Captação de novas nanopartículas revestidos de lipídeos contendo Falcarindiol por células-tronco mesenquimais humanas

Resumo

Este artigo descreve o encapsulamento de falcarindiol em revestidos de lipídeos 74 nm nanopartículas. A absorção celular das nanopartículas por células-tronco humanas em gotículas lipídicas é monitorada por imagem fluorescente e confocal. Nanopartículas são fabricadas pelo método de injeção rápida do solvente de movimento, e seu tamanho é medido com a técnica de espalhamento de luz dinâmica.

Resumo

Nanopartículas são o foco de um crescente interesse em sistemas de distribuição de drogas para terapia do câncer. Nanopartículas revestidos de lipídeos são inspiradas na estrutura e tamanho por lipoproteínas de baixa densidade (LDLs), porque as células cancerosas têm uma maior necessidade de colesterol a proliferar, e isto tem sido explorado como um mecanismo para a entrega de drogas anticâncer para câncer células. Além disso, dependendo da química de drogas, encapsulando a droga pode ser vantajoso para evitar a degradação da droga durante a circulação em vivo. Portanto, neste estudo, este projeto é usado para fabricar nanopartículas revestidos de lipídeos, da falcarindiol de drogas anticâncer, fornecendo um sistema de entrega de novo potencial de falcarindiol a fim de estabilizar a sua estrutura química contra a degradação e melhorar a sua absorção por tumores. Nanopartículas de Falcarindiol, com um monolayer fosfolipídios e colesterol, encapsulando o núcleo de droga purificada da partícula, foram projetadas. O revestimento monocamada de lipídios é composto por 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), colesterol (Chol) e 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) juntamente com a fluorescente etiqueta DiI (molares rácios de 43:50:5:2). As nanopartículas são fabricadas usando o método de injeção rápida, que é uma técnica simples e rápida para precipitar nanopartículas por bom-solvente antitroca solvente. Consiste em uma injeção rápida de uma solução de etanol contendo os componentes de nanopartículas em uma fase aquosa. O tamanho das nanopartículas fluorescentes é medido usando Difusão dinâmica da luz (DLS) 74,1 ± 6,7 nm. A absorção das nanopartículas é testada em células-tronco mesenquimais humanas (hMSCs) e fotografada usando fluorescência e microscopia confocal. A absorção das nanopartículas é observada em hMSCs, sugerindo que o potencial para tal um sistema de entrega de droga estável para falcarindiol.

Introdução

Revestidos de lipídeos nanopartículas estão vendo um aumento do interesse em relação a sua função como sistemas de entrega de drogas para terapia de câncer¹. Cancros têm uma reprogramação lipid-metabólica alterada² e uma maior necessidade de colesterol a proliferar³. Eles overexpress LDLs¹ e tomar em LDLs mais do que as células normais, na medida em que a contagem de um paciente com câncer LDL pode até mesmo ir para baixo⁴. Captação de LDL promove agressivo fenótipos⁵ resultando em proliferação e invasão no câncer de mama⁶. Uma abundância de receptores LDL (LDLRs) é um indicador de prognóstico do potencial metastático⁷. Inspirado pelo LDL e sua absorção pelas células de câncer, uma nova estratégia foi chamada: fazer a droga parece alimentar do câncer⁸. Assim, essas nanopartículas droga entrega projetos novos^8,9,10 ter sido inspirado pelo design de núcleo e lipídios-estabilizada do natural LDLs¹¹ como um mecanismo para a entrega de drogas anticâncer para as células cancerosas. Esse passivo segmentação entrega sistema suporta o encapsulamento de, especialmente, drogas hidrofóbicas, que normalmente são dadas em forma de dosagem oral, mas fornecem somente uma pequena quantidade da droga para a corrente sanguínea, então, limitando sua eficácia prevista¹². Como com o lipossoma stealth¹³, um revestimento de polietileno glicol (PEG) ajuda a reduzir qualquer resposta imunológica e amplia a circulação na corrente sanguínea por absorção ideal do tumor, a suposta melhor permeação e retenção (EPR) efeito ^{14 , 15}. no entanto, além de, em alguns casos, a instabilidade na circulação e distribuição indesejável no sistema¹⁶, alguns obstáculos foram solucionados, tais como como e em que medida essas nanopartículas estão tomadas por células e o que é seu destino intracelular. É aqui que este livro aborda a absorção de nanopartículas de um determinado medicamento anticâncer hidrofóbico falcarindiol, usando confocal e epifluorescência técnicas de imagem.

O objetivo do estudo é fabricar nanopartículas revestidos de lipídeos, de falcarindiol e estudar sua penetração intracelular em hMSCs. Desse modo, potencialmente estabilizando sua administração, superando os desafios associados com a entrega e melhorar a biodisponibilidade. Assim, avaliar um novo sistema de entrega para esta droga anticâncer. Anteriormente, falcarindiol tem sido administrado por via oral através de uma falcarindiol de alta concentração purificada como um suplemento de alimentos¹⁷. No entanto, não há necessidade de uma abordagem mais estruturada entregar esta droga promissora. Portanto, nanopartículas de falcarindiol, com um fosfolipídios e colesterol, encapsulando monocamada com a droga purificada que constituem o núcleo da partícula, foram projetadas. O método de injeção rápida do solvente deslocando, como recentemente desenvolvido por Needham et al ⁸, é usado neste estudo para encapsular o poliacetileno falcarindiol.

O método anteriormente foi usado para a fabricação de nanopartículas de lipídios para encapsular o diagnóstico de imagens agentes^18,19, bem como teste de moléculas (Trioleína)²⁷ e drogas (orlistat, estearato niclosamide)⁸ de^{27, ,28}. É uma técnica relativamente simples, quando realizadas com as moléculas de certa. Forma nanosized de partículas, no limite de sua nucleação crítico (~ 20 nm de diâmetro), de altamente insolúveis hidrofóbicos solutos dissolvidos em um solvente polar. A troca de solvente é realizada por injeção rápida da solução orgânica em um excesso de antisolvent (geralmente, uma fase aquosa em um 1:9 orgânica: relação volume aquoso)^20,21.

O projeto composicional das nanopartículas dão origem a várias vantagens. Os componentes de DSPC:Chol fornecem uma monocamada muito apertada, quase impermeável, biocompatível e biodegradável. O PEG fornece uma interface estericamente estabilizador que age como um escudo de opsonização pelo sistema imunológico, diminuindo qualquer absorção pelo sistema reticuloendotelial (fígado e baço) e protegendo contra o sistema de fagócitos mononucleares, impedindo sua retenção e degradação pelo sistema imunológico e, portanto, aumentando sua circulação no sangue²²de meia-hora. Isso permite que as partículas a circular até que eles extravasate em doentes locais, tais como tumores, onde o sistema vascular está com vazamento, permitindo APE-efeito dar origem a acumulação passiva das partículas. Além disso, a camada lipídica permite ter um melhor controle sobre o tamanho das nanopartículas por cineticamente aprisionando o núcleo no seu núcleo fundamental dimensão^27,28. Lipídios induzem várias propriedades de superfície (incluindo peptídeo direcionamento, que ainda não estava disponível para este projeto), um núcleo de droga pura e uma baixa polidispersividade^22,,^27,28. O método utilizado para análise de tamanho de partícula é DLS, uma técnica que permite que os pesquisadores medir o tamanho de um grande número de partículas ao mesmo tempo. No entanto, esse método pode influenciar as medições para tamanhos maiores, se as nanopartículas não são monodispersas²³. Esta questão é avaliada com o casaco de lipídios também. Mais detalhes desses projetos fundamentais e a quantificação de todas as características são dadas em outras publicações^27,28.

A droga encapsulada nas nanopartículas é falcarindiol, um poliacetileno dietético encontrado em plantas da família Apiaceae. É um metabólito secundário do alifáticos C₁₇poliacetilenos tipo que foi encontrado para exibir efeitos de promoção da saúde, incluindo a actividade anti-inflamatória, efeitos anti-bacterianos e citotoxicidade contra uma ampla gama de linhas de células de câncer. Sua alta reatividade está relacionada à sua capacidade de interagir com diferentes biomoléculas, atuando como um Agente alquilante muito reativo contra mercapto e grupos amino²⁴. Falcarindiol tem sido mostrado anteriormente para reduzir o número de lesões neoplásicas no cólon^17,25, embora os mecanismos biológicos são ainda desconhecidos. No entanto, é o pensamento que ele interage com biomoléculas tais como NF-κB, COX1, COX-2, e citocinas, inibindo seus tumor progressão e célula proliferação processos, levando a prender o ciclo celular, o retículo endoplasmático (ER) stress e apoptose ^17,26 em células cancerosas. Falcarindiol é usado neste estudo como uma droga anticancerígena exemplo devido ao seu potencial anticancer e mecanismo estão sendo estudados atualmente, e porque ele mostra efeitos anticâncer promissores. A absorção celular das nanopartículas é testada em hMSCs e fotografada usando epifluorescência e microscopia confocal. Este tipo de célula foi escolhido devido a seu grande tamanho, tornando-os ideais para microscopia.

Protocolo

1. síntese de nanopartículas solvente de rápida mudança técnica

1. Configurar o seguinte para a preparação das nanopartículas: um concentrador de amostra/aquecedor do bloco, num exsicador, um sistema de distribuição digital com uma seringa de vidro de 1 mL, um frasco de vidro de 12 mL, um agitador magnético, uma pulga magnético (15 mm x 4,5 mm, em uma forma cilíndrica com revestimento de politetrafluoroetileno [PTFE]) dentro do frasco de vidro e um evaporador rotatórios.
2. Dispense a 2,4 mL de 250 µM falcarindiol estoque dissolvido na mistura de água de EtOH 70% em um frasco de cintilação.
3. Evapore a fracção líquida, usando o concentrador de amostra para cerca de 4 h, para obter o falcarindiol seco.
   1. Inserir o frasco de cintilação no aquecedor do bloco; o concentrador de amostra fornece gás da amostra, usando agulhas de aço inoxidável, concentrando-se a amostra. Evaporar à temperatura ambiente; Não use calor.
4. Uma vez seco, adicione os seguintes componentes do revestimento lipídico dentro do frasco de cintilação acima mencionados: 16,3 µ l de 31,64 mM DSPC clorofórmio solução estoque, 3,4 µ l da solução de clorofórmio 17,82 mM DSPE PEG 2000, 24 µ l de caldo de clorofórmio colesterol 25 mM solução e 6 µ l de 4mm DiI solução de clorofórmio. Limpe a seringa com clorofórmio após a adição de cada componente para evitar a contaminação cruzada.
   Atenção: Feche imediatamente os frascos contendo lipídeos, para que o solvente não evapore e, desse modo, modificar a concentração. Trabalho em uma coifa.
   Nota: As concentrações de soluções estoque de clorofórmio podem variar, dependendo do fornecedor do produto químico ou diluições feitas no laboratório.
5. Envolva o frasco com papel alumínio para proteger DiI de luz. Deixe a amostra durante a noite no exsicador evaporar o clorofórmio.
6. Dissolva a amostra dessecada em etanol absoluto, até um volume final de 1,2 mL, que dá as concentrações finais de DSPC, DSPE PEG 2000, colesterol e DiI de 0,43 mM, 0.05 mM, 0.5 mM e 0,02 mM, respectivamente. Esta solução representa a fase orgânica.
7. Leve o frasco de vidro de 12 mL, preenchê-lo com 9 mL de água purificada e adicionar a pulga magnética dentro do frasco contendo 9 mL de água. Manter o frasco no agitador magnético, agitando a 500 rpm (Figura 1).
8. Conecte a seringa de vidro de 1 mL para o sistema de distribuição e limpe-o com clorofórmio para evitar qualquer contaminação. Isto por, lentamente puxando o clorofórmio para a seringa de vidro e dispensação manualmente em um coletor de resíduos, pelo menos 10 tiems.
   Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.
9. Encha a seringa com etanol. Escorva substitui o velho solvente, bem como remove quaisquer bolhas de ar.
   Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.
10. Usando a seringa, Aspire 1 mL da fase orgânica.
11. Insira a seringa para o frasco de vidro, até o meio da marca d'água a 9 mL e mantê-lo firme no meio do frasco (como mostrado na Figura 1).
12. Injete a solução na velocidade selecionada da injeção (833 µ l/s) pressionando o botão de distribuição no sistema de distribuição (Figura 2). Isso gera 10 mL de 50 µM revestidos de lipídeos nanopartículas de falcarindiol em 10% etanol contendo água.
    Nota: Esta velocidade de injeção foi encontrada para alcançar as partículas mais finas, obtendo uma distribuição granulométrica estreita. É fundamental ter a certeza de que a seringa está no centro, estacionário e em linha reta quando a solução de distribuição.
13. Imediatamente após a injeção, retire o frasco do agitador e transferir a amostra para um balão de fundo redondo de 50 mL (RBF).
14. Anexar a RBF para o evaporador rotativo e evaporar 1 mL de solvente orgânico, usando o evaporador rotativo na temperatura de quarto. Evite a formação de bolhas em excesso.
    Nota: Este passo levará ~ 5 min.
15. Transferi a suspensão de nanopartículas da RBF para outro frasco de vidro de 12 mL. Certifique-se de que o volume é 9 mL. Dividi a amostra em dois frascos de vidro de 12 mL (colocar 4,5 mL em cada).
16. Adicione 0,5 mL de água ultrapura para um dos frascos e 0,5 mL de 10 x fosfato salino (PBS) para o outro frasco. Retire 1 mL de cada amostra para a medição de tamanho de partícula.

2. análise de tamanho de partícula utilizando a técnica DLS

Nota: Tamanho foram efectuadas medições usando um analisador de DLS que determina as distribuições de tamanho de partícula. É equipado com laser 100 mW que opera no comprimento de onda de 662.2 nm e com um detetor de fotodiodo avalanche colocado em um ângulo de 90° para o ângulo incidente. O feixe é espalhado pelas nanopartículas e detectado pelo fotodetector.

1. Ligue o instrumento DLS e regular a temperatura desejada a 20 ° C, até que se estabiliza.
2. Definir os parâmetros do instrumento da seguinte forma: tempo de aquisição de dados = 4 s, o número de aquisições = 30, função autoatenuação = On e os prazos de autoatenuação = 0.
3. Encher a cubeta plástica com 1 mL de suspensão de nanopartículas e iniciar a medição.
4. Relatar o tamanho medido dependendo do solvente utilizado (água ou PBS).
   Nota: A medição em PBS é feita para ter uma ideia aproximada do tamanho das células em meio ao tratar as células. O tratamento com células será feito com as nanopartículas dissolvidas na água.
5. Repita as medições 24 h após a síntese, para verificar a agregação de partículas.

3. célula tratamento

1. Cresce hMSCs em meio essencial mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% penicilina/estreptomicina, em uma câmara de humified a 37° C com 5% de CO₂.
   Cuidado: Trabalho no bairro fluxo Laminar estéril para etapas 3.1, 3.2 e 3.3.
2. Células de sementes aproximadamente 50.000 para obter uma densidade de célula de aproximadamente 30% em lamelas de #1.5 anteriormente absoluto-EtOH-esterilizado colocado em placas de 6-poços. Adicione MEM para poder ter um volume final de 3 mL em cada poço. Incube por 24 h sob as mesmas condições como na etapa 3.1. As células 24 h antes do tratamento de sementes.
   Nota: É fundamental que as células são semeadas pelo menos 24 h antes do tratamento de nanopartículas, para certificar-se que as células estão em uma confluência adequada.
3. Sem retirar o meio, adicionar 3 µ l da solução de nanopartículas, para uma concentração final de falcarindiol de 5 µM. Incubar por 24 h nas mesmas condições como na etapa 3.1.
   Nota: A preparação das nanopartículas foi realizada no dia do tratamento celular, para evitar a agregação das partículas.
4. Posteriormente, após 24 h de tratamento, lavar as células 2 x com PBS, corrigi-los em formol 4% durante 10 minutos à temperatura ambiente e armazená-los em PBS a 4° C por até diversos meses até fotografada.
   Atenção: Isso deve ser feito sob uma coifa.
   1. Alternativamente, após a fixação, um ′ 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) coloração nuclear pode ser executada. Por isso, após a fixação das células, permeabilize-lhes com 0,1% Triton X-100 por 30 min, lavá-los 2 x com PBS e manchá-las com 250 µ l de 300 nM DAPI por 5 minutos, protegido da luz.

4. microscopia

1. Microscopia de fluorescência
   1. Use um microscópio de fluorescência widefield equipado com uma câmera CCD elétron-multiplicado para adquirir imagens. Use o 150 x 1,45 nd objectivo de óleo e o canal de GFP LP.
2. Microscopia confocal
   1. Adquirir imagens de microscopia confocal, usando a 63 x objetivo de óleo at 1.4, um laser de argônio (514 nm) para DiI e um laser de dois fotões (780 nm) para DAPI, para verificar a absorção das nanopartículas nas células.

Resultados

Dois tipos diferentes de nanopartículas foram fabricados, ou seja pura falcarindiol nanopartículas e nanopartículas falcarindiol revestidos de lipídeos. Foram testadas diferentes concentrações de lipídios e colesterol. Conforme mostrado na tabela 1, nanopartículas não revestidas, formou-se em água e medido em PBS tinham um diâmetro de 71 ± 20,3 nm com um índice de polidispersividade (PDI) de 0.571. Esses parâmetros foram medidos em um analisador DLS. As nano...

Discussão

Um protocolo detalhado para a fabricação de nanopartículas revestidos de lipídeos, para entrega de drogas com o simples, rápido, reprodutível e escalável injeção rápida método de deslocamento do solvente foi seguido^27,28 e é apresentado neste trabalho, como aplicado a falcarindiol. Controlando a velocidade da injeção da fase orgânica em fase aquosa e usando lipídios revestimento em concentrações adequadas para revestir o núcleo falcarindiol, pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 mL Screw Neck Vial (Clear glass, 15-425 thread, 66 X 18.5 mm)	Microlab Aarhus A/S	ML 33154LP
6 well plates	Greiner Bio One International GmbH	657160
Absolute Ethanol	EMD Millipore (VWR)	EM8.18760.1000
Chloroform	Rathburn Chemicals Ltd.	RH1009
Cholesterol	Avanti Polar Lipids, Inc.	700000P
Confocal Microscope	Zeiss LSM510
Cover Slips thickness #1.5	Paul Marienfeld GmbH & Co	117650
Desiccator	Self-build
DiI	Invitrogen	D282
DLS	Beckman Coulter	DelsaMAXpro 3167-DMP
DSPC (Chloroform stock)	Avanti Polar Lipids, Inc.	850365C
DSPE PEG 2000 (Chloroform stock)	Avanti Polar Lipids, Inc.	880120C
eVol XR	SGE analytical science, Trajan Scientific Australia Pty Ltd.	2910200
Fetal Bovine serum	Gibco	10270-106
Fluorescence Miccroscope	Olymous IX81		With Manual TIRF and Andor iXon EMCCD
Incubator	Panasonic	MCO-18AC
Magnetic flea	VWR Chemicals	15 x 4.5 mm	Cylindrical shape with PTFE coating
Magnetic stirrer	IKA	RT-10
Minimum Essential Media	Gibco	32561-029
PBS tablets for cell culture	VWR Chemicals	97062-732
Pen/strep	VWR Chemicals	97063-708
Phosphate Buffer Saline (PBS, pH 7.4)	Thermo Fisher	10010031
Rotary Evaporator	Rotavapor, Büchi Labortechnik AG	R-210
Sample concentrator	Stuart, Cole-Parmer Instrument Company, LLC	SBHCONC/1