Usando avançada proteína de fluorescência verde-expressando Escherichia Coli para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de Mouse

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de rato usando reforçada fluorescência verde proteína-expressando a Escherichia coli.

Resumo

Este manuscrito descreve um método simples e reprodutível para realizar um ensaio de fagocitose. A primeira parte deste método envolve a construção de um vetor de animal de estimação-sumô-EGFP (sumô = pequeno ubiquitin-como modificador) e expressando reforçada proteínas fluorescência verde (EGFP) em Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressando a Escherichia coli é coincubated com macrófagos durante 1 h a 37 ° C; o grupo de controle negativo é incubado no gelo para a mesma quantidade de tempo. Em seguida, os macrófagos estão prontos para avaliação. As vantagens desta técnica incluem seus passos simples e direto, e fagocitose pode ser medida por ambos os microscópio de fluxo citômetro e fluorescência. O EGFP-expressando Escherichia coli são estáveis e exibir um sinal forte fluorescência mesmo depois que os macrófagos são fixos com paraformaldeído. Este método não é apenas adequado para a avaliação da linha de celular de macrófagos ou macrófagos primários em vitro mas também apropriado para a avaliação de fagocitose de granulócitos e monócitos em células mononucleares de sangue periférico. Os resultados mostram que a capacidade fagocítica de macrófagos peritoneais de ratos jovens de (oito semanas de idade) é maior que a de macrófagos de ratos envelhecidos de (16 meses). Em resumo, este método mede a fagocitose de macrófagos e é adequado para estudar a função do sistema imune inato.

Introdução

Ensaios de fagocitose de macrófagos são frequentemente utilizados para estudar a função imunitária inata. A resposta imune inata pode indicar a susceptibilidade à infecção. Linhas de células de macrófagos são amplamente utilizadas em estudos de Imunologia. No entanto, a passagem prolongada pode causar perda de gene e comprometidas as funções imunológicas nestas linhas de célula. Assim, os macrófagos peritoneais primários são o objeto ideal em que para estudar a célula função¹.

Embora a resposta imune inata, pensava-se estar intacta no corpo envelhecido, a capacidade fagocítica pode diminuir em relação ao que no mais novo corpo de^2,3. Aqui, vamos demonstrar um método para avaliar a fagocitose de macrófagos peritoneais de jovens (oito semanas de idade) e idosos (16 meses) rato usando EGFP-expressando Escherichia coli, que é conveniente, rápido e economicamente viável.

O uso de uma estirpe de EGFP-expressando a Escherichia coli é uma das vantagens deste teste porque estas bactérias são estáveis e exibir um sinal forte fluorescência, mesmo depois de macrófagos são fixados pelo paraformaldeído 4% (p/v). Além disso, usando o EGFP-expressando Escherichia coli, os pesquisadores não precisa manchar ainda mais após a fagocitose, o que economiza tempo. Além disso, os macrófagos são immunoresponsive para o antígeno de superfície de e. coli , tornando Escherichia coli mais adequada para o ensaio de fagocitose do que usando o EGFP-expressando fungos ou grânulos de fluoresceína-rotulados.

Com EGFP-expressando Escherichia coli, um ensaio de fagocitose pode ser facilmente realizado em 2h e medido por ambos fluxo cytometry e fluorescência microscopia, dependendo da finalidade do pesquisador. Desde que este método mede diretamente a capacidade fagocitária, os resultados são mais reprodutíveis do que outros métodos indirectos.

Este método também foi validado em uma linhagem de células RAW264.7 e mononucleares do sangue periférico humano células⁴. O texto abaixo fornece as instruções detalhadas passo a passo para a realização deste ensaio e destaca as etapas críticas que os pesquisadores podem modificar para atender às necessidades de seus experimentos.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados sob os institutos nacionais de saúde orientações para o cuidado e o uso de animais de laboratório, e os protocolos foram aprovados pelo Comitê de uso de Dalian médica Universidade e cuidado Animal. Dezesseis meses (com um peso de 30-35 g) e oito semanas de idade (específicos-isentos de organismos patogénicos) masculinos ratos de C57BL/6 (20-25 g) SPF foram obtidos do centro animal SPF da universidade médica de Dalian. Todos os ratos foram mantidos no alojamento dos animais com acesso a comida e água ad libitum. A temperatura foi mantida entre 20-24 ° C, umidade era de 40% - 70%, e iluminação foi 12h luz/12h escuro. Os animais foram autorizados a se adaptar ao ambiente pelo menos 7 dias antes do experimento.

1. construção do animal de estimação-sumô-EGFP plasmídeo e indução da expressão EGFP

1. Sintetizar o fragmento de gene EGFP (uma sequência de bp 717 sintetizado por um serviço de síntese do gene personalizado, consulte Tabela de materiais e complementares 1 arquivo para a sequência) e amplificar o fragmento com o avançar da primeira demão ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') e inverter a primeira demão (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), usando a alta fidelidade Taq DNA polimerase.
2. Para garantir que os produtos de reação em cadeia (PCR) polimerase tem 3 single' adenina saliências para a clonagem de TA na próxima etapa, use uma extensão de 30 min a 72 ° C, após o último ciclo (ver arquivo complementar 1 para condições PCR). Verifique o produto PCR por eletroforese em gel de agarose.
3. Clonar o produto do PCR para o vetor de animal de estimação-sumô (ver Tabela de materiais) usando o TA clonagem método⁵ com T4 DNA ligase. Incube a reação à temperatura ambiente (20-25 ° C) por 30 min. O vetor é linearizado entre nucleotídeos 653 e 654 com um 1 bp 5 ' T-saliência em cada vertente.
4. Transformar o produto de ligadura da estirpe BL21(DE) Escherichia coli quimicamente competente como segue: Adicione 5 µ l (100 ng) do produto PCR para 100 µ l de BL21(DE) células competentes através de choque térmico a 42 ° C por 90 s; manter a mistura no gelo por 3 min e em seguida, adicione 400 µ l de caldo (LB) de lisogenia médio pré-aquecido a 37 ° C, durante 1 h a 37 ° C e 120 rpm a abanar.
5. Inocule a 100 µ l das bactérias na superfície de uma placa de LB-canamicina (100 µ g/mL) com a lactose do indutor (0,5 mmol/L), rendendo a estirpe de expressão EGFP. Incube a placa a 37 ° C durante a noite.
   Nota: Se o EGFP é expresso com êxito, algumas colônias podem ser observadas como brilhante luz verde no escuro.
   1. Opcionalmente, selecione colônias para verificar se o fragmento EGFP inserido por sequenciamento de DNA. São os primers para sequenciamento de DNA: avanço, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; reversa, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.
6. Inocule uma colônia positiva em 5 mL de meio LB com 100 canamicina µ g/mL. Faça a incubação a 37 ° C, agitando a incubadora a 120 rpm por 2 h e em seguida, adicionar a lactose indutor para uma concentração final de 0.5 mmol/L e continuar a agitar durante 6 h, induzindo a expressão de EGFP. Empiricamente, quando a agitação por 6h, a densidade óptica em 600 nm (OD600) pode chegar a 0.7 ou superior.
7. Adicionar 10 µ l do meio de cultura bacteriano numa lâmina, cobrir com uma lamínula e examinar a expressão de EGFP sob um microscópio de fluorescência invertido. As bactérias EGFP-expressando podem ser armazenadas no meio de 2-8 ° c durante várias semanas.

2. mouse isolamento de macrófagos peritoneais e cultura primária

1. Adicione 3,5 g de tioglicolato para 100 mL de água destilada e autoclave a mistura à esterilidade antes do uso. Bomba de meio de tioglicolato para a seringa de 1 mL estéril de capuz para a injeção de rato peritoneal. Use um mouse por seringa para evitar a infecção. O uso de tioglicolato pode aumentar o número de macrófagos. Os macrófagos peritoneais residentes podem ser isolados sem tioglicolato, mas com menor macrófago produz.
2. Anestesia o mouse usando um método aprovado pelo Comitê de uso e cuidados de animais locais. Injecte 1 mL de meio de tioglicolato de 3,5% na cavidade peritoneal do rato com a seringa de 1 mL, usando uma agulha 23G.
   Nota: Através da indução de anestesia, a injeção peritoneal pode ser facilmente executada e reduz o risco de lesões nos órgãos internos causados por injeção.
3. Manter o mouse com água e comida ad libitum por 3 dias. Monitore a ingestão de comida e o peso do corpo do animal todos os dias. Se a perda de peso do corpo for superior a 10% dentro de 3 dias, exclua os animais do experimento.
4. Depois de 3 dias, eutanásia o mouse por deslocamento cervical após induzir rapidamente a anestesia por sevoflurano em uma caixa fechada. Como alternativa, use um método que foi aprovado pelo animal cuidados e uso comitê local para abater o mouse.
5. Coloque o mouse em um prato (com um diâmetro de 10 cm) com 75% de etanol para esterilizar e transferir imediatamente para o capuz. Coloque o mouse sobre um prato e coloque a pata dianteira à diretoria para corrigir a posição do mouse.
6. Utilizando uma seringa de 5 mL, anexada a um 20g agulha, colocando o bisel da agulha acima em um ângulo de 30° - 40°, injeta soro fisiológico 5 mL de frio (4-10 ° C) tamponada fosfato (PBS) na parte inferior do abdome cavidade peritoneal do rato, evitando perfurar o intestino. Se é perfurado o intestino (ou qualquer outro órgão), o mouse e suas células podem já não ser utilizadas para experiências, como isso pode ativar as células que não são apropriadas para cultura de células primárias.
7. Realize uma massagem suave nos dois lados do abdômen do rato. Em seguida, Aspire o líquido devagar e com cuidado. Dispense o fluido peritoneal em um tubo de centrífuga de 50 mL. Repita estes passos 2x ou 3x.
8. Centrifugar as células suspensas por 10 min a 400 x g numa centrifugadora refrigerada (4-8 ° C). Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal bovino (FBS). Conte as células. Empiricamente, a densidade celular é aproximadamente igual a 5 x 10⁶ células/mL, quando as células são resuspended em 10 mL de meio.
9. Adicione 5 x 10⁶ células em cada poço de uma placa de 6 para o ensaio de citometria de fluxo e 5 x 10⁵ células por poço em uma placa de 24 para um microscópio de fluorescência. As células a 37 ° C numa incubadora 5% CO₂ cultura durante a noite. O meio de cultura pode ser atualizado após 3h para remover células de porque a maioria destes é linfócitos. As células aderentes são principalmente os macrófagos, e eles podem aderir bem plástico tecido-cultura-tratados.

3. ensaio de fagocitose de macrófagos usando o microscópio de fluorescência

1. Observe as células sob um microscópio de campo claro para avaliar a viabilidade celular e densidade celular.
2. Remova a placa de 24, o meio de cultura. Adicione 100 µ l de meio de cultura fresco e 10 µ l da suspensão bacteriana (cerca de 2 x 10⁷ células) em cada poço, conforme descrito na tabela 1. Incube durante 1 h em um 37 ° C, 5% CO₂ incubadora.
3. Lave suavemente x-5 3x com 500 µ l de PBS frio por alvéolo para lavar as bactérias noninternalized.
4. Incube as celulas com 4% de formaldeído em PBS em temperatura ambiente por 30 min.
5. Lavar as células fixas 3 x com PBS (500 µ l/poço).
6. Adicionar 200 µ l de fluorescência faloidina 633 tingir conjugados solução de trabalho (consulte a Tabela de materiais) para manchar a F-Actina. Loja em um lugar escuro e úmido (60-80%) à temperatura de 60 min. enxaguar as células 3 x com PBS (500 µ l/poço) para remover qualquer excesso faloidina. Pela coloração da F-Actina, o citoplasma pode ser delineada e ajudar a distinguir as bactérias interiorizadas.
7. Adicione 200 µ l de solução de trabalho de DAPI (4, 6-diamidino-2-phenylindole) (1 µ g/mL) para manchar o núcleo da célula e incubar durante 5 min em um lugar escuro, úmido, à temperatura ambiente. Lave 1 x com PBS (500 µ l/poço) e 1 x com o mesmo volume de água destilada. Em seguida, as células estará prontas para observação sob um microscópio de fluorescência invertido.

4. ensaio de fagocitose de macrófagos usando citometria de fluxo

1. Para minimizar os erros experimentais e fazer uma adequada interpretação dos resultados, definir os grupos e controlar os tubos para o experimento, conforme listado na tabela 2.
   1. Para o grupo de controle, que será colocado no gelo (grupo 4 na tabela 2), remova a placa de 6 o meio e lavá-lo 1x com PBS. Em seguida, adicione 1 mL de EDTA frio 70 mM dentro do poço para separar as células e transferi-los para o tubo de citometria de fluxo. Adicionar 50 µ l de suspensão bacteriana no tubo e coloque-o no gelo por 1h.
   2. Para os outros grupos, remova o meio de cultura. Adicione 1 mL de meio fresco em cada poço. Adicione 50 µ l de suspensão bacteriana nos poços de acordo com a configuração de grupo, conforme descrito na tabela 2. Em seguida, coloque a placa de 6-poços na 37 ° C, 5% CO₂ incubadora por 1h.
2. Para saciar a fluorescência de noninternalized e. coli, adicionar 200 µ l de solução de água de cristal violeta (CV) de 0,8% para o poço e balançar em breve, evitando-se assim um resultado falso-positivo pela ligação à superfície da EGFP-expressando Escherichia coli o os macrófagos mas não internalizada. Lavar as células 3 x com PBS para remover qualquer CV residual.
3. Em seguida, adicione 1 mL de EDTA frio 70 mM dentro do poço para separar as células e transferi-los para o tubo de citometria de fluxo.
4. Centrifugar os tubos a 400 x g por 5 min e descartar o sobrenadante.
5. Adicione 100 µ l de PBS para Ressuspender as células. Adicione 5 µ l de F4/80-PE-conjugado anticorpo (um antigénio de superfície expressado em macrófagos de rato) em tubos, o isotipo do uso IgG2a-PE, de acordo com a configuração do grupo. Vórtice brevemente e incubar as amostras no gelo por 5-10 min no escuro.
6. Adicionar 1 mL de PBS em cada tubo e centrifugar 400 x g por 5 min. descartar o sobrenadante. Resuspenda as pelotas de célula com 200-300 µ l de PBS para análise de citometria de fluxo. Executar a cada tubo e adquirir dados para pelo menos 10.000 eventos de células F4/80⁺ .

Resultados

O vetor de animal de estimação-sumô utiliza um modificador ubiquitin-como pequeno para permitir a expressão de proteínas nativas na e. coli. Fusão de sumô pode melhorar consideravelmente a solubilidade EGFP, permitindo-lhe ser detectado facilmente. Se a expressão EGFP com êxito é induzida pela lactose, colônias verdes podem ser observadas no escuro (figura 1A). Pontos verdes, que representam o EGFP-expressando Escherichia coli, po...

Discussão

As etapas neste protocolo são bastante simples e direta. Um dos passos essenciais é induzir a expressão EGFP em Escherichia coli. Geralmente, quando um gene de eucariotas, como EGFP, é planejado para expressar em procariontes como e. coli, há um risco de que a proteína irá formar agregados inativos (corpos de inclusão), que altera a estrutura nativa da proteína e atividade. Usando o vetor de animal de estimação-sumô e construindo o plasmídeo de animal de estimação-sumô-EGFP, a proteína ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
BD FACSCanto II Flow cytometer	BD Biosciences	-
Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody	Biolegend	Cat101303
Champion pET SUMO Protein Expression system	Invitrogen	K300-01
Custom Gene Synthesis Service	Takara Biotech.	-
DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)	ThermoFisher	D1306
F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS	Biolegend	Cat123110
Leica DMI3000 B  Inverted Microscope	Leica Microsystems	-
PE Rat IgG2a, κ-isotype control	Biolegend	Cat400507
Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution	AAT Bioquest	Cat23125
Thioglycollate medium	Sigma-Aldrich	T9032