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Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para cultivo a microbiota do intestino do cólon in vitro, usando uma série de biorreatores que simulam as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal.

Resumo

A microbiota do intestino humano desempenha um papel vital na saúde e na doença. Estudar a microbiota do intestino utilizando um modelo in vivo , é difícil devido à sua natureza complexa e sua associação diversificada com componentes dos mamíferos. O objetivo do presente protocolo é cultura a microbiota do intestino in vitro, que permite o estudo da dinâmica de microbiota do intestino, sem ter que considerar a contribuição do meio de mamíferos. Usando em vitro tecnologia de cultivo, as condições fisiológicas do tracto gastro-intestinal são simuladas, incluindo parâmetros como pH, temperatura, anaerobiose e tempo de trânsito. A superfície intestinal do cólon é simulada adicionando transportadoras revestidas mucina, criando uma fase da mucosa, e adicionando outra dimensão. A microbiota do intestino é introduzida por inocular com o material fecal humano. Após a inoculação com esta mistura complexa de bactérias, micróbios específicos são enriquecidos na diferentes longitudinal (ascendente, transversais e descendentes de dois-pontos) e transversais (luminal e da mucosa) ambientes do modelo in vitro. É crucial permitir que o sistema alcança um estado estacionário, em que a Comunidade e os metabólitos produzidos permanecem estáveis. Os resultados experimentais neste manuscrito demonstram como a comunidade de microbiota do intestino inoculados se desenvolve em uma comunidade estável ao longo do tempo. Uma vez que o estado estacionário é alcançado, o sistema pode ser usado para analisar interações bacterianas e funções de Comunidade ou para testar os efeitos de quaisquer aditivos sobre a microbiota do intestino, tais como alimentos, componentes de alimentos ou produtos farmacêuticos.

Introdução

A microbiota do intestino é uma comunidade de microorganismos que residem no trato gastrointestinal humano (GIT).  Esta comunidade atinge a concentração máxima no cólon, que é estimado para segurar 10-13-1014 bactérias, de 500-1.000 espécies, que vivem em simbiose com o meio de cólon1,2. A composição e a funcionalidade da microbiota do intestino espacialmente mudam ao longo do GIT, formando comunidades específicas da região, com a maioria dos diversidade encontrada distalmente2,3,4,5. Para cada região anatômica, separadas das comunidades microbianas residem no lúmen e no forro mucosal6. A comunidade de lúmen tem acesso mais direto aos nutrientes como substratos se move através do compartimento luminal7. Apesar disso, algumas bactérias residam preferencialmente na camada de muco, utilizando mucina produzida pelas células do cólon como energia fonte1,5,8. A diferença entre as fases luminal e mucosas microambiente que resulta em divergência e o desenvolvimento de comunidades específicas de fase. Juntas, estas comunidades fornecem funções metabólicas, tais como o metabolismo de nutrientes e a produção de vitaminas e funções imunológicas, tais como prevenir a colonização de patógenos humanos1,3, 9. a microbiota do intestino também funciona funcionalmente em conjugação com as células de cólon humano3.

Como uma parte importante do GIT humano, não é surpreendente que a microbiota do intestino é conhecida por contribuir para ambos anfitrião saúde e doença estatuto3,9,10,11,12. Uma mudança na população microbiana do intestino tem sido associada com várias doenças humanas, incluindo transtornos do GIT como doença intestinal intestinal (IBD) e síndrome do intestino (IBS), mas também de outras doenças, como obesidade, doenças circulatórias e autismo 3 , 9 , 10 , 11 , 12. metabólitos produzidos a partir da microbiota do intestino tem um efeito global, atingindo locais longe do intestino12,13. Por exemplo, o eixo do intestino-cérebro é associado com transtornos mentais, como ansiedade e depressão14. Portanto, estudar a microbiota do intestino é importante para vários campos de pesquisa e é aplicável a muitas doenças, mesmo aqueles não frequentemente associada com o GIT.

Enquanto é amplamente reconhecido que a microbiota do intestino a estudar é importante, é uma tarefa complicada. Vários modelos animais estão disponíveis, desde pequenos animais como o peixe-zebra, ratos e camundongos, para maiores como macacos e porcos,15-19. No entanto, a aplicação destes animais em termos da microbiota do intestino humano é não simples, desde que estes animais têm uma comunidade única bacteriana que evoluiu com base no ambiente e dieta, e eles são anatomicamente distintos dos seres humanos20 , 21. o uso de cobaias humanas, remove a questão da relevância, no entanto, apresenta um outro conjunto de desafios. Estudos em humanos são caros, consomem tempo e são eticamente restrita11. Além disso, fatores de confundimento influenciam a microbiota do intestino em estudos humanos, incluindo a idade ou grau de desenvolvimento, ambiente, dieta, medicação e fatores genéticos,2,4,22.  Também há restrições sobre o que pode ser testado em seres humanos, e que tipo de amostras pode ser colhido no qual vezes4.

Uma desvantagem crítica de usar um sistema na vivo para estudar a microbiota do intestino é a presença de componentes dos mamíferos. A microbiota do intestino e células humanas interagem um com o outro, e em um no vivo definindo, é impossível distinguir os dois. Os metabólitos produzidos pela microbiota do intestino são tomados pelas células do cólon, então as medidas não podem ser calculadas com precisão. Portanto, qualquer estudo mecanicista deve ser limitado aos pontos de extremidade medições11. Outra grande desvantagem para estudos in vivo é a incapacidade para colher amostras de diferentes regiões do GIT longitudinalmente23. Isto não permite a avaliação das mudanças que podem ocorrer no microambiente do cólon ao longo do tempo12.  Muitos na vivo estudos, incluindo os humanos, dependem de análise de amostras fecais para detectar as alterações para o intestino microbiota12. Enquanto isso é informativo, ele não fornece dados sobre a microbiota do intestino através do GIT e não faz distinção entre as comunidades luminal e mucoso5,6,7,8.

A microbiota do intestino, a aplicação de um método em vitro é necessário estudar a dinâmica da comunidade bacteriana, sem interferência dos componentes dos mamíferos. Usar um método em vitro permite o controle apertado de condições ambientais10testes de vários parâmetros simultaneamente e a capacidade de amostra longitudinalmente e em grandes volumes11. Desde que um método in vitro utiliza um dispositivo mecânico e não uma série, sem considerações são necessárias para idade, ambiente, dieta ou plano de fundo genético. Estes sistemas pode ser usado para testar de qualquer comunidade de microbiota intestino inteiro, somente selecionado organismos, ou mesmo única cepas. Importante, os resultados in vitro são reproduzíveis, ainda manter um nível de diversidade comparável para estudos in vivo11,22.

Dependendo da hipótese em questão e os resultados desejados, eun vitro estudos podem ser realizados de várias formas.  Eles podem utilizar sistemas single-navio e métodos simples, como incubar as amostras fecais homogenate24 ou executar culturas único lote ao longo de 24-48 h25. Eles também podem ser realizados usando sistemas single-navio e métodos mais complexos, como o uso de um sistema de quimiostato para produzir um intestino estável comunidade microbiana11. No entanto, o uso de um único reator over simplificar a microbiota12 desde que representa apenas uma parte do cólon, mesmo que o cólon é composto por regiões ascendentes, transversais e descendentes.

Para estudar a comunidade de microbiota do intestino que se desenvolve nas diferentes regiões do cólon (ascendentes, transversais e descendentes regiões), um sistema complexo, com vários estágio pode ser empregado. Nestes sistemas, vários navios estão constituídos para imitar as diferentes regiões do cólon, então a microbiota do intestino das regiões ascendentes, transversais e descendentes são cultivados de forma independente. Estes vasos são conectados, usando bombas para mover substratos em sequência, a partir do ascendente para o transverso às regiões do cólon descendente, imitando o fluxo de nutrientes através do GIT.

O objetivo deste estudo foi demonstrar como um sistema de cultura in vitro de 5 estágios (ver Tabela de materiais) pode ser usado para cultivar a Comunidade microbiota do intestino e para demonstrar a dinâmica da Comunidade em termos de estabilidade e composição. Neste sistema, um navio representa o estômago e um representar o intestino delgado. O cólon é dividido em três regiões (ascendente, transverso, descendente), com um navio que representa cada região26. Nesta instalação experimental, dois sistemas completos foram executados em paralelo, com 1 unidade contendo portadores de mucina que representa a superfície da mucosa e unidade 2 contendo não portadores de mucina. As comunidades que se desenvolveu nas fases de luminal e da mucosa de cada região foram comparadas entre si e para o inóculo fecal ao longo do tempo usando análise de CCPA e sequenciamento de gene 16S rRNA. Os resultados apresentados demonstram o tipo de comunidade, tanto em termos de composição e funcionalidade, que pode ser produzida a partir deste tipo de sistema in vitro.

Protocolo

1. materiais e preparações

Nota: O médio definido é comprado como um pó (ver Tabela de materiais). A composição do meio definido em g/L é o seguinte: Arabinogalactan (1.2), pectina (2.0), xilana (0,5), glicose (0,4), extrato de levedura (3.0), peptona especial (1.0), mucina (2.0), L-cisteína-HCl (0,2).

  1. Prepare o suporte definido
    1. Encha um frasco de 4L com 2 L de água destilada, deionizada dupla.
    2. Adicionar 29,2 g de pó médio definido para a água e misture a unidade completa homogeneizada.
    3. Adicionar um agitador magnético e Dane-se vagamente na tampa.
    4. Autoclave a 121 ° C por 30 min.
    5. Após arrefecimento, armazene o meio definido preparado no frigorífico a 4 ° C, com agitação constante (agitador magnético).
  2. Preparar o suco pancreático
    1. Autoclave 2L de água destilada, deionizada em um recipiente de 5L com uma barra de agitador adicionado, a 121 ° C por 30 min.
    2. Após a autoclavagem, permitir que a água arrefecer à temperatura ambiente.
    3. Adicione 12,5 g NaHCO3, 6g bílis e pancreatina 0,9 g. Colocar no agitador magnético para misturar.
      Nota: O suco pancreático deve ser preparado fresca a cada 2-3 dias e refrigerado com agitação após ele fez.
  3. Tampão fosfato
    1. Coloque um frasco de 1L contendo uma barra de agitador magnético em um agitador magnético. Adicionar 0,5 L de água destilada, deionizada e ligar a agitação.
    2. Em seguida, adicione 6,8 g KH2PO4, 8,8 g K2HPO4e tioglicolato de sódio 0,1 g. Top com água até um volume final de 1 L.
    3. Depois que os componentes completamente dissolvido, ajuste o pH a 7,0 usando NaOH.
    4. Despeje o buffer em um recipiente de 2 L com tampa de rosca tampa e autoclave a 121 ° C por 30 min. Certifique-se de que a tampa é parafusada na livremente e não fechado hermeticamente.
    5. Após retirar da autoclave, deixe a solução esfriar até a temperatura ambiente. Armazene o buffer em temperatura ambiente por até 2 semanas.
  4. Preparar as transportadoras de ágar de mucina
    1. Transportadoras de plástico mucina autoclave (ver Tabela de materiais), fórceps, engranzamento plástico (forma tubular) e laços zip 131 ° c por 30 min.
    2. Autoclave 300ml de double destilada, ionizada de água a 131 ° C por 30 min. armazenar em temperatura ambiente até o uso.
    3. Em uma armário com o fluxo laminar de segurança biológica, encha os pratos de Petri estéril com as transportadoras de plástico mucina usando Pinças esterilizadas.
      Nota: Os portadores de mucina são círculos de plástico ocos que são preenchidos com ágar de mucina. Uma vez preenchido, a tampa pode ser colocada na parte superior, e estas podem ser postas de lado.
    4. Para preparar ágar de mucina, adicione 3 g de ágar bacteriana e 15 g de mucina suínos para os 300 mL de água esterilizada.
    5. Em uma coifa, ferver esta solução, retire da fonte de calor e deixe para esfriar por 1 min. repetir a ebulição e refrigeração para um total de 3 vezes.
    6. Uma vez que o recipiente de vidro contendo a solução de ágar de mucina é bastante frio ao toque, mova-o para a biossegurança do armário com fluxo laminar.
    7. Na biossegurança do armário com o fluxo laminar, despeje o ágar de mucina líquido sobre as transportadoras de plástico mucina que foram colocadas na caixa de Petri. Certifique-se de que todas as transportadoras são completamente cheias com ágar de mucina.
    8. Coloque a tampa na caixa de Petri e espere que ele esfrie sob fluxo laminar.
    9. Para montar os portadores de mucina, pegue a rede plástica esterilizada e inserir portadores de mucina contendo o ágar solidificado mucina da caixa de Petri usando Pinças esterilizadas.
    10. Use braçadeiras para fechar as extremidades da malha. Desta forma as funções de rede para conter os portadores de mucina repleto de ágar de mucina. Armazenar a 4 ° C até o uso.

2. configurar, inoculação e execução do sistema

  1. Configurar o sistema de cultivo
    Nota:     o simulador de gêmeo do ecossistema microbiano Intestinal humana foi usado para este estudo.
    1. Coloque 10 biorreatores contendo barras de agitador em Agitadores magnéticos e ligar a agitação.
      Nota: Cada unidade será composta de 5 biorreatores, então 2 unidades exigirá 10 biorreatores.
    2. 5 biorreatores Conecte uns aos outros usando tubos de silicone em sequência através da bomba peristáltica (Figura 1). Use as bombas de transversal o conteúdo líquido de um biorreator para a próxima.
    3. Rotular os biorreatores na seguinte sequência: estômago, intestino delgado, cólon ascendente, cólon transverso, descendente do cólon para representar a ordem do tracto gastrointestinal.
      Nota: Os biorreatores podem ser todos idênticos, ou biorreatores o estômago e intestino delgado podem ser menor comparados com os biorreatores de cólon desde que eles vão prender o volume menor. Configurando os biorreatores desta forma significa que a região do cólon ascendente recebe nutrientes do intestino delgado, cólon transverso região recebe nutrientes da região do cólon ascendente e região de cólon descendente recebe nutrientes do região transversal. Desta forma, o sistema está imitando o movimento sequencial de nutrientes através do trato gastrointestinal.
    4. Lugar do meio definido e suco pancreático no frigorífico a 4 ° C, com agitação constante usando Agitadores magnéticos. Usando o tubo de silicone, conectar o meio definido para o biorreator de estômago através de uma bomba peristáltica e conectar o suco pancreático para o intestino delgado através de uma bomba peristáltica.
    5. Adicione agente de solidificação de um saco de drenagem de urina. Conecte o cólon descendente para a bolsa de drenagem de urina através da bomba peristáltica. Alienar o solidificado como resíduos biológicos durante o experimento.
    6. Usando o tubo do silicone, conectar-se a camisa de água de cada navio em ordem e conecte cada extremidade para o banho de água circulante. Encher a banheira de água a circulação com água destilada (este montante irá variar dependendo do tipo de banho de água usado em circulação) e definir a 37 ° C.
    7. Com tubo de silicone, ligue o ácido e a base da tampa de cada navio por meio de bombas peristálticas. As concentrações recomendadas são 0,5 M de HCl e 0,5 M de NaOH.
    8. Inserir a sonda de pH a cada navio através do porto designado na tampa. Esta porta é projetada para manter a sonda de pH e parafuso na tampa (Figura 1). Definir o pH para cada região da seguinte forma: estômago, pH = 2; Intestino delgado, pH = 6,7-6,9; Cólon ascendente, pH = 5,6-5,9; Cólon transverso, pH = 6.15-6.4; Cólon descendente, pH = 6,6-6.9.
      Nota: Durante a fase inicial, a Comunidade irá diferenciar com base na diferença em valores de pH da região. No entanto, uma vez que os ciclos de alimentação começam, as comunidades ainda mais vencerão com base nas diferenças em entrada de nutrientes.
    9. Ligue uma linha de nitrogênio usando tubo de silicone para a tampa de cada navio usando a porta designada. A linha de nitrogênio deve fluir na seguinte sequência: estômago, intestino delgado, cólon ascendente, cólon transverso, descendente do cólon. Certifique-se de que cada unidade tem seu próprio flush para evitar a contaminação cruzada.
      Nota: O nitrogênio é usado para oxigênio removido do sistema e mantém anaerobiose durante o experimento.
    10. Inserir um tubo de metal amostra através da tampa de cada biorreator usando a porta designada. O tubo de metal se estende para baixo para o biorreator e é usado para recolher amostras de fluidos.
    11. Adicionar um pequeno pedaço de tubo de silicone para a extremidade superior do tubo de amostra e conectar um Luer Lock para permitir o uso de uma seringa durante a amostragem.
  2. Inoculação do sistema
    1. Encha as regiões do cólon com o meio definido usando os seguintes volumes: 500 mL no cólon ascendente, 800 mL no cólon transverso e o cólon descendente de 600 mL.
    2. Adicione as transportadoras de ágar de mucina para as regiões do cólon, em montante proporcional ao volume do reator. Para este experimento, foram utilizadas 60 transportadoras por reactor.
    3. Remova qualquer excesso de meio definido usando o tubo de amostra e uma seringa desde adicionar as transportadoras eleva o nível de fluido no bioreator.
    4. Ligue as pontas de prova do pH para ajustar o pH em cada reator usando o computador.
    5. Ligue o flush de nitrogênio por 20 min.
      Nota: O homogeneizado fecal utilizado para inoculação é comprado como 10% fezes homogeneizados em solução de glicerol 10% (ver Tabela de materiais). A amostra fecal é seleccionada aleatoriamente a partir de um pool de doadores com os seguintes critérios: An American consumindo uma dieta ocidental típica (não vegan ou vegetariano), entre 21-45 anos de idade, antibiótico livre pelo menos 1 ano, com um índice de massa corporal média (18,5-24,9) . Por este protocolo, é utilizado apenas um único doador. No entanto, isto pode ser alterado devido ao design experimental.
    6. Antes da inoculação, descongele o homogenate fecal, seguindo as orientações do fabricante.
    7. Inocule cada reactor de cólon adicionando o homogenate fecal um montante igual a 5% do volume do reator através da porta de amostra, utilizando uma seringa de 60 mL (25 mL para o cólon ascendente, 40 mL para o cólon transverso, 30 mL para o cólon descendente).
    8. Crescem as culturas nos biorreatores durante a noite com o controle do pH.
    9. Após o crescimento durante a noite, colha amostras do fluido luminal de cada região do cólon, conforme detalhado abaixo na seção 3. Após amostragem for concluída, ligue o programa de computador que começam a alimentar.
  3. Diário de ciclos de alimentação
    Nota:     os ciclos diários de alimentação são computador automatizado.
    1. Três vezes por dia, bomba de 140 mL do meio de definidos para o biorreator de estômago e permissão para incubar durante 1 h.
    2. Após incubação de 1 h, bomba o conteúdo do estômago para o intestino delgado. Ao mesmo tempo, bomba de 60 mL de suco pancreático no intestino delgado.
    3. No intestino delgado, ligue o ajuste do pH ao pH 6,9-6,7 e deixar a mistura incubar durante 90 minutos. Durante a incubação, ative a liberação de nitrogênio para cada sistema, para um total de 10 min cada.
    4. Após a incubação de 90 min, liga as bombas do intestino delgado para o cólon ascendente, o cólon ascendente, cólon transverso, o cólon transverso, o cólon descendente e o cólon descendente aos resíduos simultaneamente.
  4. Linha do tempo experimental
    Nota:     a in vitro sistema usado aqui é operado de forma contínua por aproximadamente 8 semanas de duração. Abaixo está um cronograma experimental recomendado, no entanto, isto pode ser modificado segundo as necessidades e o objetivo do experimento.
    1. Configure o sistema seguir as etapas listadas na etapa 2.1.
    2. Colheita de amostras de crescimento durante a noite, seguindo o protocolo abaixo. Começam os ciclos diários, alimentação três vezes ao dia, seguindo o protocolo acima.
    3. Execute o experimento para um total de 2 semanas para permitir que as bactérias para estabilizar.
      Nota: Executando o sistema significa que o pH é mantido, os ciclos diários de alimentação são seguidos três vezes por dia, e os portadores da mucosa são alterados 2 - 3 vezes cada semana.
    4. Após a estabilização, execute o experimento por 2 semanas como o período de controle.
    5. Após o período de controle, use o sistema para testar diferentes componentes ou variáveis, conhecidas como o período de tratamento.
    6. Após o período de tratamento, parar de adicionar os componentes ou variáveis e voltar às condições normais. Isto é considerado período de lavagem e é usado para determinar se ou não as alterações para a Comunidade são permanentes.

3. colheita de amostras do sistema

Nota: Durante o experimento, as amostras podem ser colhidas da fase luminal ou na mucosa de qualquer região a qualquer momento, seguindo o abaixo orientações.

  1. Colheita de amostras luminal
    1. Colheita de amostras de fluido luminal através da porta de amostra que se estende até a metade do líquido da cultura. Comece por limpar o conector Luer-Lock na porta amostra com etanol 70% ou a almofada pequena de álcool e deixe para secar.
    2. Certifique-se de que todo o ar é removido de uma seringa de 30 mL e conectá-lo à porta de amostra. Desenhar para cima e para baixo 3 - 5 vezes para garantir a mistura adequada dos componentes do navio. Depois, desenhe um total de 30 mL de cultura.
    3. Alíquota as luminal amostras como necessárias em tubos estéreis Falcão e loja no gelo. Depois que for concluída a amostragem transferi estes para um freezer-80 ° C.
    4. Para a análise do CCPA, 15 mL de amostra luminal é girado a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 minutos. O sobrenadante é filtrada usando um filtro de 0,2 μM PES com seringa. Armazenar o sobrenadante filtrado a-80 ° C.
      1. Para análise de DNA, rotação 1 mL de fluido luminal a 4 ° C, 5.000 x g durante 10 min. descartar o sobrenadante e armazenar a pelota a-80 ° C.
      2. Como um backup, armazene 10 mL de fluido luminal a-80 ° C para a maioria dos experimentos.
  2. Colheita de amostras da mucosa
    Nota:     mudar as transportadoras da mucosa cada 2-3 dias.
    1. Remover e trazer para fora os portadores de mucina preparado na geladeira.
    2. Ligue o flush de nitrogênio e abra a tampa do reator rápido. 50% dos portadores de mucina de remover e adicionar novos.
    3. Sele a tampa rapidamente e manter o nitrogênio embutida por mais 20 minutos.
    4. Para a extração de DNA, alíquota de 0.25-0.5 g de ágar-ágar em um tubo de 2 mL e armazenado a-80 ° C até ser necessário.

4. análise, sequenciamento e extração de DNA

Nota: DNA é extraído usando o método de extração de DNA CTAB com homogeneização física em uma capa de emanações29. Após a extração, um espectrofotômetro é usado para quantificar a quantidade de DNA em cada amostra.

  1. Preparar o tampão CTAB
    1. Dissolva 4,2 g K2HPO4 e 4,09 g NaCl em 200 mL de água destilada, deionizada e, em seguida, autoclave a 121 ° C por 30 min.
    2. Deixe a solução arrefecer à temperatura ambiente.
    3. Adicione 10 g de brometo de hexadeciltrimetilamónio (CTAB) e aquecer a 60 ° C, com agitação.
    4. Depois todos o CTAB é dissolvido, remova a solução de calor e frio à temperatura ambiente.
  2. Preparar a solução de PEG-6000
    1. Dissolva 300 g de polietilenoglicol 6.000 e 93,5 g NaCl em 1 L de água destilada, deionizada.
    2. Depois de todas as partículas são dissolvidos, autoclave a solução a 121 ° C por 30 min.
    3. Após a autoclavagem, arrefecer a solução à temperatura ambiente antes do uso.
  3. Realizar a extração do ADN
    1. Adicione 500 μL de tampão CTAB e 500 μL de fenol-clorofórmio-isoamílico álcool para o tubo de amostra de 2 mL e vórtice para homogeneizar.
    2. Transferi todo o conteúdo do tubo de amostra para um 0.1 milímetros física homogeneização do tubo (ver Tabela de materiais).
    3. Homogeneizar os tubos por 20 s no ajuste mais alto duas vezes, com pausa entre eles, usando um homogenizador físico 20 s (consulte a Tabela de materiais).
    4. Centrifuga os tubos homogeneizados a 3.000 x g por 5 minutos.
    5. Transferência de 300 μL do sobrenadante para um tubo limpo, de 1,7 mL e adicionar 500 μL de tampão CTAB ao tubo original.
    6. Homogeneizar o tubo novamente usando os métodos em etapas 4.3.2-4.3.3 e centrifugação a 3.000 x g por 5 min.
    7. Após a centrifugação, transferi outro 300 μL do sobrenadante no tubo novo, que agora contém 600 μL.
    8. Adicione um total de 600 álcool de clorofórmio-isoamílico μL para o tubo contendo 600 μL do sobrenadante.
    9. Inverta os tubos para misturar e centrifugar brevemente. Transferi 500 μL da fase superior para um tubo limpo 1,7 mL. Certifique-se apenas para a fase superior.
    10. Em seguida, adicionar 1000 μL de solução de Peg-6000, inverter os tubos para misturar e então incubar a temperatura ambiente por 2 h.
    11. Após a incubação, centrifuga os tubos a 18.200 x g, 4 ° C, durante 10 minutos.
    12. Desprezar o sobrenadante e limpar a pelota com gelo frio 70% de etanol.
    13. Centrifuga os tubos novamente a 18.200 x g, 4 ° C, por 10 min. descartar o sobrenadante e permitir a pelota secar no gabinete biossegurança sob fluxo laminar.
    14. Após a pelota é seca, adicione 75 µ l de RNAse livre, livre de DNAse, água estéril para cada tubo.
    15. Quantificar o DNA de ressuspensão por um espectrofotômetro e então enviá-lo para o sequenciamento de gene 16S rRNA.

5. curta cadeia de ácidos gordos (CCPA) deteção e da análise

  1. Descongelar as amostras congeladas a 40° C por 30 min e extrato de ácidos graxos de cadeia curta usando éter etílico na proporção de 2:1 (v: v).
  2. Transferir a fase orgânica para uma GC/MS (ver Tabela de materiais), equipada com uma coluna, 30 m, 0.25 mm ID, 0,25 µm, (ver Tabela de materiais) onde 10 µ l é injetado.
  3. Defina a temperatura de Porto de injeção e temperatura inicial da coluna a 260 ° C e 125 ° C respectivamente. Mantenha a temperatura inicial por 1 min e então este aumento para 250 ° C, mais 11,5 min com uma taxa de fluxo de coluna de 1 mL/min.
    Nota: A temperatura de MS para a fonte de íon é 220° C e 250° C para a interface.
  4. Quantificar a quantidade de cada CCPA usando curvas padrão e ácido 2-methylhexanoic como padrão interno.

Resultados

O protocolo acima descreve o conjunto acima, inoculação e execução de um sistema in vitro de 5 estágios para estudar o intestino microbiota do cólon. Para gerar os dados apresentados a seguir, após a extração de DNA, sequenciamento de DNA de gene 16S rRNA marcador da região V1V2 foi realizado utilizando a taxa de transferência alta sequenciamento (por exemplo,, MiSeq Illumina plataforma) pelo centro Microbiome no Hospital infantil de Philadelphia,27

Discussão

Sistemas de cultivo in vitro foram desenvolvidos para estudar a microbiota do intestino do intestino grosso. Eles usam aparelhos projetados para simular as condições fisiológicas do tracto gastro intestinal, promovendo o crescimento de uma comunidade microbiana do intestino maduro para cada região do cólon33. Enquanto o conceito é lógico e compreensível, o funcionamento real dos sistemas de cultivo in vitro para o estudo da microbiota do intestino exige precisão e uma compreensão do que ...

Divulgações

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes. Menção de nomes comerciais ou produtos comerciais nesta publicação é exclusivamente com o propósito de fornecer informações específicas e não implica em recomendação ou endosso pelo departamento E.U. da agricultura. USDA é um provedor de igualdade de oportunidades e o empregador.

Agradecimentos

Sra. Audrey Thomas-Gahring é reconhecido por seus GC/MS de trabalho. Gostaríamos também de agradecer Massimo Marzorati para editar o manuscrito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
TWINSHIMEProdigestNA
Defined medium (Adult M-SHIME growth medium with starch)ProdigestNA
Masterflex tubingcole ParmerNA
Urine Drainage bagBardNA
LabsorbSigma-AldrichNA
Fecal sampleOpenbiomeNA
SyringesBecton DicksonNA
Defined mediumProdigestNA
Oxgall BileBecton DicksonNA
PancreatinSigma-AldrichNA
Glass wareAce GlassNA
Porcine mucinSigma-AldrichNA
Bacteriological agarSigma-AldrichNA
Sterilization pouchesVWRNA
BeadBugBenchmark ScientificNA
Triple-Pure High Impact Zirconium 0.1 mm Bead beater tubeBenchmark ScientificNA
RNAse free, DNAse free, sterile waterRocheNA
Shimadzu QP2010 Ultra GC/MSShimadzuNA
Stabilwax-DA column, 30 m, 0.25 mm ID, 0.25 µmRestekNA
plastic mucin carriersProdigestNA

Referências

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