Preparo tecidual e imunocoloração de tecidos craniofaciais do camundongo e osso não-descalcificado

Resumo

Aqui, nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar e quantificar níveis da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial pela imunocoloração usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. Além, nós descrevemos um método para a preparação e o criossecção de tecidos duros secçóes dos ratos novos para a imunocoloração.

Resumo

A imunocoloração tecidual fornece detecção altamente específica e confiável de proteínas de interesse dentro de um determinado tecido. Aqui nós descrevemos um protocolo completo e simples para detectar a expressão da proteína durante a morfogênese/patogénese craniofacial usando tecidos craniofacial do rato como exemplos. O protocolo consiste na preparação e criseccionamento de tecidos, imunofluorescência indireta, aquisição de imagem e quantificação. Além, um método para a preparação e criossecção de tecidos duros secçóes para a imunocoloração é descrito, usando os tecidos craniofacial e os ossos longos como exemplos. Esses métodos são fundamentais para determinar a expressão protéica e as alterações morfológicas/anatômicas em vários tecidos durante a morfogênese/patogênese craniofacial. Eles também são aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas. O conhecimento da histologia e da alta qualidade das seções é crítico para extrair conclusões científicas dos resultados experimentais. As potenciais limitações desta metodologia incluem, mas não se limitam à especificidade dos anticorpos e dificuldades de quantificação, que também são discutidas aqui.

Introdução

O rosto é uma parte fundamental da identidade humana, e é composto de vários tipos diferentes de tecidos, tais como epitélio, músculo, osso, cartilagem, dente. Esses tecidos são derivados de todas as três camadas germinativas: ectoderma, endoderma e mesoderma^1,2. Para padronização adequada e desenvolvimento de tecidos craniofaciais, proliferação celular, morte e diferenciação precisam ser altamente coordenados e regulados por vias de sinalização específicas, tais como WNT, FGF, hh e BMP vias^{3,4 ,5}. Os defeitos na proliferação, na sobrevivência ou na diferenciação das pilhas conduzirão às malformações craniofacial, que estão entre os defeitos congénitos os mais freqüentemente de ocorrência. Camundongos transgênicos são ferramentas úteis para estudar mecanismos de morfogênese craniofacial e patogênese^1,2,3,4,5. Compreender as mudanças nas estruturas craniofacial durante o desenvolvimento e a patogénese ajudarão a esclarecer princípios de desenvolvimento chaves assim como os mecanismos de malformações craniofacial^{1,2,3 ,4,5}.

A coloração da montagem inteira ou dos tecidos seccionados com anticorpos específicos é uma técnica inestimável para determinar a distribuição espacial das proteínas de interesse ⁶. Formalmente, a imunocoloração tecidual pode depender tanto da imunohistoquímica (IHC) quanto da imunofluorescência (IF). Comparado com o produto opaco da reação gerado com um substrato cromogênico tal como 3, 3 '-Diaminobenzidine (DAB) por IHC, se envolve o uso de conjugados fluorescentes visíveis pela microscopia de fluorescência. Portanto, se pode diferenciar claramente as células positivas do ruído de fundo, e permite que as imagens sejam analisadas quantitativamente e melhoradas de forma simples por software como o ImageJ e o Adobe Photoshop^7,8. Toda a abordagem de coloração de montagem funciona em pequenos blocos de tecido (menos de 5 mm de espessura), que podem fornecer informações tridimensionais sobre a localização de proteínas/antígenos sem a necessidade de reconstrução das secções^9,10 . Entretanto, comparado com as seções do tecido, a imunomarcação inteira da montagem é demorada e exige grandes volumes de soluções do anticorpo. Nem todos os anticorpos são compatíveis com a abordagem básica de montagem inteira. Além disso, a penetração incompleta de anticorpos resultará em coloração irregular ou coloração negativa falsa. Aqui nós focaremos na deteção da imunofluorescência das proteínas/antígenos em tecidos seccionados. Para os tecidos duros (por exemplo, cabeça, dente, osso longo), o depósito do cálcio durante o desenvolvimento/patogénese faz a amostra difícil à seção e enxaguado facilmente fora durante o tratamento da imunomarcação^11,12. A maioria dos protocolos atualmente disponíveis descalcificam os tecidos duros antes da incorporação para facilitar a seccionamento, o que consome tempo e pode destruir a morfologia e os antígenos das amostras se manuseados de forma inadequada^11,12. Para superar as questões, otimizamos uma abordagem de critilização de tecidos duros sem descalcificação, levando a uma melhor visualização de sua morfologia e distribuição de proteínas de sinalização.

O protocolo aqui descrito está sendo utilizado para determinar alterações morfométricas e histológicas nos tecidos craniofaciais de camundongos transgênicos BMP. Especificamente, o protocolo inclui (1) colheita e dissecação dos tecidos da cabeça, (2) seção e imunocoloração de marcadores experimentais (pSmad1/5/9), juntamente com a coloração de TUNEL, (3) imagens das seções utilizando microscópio de fluorescência e, finalmente (4) analisando e quantificando os resultados. O protocolo para preparar e os tecidos duros do criossecção sem descalcificação é descrito igualmente¹³. Esses métodos são otimizados para os tecidos craniofaciais. Eles também são aplicáveis a outros tecidos de várias idades de amostras com modificações apropriadas.

Protocolo

Todos os experimentos de mouse foram realizados de acordo com as diretrizes da Universidade de Michigan cobrindo o cuidado humano e o uso de animais em pesquisa. Todos os procedimentos animais utilizados neste estudo foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais (IACUC) da Universidade de Michigan (protocolo #PRO00007715).

1. preparação do tecido

1. Preparação de tecidos embrionários
   1. Prepare 1 10 cm prato e vários 3,5 cm pratos contendo fosfato tampão salina (PBS), e 1 12-bem placa de cultura contendo 2 mL 4% paraformaldeído (PFA) em PBS em cada poço para cada rato grávido. Coloque todos os pratos de Petri e a placa no gelo.
      Nota: Manuseie 4% de PFA em uma capa de fumaça.
   2. Embriões dissecantes de camundongos grávidas em PBS gelado com fórceps e tesoura como descrito anteriormente¹⁴.
      1. Brevemente, eutanizar um rato grávido com CO₂, agarre a pele abaixo do centro da barriga com fórceps e corte através da pele somente, a seguir puxe delicadamente na pele para separá-la do subjacente a parede abdominal do músculo.
      2. Em seguida, corte na cavidade abdominal seguindo a mesma linha da incisão da pele. Retire o útero contendo uma corda de embriões e retire os embriões cortando suavemente a parede uterina. Os tecidos extraembrionic tais como o saco e o amnion de gema serão removidos.
      3. Corte e isole a cabeça de cada embrião.
   3. Transfira cada cabeça em cada poço de uma placa de 12 poços contendo 4% de PFA com uma pipeta ou fórceps de transferência plástica. Fixar amostras em 4% de PFA a 4 ° c durante 4 h. Enxágüe amostras em PBS a 4 ° c com agitação suave por 12 h.
      Nota: Para embriões mais jovens do que o dia embrionário 16,5 (E 16.5), fixar as cabeças do embrião com 4% de PFA diretamente após o isolamento. Para embriões na E 16.5 ou posterior, retire para descartar a pele e o tecido adiposo das cabeças e enxágüe várias vezes em PBS frio gelado antes da fixação.
   4. Cabeças de cryoprotect.
      1. Transfira cada cabeça para uma nova placa de 12 poços contendo 2 mL de sacarose a 30% em PBS usando uma pipeta ou pinça de transferência plástica. Agitar suavemente a 4 ° c até que a cabeça se afunda na parte inferior do prato.
   5. Incorporar cabeças.
      1. Transfira a cabeça criocroprotegida para um molde que contenha o composto de temperatura de corte ideal (OCT). Equilibrar amostras em OCT por vários minutos. Ajuste o local e a direção das amostras com fórceps.
      2. Coloque o molde em gelo seco para congelar. Armazene crimolantes resultantes em um saco plástico a-80 ° c até estar pronto para criseccionamento.
         Nota: O lado aparado das amostras deve enfrentar a parte inferior do molde de incorporação.
2. Preparação de tecidos duros secçóes pós-natal
   1. Eutanizar em 3 semanas ou 3 meses de rato velho com CO₂. Retire a pele e os tecidos adiposos. Corte e isole a cabeça ou ossos longos do mouse.
   2. Fixe e cryoprotect a cabeça ou o osso longo dos ratos como descrito nas etapas 1.1.3 – 1.1.4.
   3. Incorpore na gelatina de 8% em uma maneira similar como a etapa 1.1.5. Mantenha os cryomoldes em um saco plástico em-80 ° c até cryosectioning.
      Nota: Descalcificação não é necessária aqui. Para preparar 8% de gelatina, misture 8 g de gelatina com 100 mL de PBS e deixe ferver utilizando um microondas. Esteja ciente de que a mistura ferve facilmente.

2. criseccionamento

1. Ajuste a temperatura do criostat a-18 ° c para os tecidos macios encaixados em Oct ou-25 ° c e mais baixo para os tecidos duros secçóes encaixados na gelatina. Mantenha as amostras na câmara do criostato por cerca de 30 min para equilibrar a temperatura do criostat.
2. Expelir o bloco do crimolador. Congele o bloco no mandril da amostra (suporte do tecido) através da montagem com uma gota de OCT. Mantenha o lado aparado da amostra mais distante do mandril (voltado para o operador).
3. Coloque o mandril montado no bloco no suporte do objeto do criostat. Ajuste o suporte da lâmina para fazer o ângulo da lâmina 3 ° – 5 ° em relação à amostra.
4. Colete 10 μm de seções em lâminas de microscópio revestido. Seque as seções completamente em RT, em seguida, armazená-los em-80 ° c.

3. coloração histológica e imagem microscópica

1. Coloração por imunofluorescência
   1. Tirar slides de-80 ° c. Mantenha os slides em RT por 1 h para secar seções. Enxágüe slides em 0,1% PBST (0,1% polietileno glicol tert-octylfenilo éter em PBS; ver tabela de materiais) três vezes por 5 min cada para lavar Out Oct e permeabilize seções.
   2. Opcionalmente, realize a recuperação do antígeno (opcional).
      1. Tampão do citrato de pré-aquecimento (pH 6 do citrato de sódio de 10 mM) no prato de coloração com vaporizador ou banho de água a 95 – 100 ° c. Mergulhe as lâminas no tampão citrato, incubar por 10 min.
      2. Leve o prato de coloração para fora do vapor ou banho de água para RT. cool as lâminas em RT para 20 min ou mais¹⁵.
         Nota: Como alternativas, use tampão Tris-EDTA (base Tris de 10 mM, EDTA 1mM, 0, 5% Tween 20, pH 9,0) ou tampão EDTA (1 mM EDTA, 0, 5% Tween 20, pH 8,0) para recuperação de antígeno induzida por calor. Use uma panela de pressão, microondas, ou banho de água para a recuperação de antígeno induzida por calor, além do vapor quente. Uma recuperação enzima-induzida do antígeno usando o tripsina ou o pepsina são uma outra alternativa. Otimize o tempo de concentração e tratamento da recuperação enzimática para evitar cortes prejudiciais. Otimize o método de recuperação do antígeno para cada combinação de anticorpos/antígenos.
   3. Incubar cada slide com 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro de burro diluído em 0,1% PBST) em RT por 30 min, em seguida, retire a solução de bloqueio sem enxaguar.
   4. Incubar cada slide com 100 μL de anticorpo primário ou anticorpos diluídos na solução de bloqueio por 1 h em RT ou O/N a 4 ° c. Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada na RT.
   5. Incubar cada slide com 100 μL de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio por 1 h em RT. enxágüe as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada na RT. Proteja os slides da luz.
   6. Monte os slides.
      1. Adicione duas gotas de meio de anti-fade com DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) no slide. Em seguida, cubra com um lamínula.
      2. Conservar a 4 ° c no escuro até estar pronto para a imagem.
         Nota: Como uma alternativa, Rotule os núcleos com DAPI ou o corante 33324 de Hoechst diluiu 1:2000 no PBS em RT primeiramente, a seguir monta com glicerol.
2. Terminal deoxinucleotidil transferase dUTP Nick end rotulagem (tunel) coloração.
   Nota: DNA de duas cordas com 3 '-hidroxila Termini (3 ' OH DNA Termini) irá formar-se durante a apoptose na célula. Aqui, nós fornecemos um protocolo que Rotule o livre 3 ' Oh DNA Termini in situ através da rotulagem de fragmentos de DNA com o Digoxigenina-nucleotídeo utilizando terminal deoxinucleotidil transferase (TDT) por coloração específica usando um kit comercial (ver tabela de materiais ).
   1. Opcionalmente, as seções da mancha com preliminar e Alexa fluor-488 etiquetou anticorpos secundários antes da mancha de TUNEL. Enxágüe as lâminas em PBS três vezes por 10 min cada.
      Nota: Esta etapa é opcional para uma coloração dupla de uma proteína e TUNEL no mesmo slide.
   2. Incubar cada slide com 100 μL de proteinase K (10 μg/mL em 10 mM TRIS pH 7,5 e 5 mM EDTA) por 5 min em RT. enxágüe as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada na RT.
      Nota: Ajuste o tempo de incubação e a temperatura da proteinase K para cada tipo de tecido. Para secções de 10 μm de cabeças de embriões fixadas em 4% de PFA, incubar durante 5 min em RT. Além do método usando proteinase K, usar tratamentos alternativos, como necessário, incluindo (1) preparado recentemente 0,1% polietileno glicol tert-octilfenil éter, 0,1% citrato de sódio, 10 min a 37 ° c; (2) 0,25% – 0,5% de pepsina em HCl (pH 2) ou 0,25% de tripsina, 10 min a 37 ° c; e (3) irradiação de microondas com tampão citrato de 0,1 M (pH 6).
   3. Aplique 200 μL de solução de bloqueio (5% de soro de burro diluído em 0,1% PBST) para cada slide, incubar em RT por 30 min, bata a solução de bloqueio sem enxaguar.
   4. Aplique 50 μL do tampão de equilíbrio fornecido pelo kit a cada slide na RT durante, pelo menos, 10 s. toque fora do tampão sem enxaguar.
   5. Prepare a mistura da reação (enzima de força de trabalho TdT) misturando a enzima de TdT com o amortecedor da reação fornecido pelo jogo na relação de 3:7. Aplicar 50 μL da mistura de reacção a cada lâmina e incubar a 37 ° c durante 1 h. toque fora do tampão sem enxaguar.
   6. Aplique 200 μL do tampão de batente (1:30 diluído em ddH₂o) fornecido pelo jogo a cada corrediça, a seguir INCUBAR em RT por 10 minutos. Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada.
   7. Etiqueta com anticorpo de RHODAMINE.
      1. Aplique 50 μL de conjugado antidigoxigenina pré-aquecido (RT) (rodamina) (1:1 diluído em solução de bloqueio) a cada lâmina. Incubar em RT por 30 min no escuro.
      2. Enxague as lâminas com PBS três vezes por 10 min cada. Monte slides como etapa 3.1.6.

4. aquisição de imagens

1. Use controles positivos (tecidos positivos para o antígeno alvo) para verificar a rotulagem do sinal e os controles negativos (omitir o anticorpo primário, o controle isotipo ou os tecidos negativos para o antígeno alvo) para avaliar o fundo de imagens o fluorescente Microscópio.
2. Defina as condições do equipamento e da câmera (exposições e outras configurações gerais) para imagens com base na intensidade do sinal de controles negativos e positivos.
   Nota: Essas condições variam de (1) câmeras e microscópios usados para imagens, (2) anticorpos e (3) tecidos para cada experimento. As condições comuns utilizadas para os tecidos craniofaciais são ISO 200 com um tempo de exposição variando de 1/100 s a 1 s dependem da qualidade e especificidade dos anticorpos. As ampliações apropriadas variam dependendo do tamanho das amostras e da finalidade dos experimentos.
3. Adquira imagens com microscópio de epifluorescência convencional ou microscópio confocal. Adquira imagens (incluindo as dos controles correspondentes) nas mesmas condições para cada canal de cores. Salvar imagens com o mesmo formato (TIFF é melhor para preservar as informações).

5. quantificação da fluorescência

Nota: Comparar estatisticamente a coloração entre diferentes grupos será mais informativo em muitos casos. Com as imagens de imunofluorescência, quantificar o nível relativo da proteína medindo a densidade do sinal, contando células positivas, ou calculando áreas positivas. Para a análise estatística, o número mínimo de amostras biologicamente independentes é 3. Um método típico é gerar pelo menos três seções de cada amostra e tirar imagens para pelo menos três áreas representativas em cada seção.

1. Quantificação da intensidade de fluorescência usando ImageJ
   1. Abra o software e use analisar ≫ definir medições para verificar se a área e a densidade integrada estão selecionadas. Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas.
   2. Use a barra de ferramentas para selecionar o ícone quadrado ou círculo na extrema esquerda. Selecione a área a ser analisada na imagem usando a ferramenta de seleção. Use analisar > Measure para obter a leitura da área selecionada e a densidade integrada na janela resultados. Selecione uma região ao lado de uma célula positiva que não tenha fluorescência para ler o plano de fundo.
   3. Repita o passo 5.1.2 para analisar outras imagens. Ajustado a área a ser analisada para corresponder com a da primeira imagem.
   4. Copie todos os dados na janela resultados e cole em uma planilha quando terminar de analisar.
   5. Calcule a intensidade de fluorescência corrigida (CTCF) como densidade integrada — (área da célula selecionada x fluorescência média de leituras de fundo). Compare a diferença da fluorescência total corrigida da célula entre as amostras e faça um gráfico.
2. Quantificação do número de células positivas de imagens fluorescentes usando ImageJ
   1. Contagem manual de células.
      1. Use ImageJ > plugins > análise para instalar o Cell Counter plugin.
      2. Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas. Use Plugins > análise > contador de células para abrir a janela de contador e a janela de resultados.
         Nota: Contador de células não funciona em pilhas. Para contagem de pilhas, plugin Plot z axis Profile, em seguida, use Image > Stacks ≫ traçar o perfil do eixo z para monitorar a intensidade de um ROI em movimento usando uma ferramenta de rastreamento de partículas. Esta ferramenta pode ser manual ou automática.
      3. Clicando em um dos botões na parte inferior da janela do contador para iniciar a contagem. Clique diretamente em uma célula/objeto a ser contabilizar até o acabamento.
      4. Clique no botão Results na janela Count . O número total de células contados será mostrado na janela de resultados . Salve o log de resultados como planilha e analise.
   2. Contagem automatizada de células.
      1. Use o arquivo > abrir para abrir imagens a serem analisadas. Converta a imagem RGB em uma imagem de escala cinza antes de prosseguir.
      2. Use Image > ajustar > Threshold para selecionar todas as áreas que precisam ser contabilizadas.
      3. Use analisar ≫ analisar partículas para obter o número de células/partículas. Defina um intervalo do tamanho de partícula válido (por exemplo, 100-Infinity) em vez do padrão de 0-infinito para contar células/partículas dentro de um intervalo específico. Salve o log de resultados como planilha e analise.
         Nota: para obter outras informações da imagem, além da área, vá para analisar > definir medições e selecione a caixa ao lado das informações necessárias.

Resultados

Secções de tecido craniofacial embrionário
Seguindo as etapas acima, as cabeças foram dissecadas do controle (P0-CRE) ou do mutante (Bmpr1a constitutively ativado em pilhas neurais da crista, P0-CRE; caBmpr1a) embriões no dia embrionário (E) 16,5 ou 18,5. Após a fixação em 4% de PFA por 4 h, as amostras foram encaixadas em OCT e cryosectioned coronally. As seções resultantes foram imunocoradas com anticorpos contra pSmad1/5/9 (fatores de si...

Discussão

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a preparação da cabeça do rato e dos tecidos secçóes do osso, e criossecção para a imunomarcação da proliferação de pilha, da morte da pilha, e dos marcadores de sinalização do BMP. Também detalham a estratégia de obtenção de dados quantitativos de imagens imunofluorescentes. Esses métodos também podem ser aplicáveis a outros tecidos com modificações apropriadas.

As condições para a preparação dos tecidos variam consoan...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001