Usando o índice elevado de imagem para quantificar o destino noivado em células aderentes

Resumo

Medições de engajamento do alvo de drogas são centrais para droga eficaz desenvolvimento e validação de sonda química. Aqui, detalhamos um protocolo para medição engajamento de droga-alvo utilizando imagens de conteúdo de alta em uma adaptação de microplacas-compatível do ensaio celular mudança térmica (CETSA).

Resumo

Dosar a interação de moléculas pequenas com seu alvo pretendido proteína é fundamental para o desenvolvimento de drogas, validação de alvo e validação de sonda química. Métodos que medem este fenômeno sem modificação do alvo da proteína ou pequena molécula são particularmente valiosos, embora tecnicamente desafiador. O ensaio de celular mudança térmica (CETSA) é uma técnica para monitorar o engajamento do alvo em pilhas vivas. Aqui, descrevemos uma adaptação do protocolo CETSA original, que permite medições de alto rendimento, mantendo a Localização subcellular no nível da célula única. Acreditamos que este protocolo oferece importantes avanços para o aplicativo de CETSA para caracterização detalhada da interação de compostos-alvo, especialmente em populações heterogêneas de células.

Introdução

Ao desenvolver novas drogas ou sondas químicas é essencial para acoplar os efeitos farmacológicos observados ou leitura funcional para medições de ocupação de alvo ou noivado em células vivas^1,2,3. Estes dados são necessários para garantir que a pequena molécula de fato atinge seu alvo desejado e para validar a hipótese biológica atrás da proteína alvo seleção^4,5. Além disso, durante o desenvolvimento de drogas, sistemas modelo de crescente complexidade são usados para selecionar e confirmar um composto antes de ensaios clínicos de chumbo. Para confirmar a tradução de Biologia através destes sistemas pré-clínicos, métodos de rastreamento noivado droga-alvo e que acompanha a biologia em todo este processo de desenvolvimento são críticos.

Noivado de droga-alvo tem sido tradicionalmente desafiador para monitorar em células vivas com unfunctionalized pequenas moléculas e proteínas, especialmente em nível de célula única com resolução espacial de^6,7. Um método recente para observar a interação entre sem modificações drogas e proteínas nas células vivas é o ensaio de celular mudança térmica (CETSA) no qual induzida pelo ligante estabilização de uma proteína nativa em resposta a um desafio de calor é quantificada^{8, 9,10}. Isso é realizado através da quantificação da proteína solúvel restante após a exposição a um desafio de calor. Na divulgação inicial de CETSA, borrão ocidental foi usado para a deteção. Para habilitar a campanhas de rastreio e bateu na triagem das maiores coleções de compostos, os esforços para aumentar a taxa de transferência de experiências CETSA tem levado ao desenvolvimento de vários ensaios homogênea, baseada em microplacas^10,11. No entanto, uma limitação com esses métodos é que são atualmente melhor adequados ao tratamento composto em suspensões celulares e a detecção exige lise celular, levando à perda de informação espacial. CETSA pode ser aplicado experimentalmente como uma mudança induzida pelo ligante na agregação térmica da temperatura (T_agg) em uma única concentração da molécula pequena ou a concentração de ligante necessária para estabilizar a proteína em uma única temperatura. O último é denominado impressões digitais de resposta de dose isotérmico (ITDRF) para significar a dependência dessas medições em condições experimentais específicas.

O objetivo do presente protocolo é medir o engajamento do alvo usando CETSA em células aderentes por detecção do anticorpo de imunofluorescência (IF) com alto teor de microscopia¹². Este procedimento estende a plataforma CETSA original para permitir a quantificação de célula única de engajamento do alvo com a conservação de Localização subcellular. Nomeadamente, ao contrário de muitos relatórios anteriores, neste procedimento composto tratamento é realizado em células aderentes ao vivo sem desprendimento de superfície ou lavar antes o desafio de calor, preservando assim o equilíbrio de ligação estabelecida que pretendemos medir¹³. Atualmente, o método é validado por um alvo da proteína p38α (MAPK14) em várias linhas de células, e esperamos que compartilhando este procedimento a técnica pode ser aplicada amplamente em todo o derretimento proteome. Esperamos que este protocolo pode ser adaptado ao longo do canal de desenvolvimento de drogas do rastreio, bateu na triagem através de monitoramento do alvo engajamento na vivo.

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Protocolo

1. semeadura de células

Nota: Para uma visão geral do fluxo de trabalho consulte a Figura 1. Uma lista detalhada de materiais e reagentes estão disponíveis na Tabela de materiais.

1. Antes da semeadura das células, faça furos com uma broca padrão no quadro de preto 384-imagem do ensaio placas boas para evitar bolhas de ar, sendo presas sob a placa mais tarde durante a etapa de aquecimento. Para evitar plásticas partículas que entram nos poços durante esta etapa e a manutenção de condições estéreis, selar as placas com um adesivo de alumínio ou cobre a placa antes da perfuração de um capuz de cultura de tecidos. Normalmente, bastam 3 furos com um diâmetro de 3,5 mm em cada lado da placa (borda curta).
2. Prepare um banco do fluxo laminar, limpeza com etanol a 70%. Na sequência de técnicas de cultura de tecido padrão asséptico, remova a mídia do balão de célula ou prato. Lavar as células com 5-10 mL de tampão fosfato salino (PBS) e então adicionar tripsina 2 mL no balão. Incube o frasco a 37 ° C até separar as células A-431. Conte as células ou usando um contador de haemocytometer ou celular. Prepare uma suspensão de células de 50.000 células/mL em meio de cultura.
3. Dispense a 40 µ l de suspensão de células (dando uma densidade celular final de 2.000 células por poço) em cada poço de uma placa de ensaio utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal, dependendo da escala do experimento. Brevemente, mova a placa do lado-para dispersar as células uniformemente na parte inferior da placa.
4. Para minimizar os efeitos de borda de placa, permitem que as células acertar na parte inferior da placa de ensaio por 20 minutos em temperatura ambiente na parte de trás da capa de fluxo laminar. Em seguida, coloque a placa em um recipiente de plástico com toalhas de papel úmido para garantir um ambiente úmido. Antes da utilização, limpe o recipiente de plástico com etanol a 70%.
5. Incube a caixa com a placa de ensaio durante 2-3 dias a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada convencional. Monitorar a confluência das células até 50-75%, avaliada pela inspeção visual com um microscópio de luz.

2. composto de tratamento

1. No dia do experimento, Aspire o meio de cada poço usando uma máquina de lavar prato. Coloque a placa na máquina de lavar prato e selecione o programa de aspiração. Se uma máquina de lavar prato não estiver disponível, o líquido pode ser removido invertendo-se a placa com um toque de mão rápida sobre uma bandeja de resíduos ou pia. Remoção completa do líquido é essencial para o bom desempenho. Qualquer excesso de líquido é então removido esfregando com toalhas de papel.
2. Adicione 30 µ l de compostos diluído na concentração apropriada em meio de cultura celular usando a distribuição automatizada ou uma pipeta multicanal, dependendo da escala do experimento. Certifique-se para adicionar um controle positivo (conhecido ligante) e negativos (DMSO) para vários poços em cada placa de ensaio. Já que este é um ensaio de mudança térmica, é necessário que a concentração de compostos excede a constante de dissociação para observar estabilização de proteínas. Assim, uma diretriz áspera para a concentração de compostos é 50 - 100 vezes o IC₅₀, mas mais descrições de detalhe para as concentrações de compostos são encontradas na seção de discussão.
   Nota: A tolerabilidade de DMSO das linhas celulares deve ser testada antes do experimento.
3. Selo, a placa de ensaio composto-tratados com uma placa respirável selar e incubar a 37 ° C e 5% CO₂ em uma incubadora umidificada por 30 minutos.

3. calor desafio

1. Primeiro, defina o banho de água à temperatura desejada. Note-se que a temperatura final que é alcançada dentro dos poços da placa de ensaio pode ser diferente a temperatura final em banho-maria. Investiga o deslocamento de antemão com um termômetro de placa e termopar de manequim. Normalmente demora 30 minutos para o banho para estabilizar na temperatura desejada.
2. Para verificar que a temperatura desejada é atingida nos poços da placa de ensaio durante a etapa de aquecimento, prepare um prato fictício sem lacre, contendo o mesmo volume de meio como a placa de ensaio.
3. Remova as placas de ensaio da incubadora. Tire o selo respirável e re-selar a placa de ensaio que contém as células tratadas composto com uma folha de alumínio adesiva apertado para garantir que nenhuma água irá vazar nos poços durante o aquecimento subsequente em banho-maria. Certifique-se de que os furos na moldura de placa são acessíveis.
4. Coloque a placa de ensaio e a manequim placa no banho de água com o fundo do prato inclinado em direção a superfície da água para forçar todo o ar restante para fora debaixo das placas.
5. Monitore a temperatura no interior os poços de uma placa de manequim novo usando um termômetro de termopar.
6. Aquece a placa de ensaio em banho-maria durante 3 minutos. Transferi imediatamente o ensaio e a placa de manequim para outro banho de água com água de sala-moderado arrefecer por 5 minutos. A placa de ensaio está agora pronta para processamento adicional.

4. fixação

1. Dispense o paraformaldeído de 16% (p/v) 10 µ l (PFA) diretamente para a placa de ensaio utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por 20 minutos.
   Nota: Alguns fixadores são classificados como substâncias cancerígenas e regulamentos de segurança institucional devem ser seguidos.
2. Aspirar a solução PFA e lavar as células com 300 µ l PBS, usando uma máquina de lavar prato. Coloque a placa na máquina de lavar prato e selecione o programa de aspiração.
   Nota: Este procedimento foi otimizado usando um protocolo de estouro na máquina de lavar prato no qual líquido simultaneamente é dispensado e removido. Se uma máquina de lavar prato ou procedimento similar não estiver disponível, a etapa de lavagem Alternativamente pode ser feita manualmente.
3. Manual de procedimento de lavagem: Remova o líquido dos poços, invertendo-se a placa com um toque de mão rápida sobre uma bandeja de resíduos ou pia. Remoção completa do líquido é essencial para o bom desempenho. Adicione 80 µ l de PBS com uma pipeta multicanal e inverter a placa novamente conforme descrito acima, repita o procedimento de lavagem duas vezes. Após a última lavagem, borre a placa contra as toalhas de papel limpo para remover qualquer excesso de líquido.

5. permeabilização

1. Adicionar 20 µ l de 0,1% (v/v) NP-40 para os poços, com uma pipeta multicanal e incubar a temperatura ambiente por 10 minutos. Lave as células usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
2. Como alternativa, quando for o caso, aplica um protocolo de recuperação de antígeno, por exemplo:
   1. Adicione 20 µ l de SDS 1% para os poços, com uma pipeta multicanal. Incubar a temperatura ambiente por 5 minutos e lave de acordo com o mesmo procedimento descrito acima (passo 4.2).
   2. Adicione 80 μL de glicina 10mm em pH 7,2 e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Aspire a solução de glicina usando uma máquina de lavar prato colocando na máquina de lavar prato e selecionando o protocolo de aspiração. Ver notas em 2.1 e 4.2 se uma máquina de lavar prato não está disponível.

6. bloqueio

1. Adicione 15 µ l de 1% (p/v) albumina de soro bovino (BSA) em PBS nos poços utilizando um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal. Incube a placa à temperatura ambiente por 1 hora ou durante a noite a 4 ° C, com um selo de placa de alumínio de alumínio.

7. primário anticorpo

1. Aspire a solução bloqueio usando uma máquina de lavar prato colocando na máquina de lavar prato e selecionando o protocolo de aspiração. Ver notas em 2.1 e 4.2 se uma máquina de lavar prato não está disponível.
2. Adicionar 10 µ l de anticorpo primário diluído em conformidade em 1% (p/v) BSA em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a placa à temperatura ambiente por 1 hora ou durante a noite a 4 ° C, com um selo de placa de alumínio de alumínio.

8. secundário anticorpo

1. Aspirar a solução de anticorpo primário e lavar os poços de acordo com o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
2. Adicionar 10 µ l de Alexa 488 anticorpo secundário diluído em conformidade em 1% (p/v) BSA em PBS. Incube a temperatura ambiente por 1 hora. A placa do selo com um selo de alumínio de alumínio adesiva para proteger da luz.
   Nota: Protege a placa da luz durante esta e as etapas subsequentes.

9. nuclear manchando e máscara de célula

1. Adicione 10 µ l de corante nuclear diluído a 0,05 mg/mL em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por mais 10 minutos.
2. Aspirar o anticorpo secundário e Hoechst solução e lavar os poços usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
3. Adicione 10 µ l de células máscara diluída a 200 ng/mL em PBS aos poços utilizando uma pipeta multicanal. Incube a temperatura ambiente por 30 minutos.
4. Aspirar a solução de máscara de célula e lavar os poços usando o mesmo procedimento como descrito acima (passo 4.2).
5. Dispensar 60 µ l de PBS para todos os poços, usando a máquina de lavar prato, um dispensador de reagente em massa ou uma pipeta multicanal e selar as placas com um adesivo de alumínio.

10. aquisição e análise de imagem

1. Capturar imagens em uma imagem de conteúdo elevada usando 3 canais fluorescentes: DAPI (387/447), GFP (472/520) e TexasRed (562/624). Adquira 4 imagens por alvéolo com 10 X objetivo. Uso automatizado do laser autofocus e aplicar as 2 durante a aquisição. Armazenar imagens como arquivos tiff escala de 16 bits, cinza juntamente com metadados.
2. Analise imagens usando o software disponível. Identifica os limites da célula usando um algoritmo celular marcando com DAPI (núcleo) e TexasRed (citoplasma).
3. Extrato de intensidade média para todos os comprimentos de onda adquiridas para posterior análise de dados.
4. Calcule o Z-fator para garantir a robustez do ensaio.
5. Calcular a % de estabilização através da seguinte fórmula: 100 * (1-(bem intensidade-intensidade média bem controlo negativo) / (média intensidade positiva controle-média intensidade de controlo negativo)). Aqui o controle negativo é DMSO e controle positivo é a substância de referência. Desde a estabilização máxima entre compostos pode variar e na verdade ser maior que o controle positivo para curvas ITDRF, as intensidades de estabilização de máximo e mínimo para cada composto são usadas às vezes no lugar dos valores de intensidade dos poços de controle .

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Resultados

O protocolo descrito na Figura 1 descreve o fluxo de trabalho básico para a execução de ensaios CETSA em células aderentes com detecção de proteína solúvel restante pelo alta conteúda imagem. Este fluxo de trabalho pode ser facilmente adaptado a todas as fases de desenvolvimento do ensaio, modificando o layout da placa dos compostos ou reagentes¹⁴. Detalhamos os resultados esperados para vários antecipado abaixo de casos de u...

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Discussão

Conforme discutido na seção resultados, existem várias etapas-chave para o procedimento. Em primeiro lugar, é importante identificar um reagente de afinidade de alta qualidade. Recomendamos selecionando uma pequena biblioteca de anticorpos para cada destino desejado. Depois um anticorpo primário foi selecionado, é igualmente importante validar o sistema para um número de sítios de ligação diferente do alvo da proteína, se for o caso. Counter-triagem para compostos que interferem com o sinal de teste, conforme ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate-buffered saline (PBS)	Medicago	09-9400-100
TrypLE Express	ThermoFisher Scientific	12604013	for detaching cells and subculturing
16% paraformaldehyde (PFA)	ThermoFisher Scientific	28908	fixative
Goat anti-rabbit IgG (H+L), Alexa Fluor 488 conjugated antibody	ThermoFisher Scientific	A11008	secondary antibody
HCS CellMask Red stain	ThermoFisher Scientific	H32712	Cytoplasm stain
NP-40	Sigma-Aldrich	56741	for permeabilization
Hoechst stain 33342	Sigma-Aldrich	B2261	nuclear stain
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) - high Glucose	Sigma-Aldrich	6429	cell culture media component
Heat-inactivated fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F9665	cell culture media component
Penicillin-Streptomycin	Sigma-Aldrich	P4333	cell culture media component
Corning, breathable plate seal	Sigma-Aldrich	CLS3345	for copound incubation step
Rabbit anti-p38 antibody [E229]	Abcam	ab170099	primary antibody, LOT:GR305364-16
Falcon, Black 384-well clear bottom imaging plates	VWR	736-2044	imaging plates
Greiner, 384-well low volume polypropylene plates	VWR	784201
Adhesive aluminum foil	VWR	30127790
Peelable aluminium seal	Agilent	24210-001	for PlateLoc
LY2228820	Selleckchem	S1494	p38α inhibitor
PH797804	Selleckchem	PH797804	p38α inhibitor
BIRB796	Selleckchem	S1574	p38α inhibitor
SB203580	Tocris	1202	p38α inhibitor
AMG 548	Tocris	3920	p38α inhibitor
RWJ 67657	Tocris	2999	p38α inhibitor
L-Skepinone	CBCS compound collection		p38α inhibitor
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030	blocking agent
SDS (sodium dodecyl sulfate)	BDH	44244	used in antigen retrieval
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	used in antigen retrieval
A-431 cells	ATCC	ATC-CRL-1555
Echo 550	Labcyte		For preparation of compound plates
Plate sealer	Agilent		PlateLoc
Bulk reagent dispenser	Thermo Scientific	5840300	Multidrop Combi
Automated liquid handling	Agilent		Bravo liquid handling platform; used for compound plate preparation
Plate washer	Tecan		Hydrospeed
Water bath	Julabo	TW12
Thermocouple	VWR		Thermocouple traceable lab thermometer
High content imager	Molecular Devices		ImageXpress Micro XLS Widefield High-Content Analysis System