliviando cortes ou fissura coroide cortes em retinas que foram reconstruídas com Retistruct. Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas com a localização do gradiente s-opsina. Usando o código personalizado do MATLAB para girar com precisão as retinas para que a maior concentração de s-opsin coloração é localizado ventralmente, verdadeiro dorsal (90° para reto superior), true nasal (0° para fissura coroide nasal) e temporal (180° para coroide temporal é verdade fissura) foram determinados para cada retina. O valor de cada individual aliviar o ângulo de corte foi determinado no ImageJ e um ângulo médio foi calculado para aliviar cada tipo de corte. Cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Marco profundo	Localização de queimadura da córnea	Polo de Retina identificado	Aplicação experimental
Reto superior	Dorsal	Dorsal	Ao vivo ou fixo
Fissura coroide nasal	Dorsal	Nasal	Ao vivo ou fixo
Temporal fissura coroide	Dorsal	Temporal	Ao vivo ou fixo
S-opsin gradiente	Nenhum	Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal	Fixo

Tabela 1: Marcos profundos, o polo da retina identificam-se, e se eles podem ser usados para aplicação de tecido vivo ou fixo.

Discussão

Não houve nenhum protocolo abrangente, padronizado para a determinação e a orientação da retina do rato isolado no espaço anatômico de rotulagem. O protocolo detalhada aqui tenta preencher esse vazio com a padronização e detalhando como usar pontos anatômicos profundos como referência pontos para confiantemente identificar a orientação da retina. Tem sido demonstrado que os marcos anatômicos profundos no presente protocolo fornecem um método mais preciso e confiável para orientar a retina do rato do que Marcos superficiais tais como queimaduras da córnea²². Assim, estudos que têm confiado em queimaduras da córnea para orientação da retina podem ter tido erros maiores na orientação de estudos que têm contado com marcos históricos, como os músculos retos e fissura coroide. Esta discrepância destaca a necessidade e a importância do presente protocolo padronizado com relação a interpretar os resultados e fazer comparações entre os estudos que dependem da orientação da retina precisa. Em geral, um protocolo padronizado irá fornecer um método comum para pesquisadores de visão a seguir, eliminando assim a presença de uma variável de confundimento em aquisição de dados que pode ocorrer com o uso de métodos não-padronizados para a identificação de retina orientação.

Os métodos apresentados aqui são facilmente reproduzíveis e aplicável a muitos tipos de protocolos experimentais. Na verdade, uma das maiores vantagens desse protocolo é sua adaptabilidade. Porque a fissura coroide, expressão de s-opsin e Marcos de músculo reto todos foram encontrados para identificar confiantemente orientação da retina²² o Marco que melhor se adapte os parâmetros experimentais pode ser escolhido para otimizar a aquisição de dados (tabela de 1). Além disso, métodos de dissecação podem ser combinados por forma a esclarecer a orientação da retina. Por exemplo, fissura coroide cortes podem ser combinados com s-opsin imuno-histoquímica para orientar todos os quatro polos da retina: hemisférios nasais e temporais podem ser identificados pelas cortes fissura coroide, e s-opsin imuno-histoquímica pode identificar hemisférios dorsais e ventrais. Ainda, a capacidade de adaptação do presente protocolo pode ser restringida pela natureza dos experimentos de Fisiologia com tempo-sensível. Porque o tempo que demora para identificar um ponto de referência, fazer uma queimadura da córnea e executar um alívio corte pode resultar em morte do tecido significativa em ex vivo experimentos, alguns desses métodos de dissecação podem ser menos do que ideal. Felizmente, uma vez que um Dissecador tornou-se familiarizado com a fissura coroide ou método de dissecação do músculo reto superior, identificando os marcos profundos e tornando a aliviar cortes rapidamente tornar-se parte da rotina de dissecação e não adicionar significativamente para o comprimento de dissecação. Embora reconheçamos que as etapas detalhadas aqui podem adicionar em vez de experiências extremamente sensíveis ao tempo, nós sugerimos o uso do gradiente s-opsina para orientação da retina post hoc quando a viabilidade do tecido não é mais uma questão (Figura 3 ). Coloração da retina para s-opsina é uma maneira eficaz para orientar a retina, como ele pode identificar todos os quatro polos: s-opsin manchando a retina se divide em polos dorsais e ventrais e permite a identificação da nasal e temporal polos dependendo se a retina é um direito ou esquerdo do olho (Figura 3). Portanto, acreditamos que este protocolo oferece um conjunto confiável e reproduzível de métodos para orientação da retina preciso que podem cumprir quaisquer parâmetros experimentais.

Como com qualquer modificada dissecação da retina, a validade do método dissecação é limitada pela precisão do Dissecador e a qualidade do tecido que foi isolado. Se qualquer tecido é perdido durante a dissecção ou uma retina também é desconfigurado para reconstrução precisa, Retistruct e o programa MATLAB não será capazes de forma confiável reconstruir ou orientar a retina. Portanto, é importante praticar o método de dissecação antes de usá-lo para a coleta de dados de experiências. Enquanto os tipos de dissecações explicaram aqui não são difíceis, eles devem ser praticados para garantir a repetibilidade de identificar a orientação da retina com um marco especial. Além disso, é essencial que a prática do Dissecador visualmente, identificando os pontos anatômicos antes de iniciar a coleta de dados para garantir que o Marco correto está sendo usada. Uma maneira de verificar a exatidão de um particular Dissecador é tornar qualquer fissura coroide cortes ou músculo reto superior cortes e em seguida, comparar a localização dos cortes ao gradiente s-opsina, já que é um marcador fixo e, portanto, não é dependente da exactidão dos dissectio s. potenciais dissectors também podem comparar suas retinas reconstruídos para os exemplos de retina reconstruído com Marco preciso cortes são mostrados na Figura 1 e a Figura 2. Essencialmente, um Dissecador potencial deve executar as etapas descritas neste protocolo para um tipo particular de dissecação, quer seja o músculo reto superior ou a coroide fissura método e comparar os resultados com o gradiente s-opsina para estabelecer a validade de um Dissecador particular. Porque se não tiver certo sobre a localização do landmark o Dissecador, pode resultar em uma orientação imprecisa da retina que irá, por padrão, afetam interpretação e coleta de dados.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.1 M Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	P5244
Axioplan2 Epifluorescent Microscope	Zeiss	N/A
Clear Nailpolish	N/A	N/A
Corning LSE Low Speed Orbital Shaker	Sigma-Aldrich	CLS6780FP
Costar TC-Treated 24-well Plates	Sigma-Aldrich	CLS3524
Dissection Microscope	Olympus	SZ51
Donkey anti-Goat Alexa 594	Life Technologies	A11058
Donkey anti-Rabbit Alexa 594	Life Technologies	A21207
Donkey Normal Serum	Millipore	566460	Use at 5.2% (52 μL with 86 μL of 20% Triton X-100 and 863 μL of 0.1M PBS for 1 mL of blocking solution)
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Goat anti-s-opsin	Santa Cruz Biotechnologies	sc-14363	Not commerically available as of 2017
Graefe Curved Forceps	Fine Science Tools	11052-10
ImageJ or FIJI	National Institute of Health	N/A	Freely available software
Low Temperature Cautery Ophthalmic Fine Tip Cauterizer	Bovie Medical Corporation	AA00
MATLAB	MathWorks	N/A	At least version 2007b or later
Micro Cover Glasses	VWR International	48393-241
Micro Slide Trays	VWR International	82020-913
Moira Ultra Fine Forceps	Fine Science Tools	11370-40
Nitrocellulose membrane	Millipore	HAWP04700
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Use at 4% (25 μL and 875 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of fixative)
PrecisionGlide Needle 20G (0.90 mm x 25 mm)	BD PrecisionGlide	305175
Pyrex Glass Petri Dish	Sigma-Aldrich	CLS3160152
R	The R Project for Statistical Computing	N/A	Freely available software; version 3.4.3 or later
Rabbit anti-s-opsin	Millipore	ABN1660
Retiga R3 Microscope Camera	Qimaging	01-RET-R3-R-CLR-14-C
Retistruct	N/A	N/A	Freely available software  compatiable with Windows 7 or Windows 10
Shandon Aqua-Mount Slide Mounting Media	Fisher Scientific	14-390-5
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Use 1.7% (86 μL of 20% Triton-X with 52 μL of Donkey Normal Serum and 863 μL of 0.1 M PBS for 1 mL of blocking solution)
Vannas Spring Dissection Scissors	Fine Science Tools	15000-03
5MP USB Microscope Digital Camera	AmScope	MU500	To be used with the Olympus Dissection Microscope