Avaliar a influência da personalidade na sensibilidade a campos magnéticos no Zebrafish

Resumo

Descreveremos um protocolo comportamental destinado a avaliar como personalidades do zebrafish influenciam sua resposta à água correntes e campos magnéticos fracos. Peixes com as mesmas personalidades são separados com base no seu comportamento exploratório. Em seguida, observa-se seu comportamento de orientação rheotactic em um túnel de natação com uma baixa taxa de fluxo e sob diferentes condições magnéticas.

Resumo

Para orientar-se no seu ambiente, animais integram uma grande variedade de pistas externas, que interagem com diversos fatores internos, tais como personalidade. Aqui, descrevemos um protocolo comportamental concebido para o estudo da influência da personalidade de zebrafish na sua resposta de orientação para múltiplas pistas ambientais externas, especificamente as correntes de água e campos magnéticos. Este protocolo tem como objetivo entender se pró-ativa ou reativa zebrafish exibir diferentes limiares de rheotactic (ou seja, a velocidade de fluxo em que o peixe Comece nadando contra a corrente) quando o campo magnético circundante altera sua direção. Para identificar o zebrafish com a mesma personalidade, peixes são introduzidos no escuro metade de um tanque conectado com uma abertura estreita ao meio brilhante. Só proativa peixe explorar o romance, o ambiente luminoso. Peixe reativa não sair a metade escura do tanque. Um túnel de natação com taxas de fluxo baixo é usado para determinar o limiar de rheotactic. Descrevemos duas configurações para controlar o campo magnético no túnel, na faixa de intensidade do campo magnético da terra: uma que controla o campo magnético ao longo da direção de fluxo (uma dimensão) e que permite um controle três-axial do campo magnético. Peixes são filmados enquanto experimenta um aumento gradual da velocidade do fluxo no túnel sob diferentes campos magnéticos. Dados sobre o comportamento de orientação são coletados através de um procedimento de controle de vídeo e aplicados a um modelo logístico para permitir a determinação do limiar rheotactic. Nós relatamos resultados representativos recolhidos de empolamento zebrafish. Especificamente, estes demonstram que o peixe apenas reativo, prudente mostra variações do limiar rheotactic quando o campo magnético varia em sua direção, enquanto peixes proativas não responder a alterações de campo magnético. Esta metodologia pode ser aplicada para o estudo da sensibilidade magnética e rheotactic comportamento de muitas espécies aquáticas, ambos exibindo solitária ou empolamento estratégias de natação.

Introdução

No presente estudo, descrevemos um protocolo baseado em laboratório comportamental que tem o escopo de investigar o papel da personalidade de peixe sobre a resposta de orientação do cardume de peixes para pistas de orientação externa, como correntes de água e campos magnéticos.

As orientador decisões dos animais resultam pesando várias informações sensoriais. O processo de decisão é influenciado pela capacidade do animal para navegar (por exemplo, a capacidade de selecionar e manter uma direção), seu estado interno (por exemplo, necessidades de alimentação ou reprodução), sua capacidade de movimento (por exemplo, biomecânica da locomoção) e vários adicionais fatores externos (por exemplo, hora do dia, interação com coespecíficos)¹.

O papel do estado interno ou personalidade animal no comportamento orientação é muitas vezes mal compreendido ou não explorado². Surgem desafios adicionais no estudo da orientação de espécies aquáticas sociais, que muitas vezes executam coordenada e polarizada de comportamento de movimento de grupo³.

Correntes de água desempenham um papel chave no processo de orientação de peixe. Peixe orientar-se para as correntes através de uma resposta de unconditioned chamado rheotaxis⁴, que pode ser positivo (ou seja, montante orientada) ou negativo (ou seja, a jusante de orientação) de água e é usado para várias atividades, que variam de forrageamento para a minimização de despesas energético^5,6. Além disso, um crescente corpo de literatura relata que muitas espécies de peixes usam o campo geomagnético para orientação e navegação^7,8,9.

O estudo do desempenho rheotaxis e natação no peixe geralmente é conduzido em câmaras de fluxo (calha), onde peixes são expostos ao aumento gradual da velocidade do fluxo, de baixa para alta velocidade, muitas vezes até a exaustão (chamada velocidade crítica)^{10, 11}. Por outro lado, estudos anteriores investigaram o papel do campo magnético na orientação através da observação do comportamento de natação dos animais em arenas com água parada^12,13. Aqui, descrevemos uma técnica de laboratório que permite aos pesquisadores estudar o comportamento dos peixes enquanto manipular tanto as correntes de água e o campo magnético. Este método foi utilizado pela primeira vez em cardume de peixe-zebra (Danio rerio) em nosso estudo anterior, levando à conclusão de que a manipulação do campo magnético circundante determina o limite de rheotactic (ou seja, o mínimo de água velocidade em que cardume de peixe orient montante)¹⁴. Este método baseia-se o uso de uma câmara de calha com fluxos lentos, combinados com uma configuração projetada para controlar o campo magnético no canal da, dentro da escala de intensidade do campo magnético da terra.

O túnel de natação utilizado para observar o comportamento de zebrafish é descrito na Figura 1. O túnel (feito de um cilindro de acrílico de nonreflecting com um diâmetro de 7 cm e 15 cm de comprimento) é conectado a uma configuração para o controle do fluxo taxa¹⁴. Com esta configuração, a gama de caudais no túnel varia entre 0 e 9 cm/s.

Para manipular o campo magnético no túnel de natação, usamos duas abordagens metodológicas: a primeira é unidimensional e o segundo é tridimensional. Para qualquer aplicação, esses métodos manipulam o campo geomagnético para obter condições magnéticas específicas em um volume definido de água — assim, todos os valores de intensidade de campo magnético relatados neste estudo incluem o campo geomagnético.

No que se refere a unidimensional abordagem¹⁵, o campo magnético é manipulado ao longo da direção do fluxo de água (definida como o eixo x) usando um solenoide enrolado no túnel de natação. Isto está ligado a uma unidade de energia, e ele gera o uniforme de campos magnéticos estáticos (Figura 2A). Da mesma forma, no caso a abordagem tridimensional, o campo geomagnético no volume que contém o túnel de natação é modificado usando bobinas de fios elétricos. No entanto, para controlar o campo magnético em três dimensões, as bobinas tem o desenho de três pares de Helmholtz ortogonais (Figura 2B). Cada par de Helmholtz é composto de duas bobinas circulares orientadas ao longo de três direções ortogonais do espaço (x, ye z) e equipado com um magnetômetro três-axial, trabalhando em condições de circuito fechado. O magnetômetro trabalha com intensidades de campo comparáveis com o campo da terra natural, e está localizado próximo ao centro geométrico do conjunto de bobinas (onde está localizado o túnel de natação).

Implementamos as técnicas descritas acima para testar a hipótese de que os traços de personalidade dos peixes compondo um cardume influenciam a maneira que eles respondem a campos magnéticos¹⁶. Podemos testar a hipótese de que indivíduos com personalidade proativos e reativos^17,18 respondem de forma diferente quando expostos à água flui e campos magnéticos. Para testar isso, primeiro resolvemos o zebrafish usando uma metodologia estabelecida para atribuir e os indivíduos do grupo que são proativa ou reativa^17,19,20,21. Em seguida, avaliamos o comportamento rheotactic do zebrafish nadando em cardumes, composta por apenas indivíduos reativos ou composta por apenas proativos indivíduos no tanque calha magnética, que apresentamos como dados de amostra.

O método de classificação baseia-se a tendência diferente dos indivíduos proativos e reativos para explorar novos ambientes²¹. Especificamente, nós usamos um tanque dividido em um brilhante e um lado negro^17,19,20,21 (Figura 3). Animais são aclimatados ao lado negro. Quando o acesso para o lado positivo é aberto e proativo indivíduos tendem a sair rapidamente a metade escura do tanque para explorar o novo ambiente, enquanto o peixe reativo não deixe o tanque escuro.

Protocolo

O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comitê de uso da Universidade de Nápoles Federico II, Nápoles, Itália (2015) e institucionais Cuidado Animal.

1. animal manutenção

1. Use tanques de pelo menos 200 L para hospedar um cardume de no mínimo 50 indivíduos de ambos os sexos em cada tanque.
   Nota: A densidade dos peixes no tanque tem que ser um animal por 2 L ou inferior. Sob essas condições, o zebrafish exibirá empolamento de comportamento normal.
2. Definir as condições de manutenção, como segue: temperatura 27 – 28 ° c; condutividade a < 500 μS; pH 6,5-7,5; Não há₃ no < 0,25 mg/L; e um fotoperíodo de luz: escuro a 10 h:14 h.
   Nota: Condições de exploração idêntico devem ser usadas tanto para a população mista e as populações separadas proativas e reativas.

2. personalidade seleção no Zebrafish

1. Prepare-se e coloque o reservatório de seleção de personalidade em um quarto silencioso (Figura 3) com a mesma água usada nos tanques de manutenção.
2. Coloque uma câmera de vídeo acima ou ao lado do tanque. Conectar a câmera a um computador com um monitor localizado em uma área onde não há nenhum contato visual com o tanque.
3. 9 selecione aleatoriamente de peixes do tanque de manutenção e transferi-los para o lado negro do tanque personalidade seleção, usando uma rede sem nós.
   Nota: Tente limitar as interações com os tanques e o peixe para o mínimo de tempo possível. Evite barulho e movimentos rápidos. Se necessário, transferi os animais em um pequeno volume de transporte de tanque (cerca de 2 L) com água do respectivo depósito. Para evitar a exposição de ar de animais, use um copo de 250 ml e suavemente induzir o animal a entrar o copo. Tente minimizar o tempo de captura, evitar coletar vários peixes, que podem causar danos físicos aos animais e não segurar peixe por mais de alguns segundos na net como estes fatores podem aumentar o stress. Peixes devem ser alimentados ad libitum, antes da transferência para o tanque experimental. Isso limita a possibilidade de que diferentes tendências de comportamento de busca de alimento afetaria o comportamento dos indivíduos durante o experimento seguinte²². Realizar experimentos de replicar a mesma hora do dia. Isso minimiza a variabilidade no comportamento dos grupos experimentais causadas por possíveis ritmos circadianos²³.
4. Depois de 1h de aclimatação, abra a porta de correr.
   Nota: Os indivíduos que saem do buraco, explorando o lado positivo do tanque dentro de 10 min, são considerados proativa²¹.
5. Depois de 10 min, suavemente remover os indivíduos proativos do tanque e transferi-los para o tanque de manutenção proativa.
6. Depois de 15 min, recolher os peixes que permanecem na caixa escura, que são consideradas reativas²¹e transferi-los para o tanque de manutenção reativa.
   Nota: Descarte de peixes que se movem para o lado positivo do tanque após 10min²¹. Realize o teste de personalidade com nove peixes de cada vez até que o número desejado de peixe proativos e reativos necessários para os testes descritos na seção 5 é coletado. Consistência da personalidade pró-ativa e reativa pode ser verificada regularmente, usando a mesma abordagem.

3. configurar do campo magnético com a manipulação de campo magnético One-dimensional²⁷

1. Liga a unidade de potência (Figura 2A).
2. Coloque o túnel espiral no local onde o protocolo rheotactic será realizada (secção 5), mas mantê-lo desconectado do aparelho de natação (Figura 2A). Coloque uma sonda magnética conectada com um Gauss/Teslameter dentro do túnel e verifique se a tensão que é necessário para obter o valor do campo magnético escolhido ao longo do eixo principal do túnel.
   Nota: Por causa das propriedades magnéticas de um solenoide, o campo é razoavelmente uniforme dentro do túnel; Isto pode ser verificado, movendo lentamente a sonda, tanto horizontal como verticalmente.
3. Desconecte a sonda e conectar o túnel de fluxo para o aparelho de natação.
4. Começar com o protocolo rheotactic (secção 5).

4. ajuste do campo magnético com campo magnético tridimensional manipulação²⁷

1. Liga o CPU, DAC e drivers de bobina (Figura 2B).
2. Defina o campo magnético escolhido em cada um dos três eixos (x, y e z).
3. Coloque o túnel no centro do conjunto de pares de Helmholtz.
4. Começar com o protocolo rheotactic (secção 5).

5. teste do Zebrafish Rheotaxis na câmara de fluxo

1. Transferência de peixes de um a cinco anos para o túnel de fluxo usando um tanque de 2 L, com os lados e no fundo obscurecido.
2. Ligue a bomba e definir a taxa de fluxo no túnel a 1,7 cm/s.
   Nota: Esta água lento irá manter a água no túnel oxigenado e facilitará a recuperação do animal.
3. Deixe os animais se aclimatar ao túnel de natação por 1h.
4. Inicie a gravação de vídeo do comportamento dos peixes no túnel.
   Nota: Usamos uma câmera (por exemplo, ação de Yi 4K) com controle remoto (por exemplo, Bluetooth) e salva o vídeo como. mpg (30 quadros/s).
5. Iniciar o aumento gradual da taxa de fluxo de acordo com o protocolo experimental escolhida (1,3 cm/s neste estudo; A Figura 4).
   Nota: Para este protocolo, usamos taxas de baixo fluxo, que, para o peixe-zebra, no intervalo de 0 a 2,8 BL (comprimentos corporais) / s. Estas velocidades de fluxo são na faixa de baixa das taxas de fluxo que induzem contínua natação orientada no zebrafish (3 – 15% da velocidade crítica de natação [U_crit])²⁴. O uso de taxas de baixo fluxo (protocolo²⁵) de Brett seguir está ligado às características comportamentais específico desta espécie na presença de correntes de água. Zebrafish tendem a nadar ao longo do eixo maior da câmara, girando frequentemente, mesmo na presença de água flow e tendem a nadar a montante e a jusante^24,26. Esse comportamento é afetado pela taxa de flow de água, desaparecendo a velocidades relativamente elevadas (> 8 BL/s)²⁶, quando os animais nadam continuamente virada para montante (resposta rheotactic total positiva). Deslocamentos verticais e transversais são muito raros.
6. Execute morfometria dos animais (sexo e o comprimento total [TL], comprimento do garfo [FL] ou BL) em fotos de peixe em uma câmara de morfometria.
   1. Selecione a imagem apropriada.
   2. Abra a imagem no ImageJ.
   3. Tome nota do sexo do animal (zebrafish masculino são delgado e tendem a ser amarelada, enquanto as fêmeas são mais arredondadas e tendem a ter colorações azuis e brancas).
   4. Clique em analisar > Definir escala e definir a escala da imagem em centímetros, usando o comprimento inteiro horizontal do túnel como referência.
   5. Clique em analisar > medida e registro o comprimento linear do animal.
   6. Calcule o peso do seu corpo (BW).
      Nota: BW é calculado a partir de relações de sexo-FL-BW anteriormente construídas no laboratório ou metadados. Todo o procedimento evita o estresse da manipulação dos animais.

6. vídeo monitoramento

1. Abra o arquivo de vídeo com análise de vídeo 4.84 Tracker e ferramenta de modelagem.
   Nota: Se necessário, corrigi qualquer distorção de vídeo usando a perspectiva e distorção radial inaladas.
2. Clique em sistema de coordenadas no menu superior e definir as unidades de comprimento para centímetros e as unidades de tempo de segundos.
3. Clique em arquivo > importar > vídeo e abrir um dos vídeos em 4.84 Tracker.
4. Clique em "Eixos coordenados" e definir o sistema de referência para controlar a posição do peixe ao longo do tempo, com o eixo x ao longo do túnel. Defina a origem no canto baixo da jusante terminando a parede (para a tomadade água).
5. Clique na faixa > nova > ponto de massa e iniciar o acompanhamento de um peixe de cada vez. Acompanhar o último 5 min de cada passo que o peixe passou a cada taxa de fluxo.
6. Avance o vídeo manualmente em intervalos de cinco-quadro (0,5 s) e marcar o tempo e a posição do animal em cada turno de montante-jusante (UDt; pontos vermelhos na Figura 5) e em cada turno a jusante-upstream (DUt; pontos azuis na Figura 5).
   Nota: Use a posição do olho de peixe como referência para posição dos pesqueiros. Controle a posição do animal usando uma ponto de massa. Excluir o controle de qualquer período de natação não orientado (ou seja, tempo de manobra).
7. No final de cada sessão de rastreamento, selecione os valores de x e tempo valores da tabela no canto inferior direito da janela do software. Botão direito do mouse sobre os dados e clique em copiar dados > precisão total.
8. Salvar os valores de tempo e valores de todas as posições de giro x em um arquivo de modelo de planilha para calcular o tempo de montante total (soma de todos os intervalos entre UDts e poeiras) e o tempo total de jusante (soma dos intervalos entre poeiras e UDt), bem como os valores do índice de rheotactic, em percentagem (%) de RI) para cada fluxo passo (ver Figura 5).
   Nota: O comportamento rheotactic é quantificado pela proporção do tempo total orientada para que os peixes passam virada para montante (natação ou raramente congelamento [ou seja, eles ficam ainda no fundo do túnel]²⁷). Esta proporção é definida como a % de RI (Figura 5).
   

Resultados

Como dados de exemplo, apresentamos resultados obtidos controlando o campo magnético ao longo da direção do fluxo de água em proativos e reativos empolamento zebrafish¹⁶ usando a configuração mostrada na Figura 2A (ver secção 3 do protocolo). Esses resultados mostram como o protocolo descrito pode destacar as diferenças nas respostas ao campo magnético em peixes com personalidades diferentes. O conceito global desses ensaios ...

Discussão

O protocolo descrito neste estudo permite aos cientistas quantificar respostas de orientação do complexo de espécies aquáticas, resultantes da integração entre as duas pistas externas (campo de água corrente e geomagnético) e um fator interno do animal, tais como personalidade. O conceito geral é criar um projeto experimental que permite aos cientistas separar indivíduos de personalidade diferente e investigar o comportamento de orientação enquanto controlando separadamente ou simultaneamente as pistas ambien...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
9500 G meter	FWBell	N/A	Gaussmeter, DC-10 kHz; probe resolution:  0.01 μT
AD5755-1	Analog Devices	EVAL-AD5755SDZ	Quad Channel, 16-bit, Digital to Analog Converter
ALR3003D	ELC	3760244880031	DC Double Regulated power supply
BeagleBone Black	Beagleboard.org	N/A	Single Board Computer
Coil driver	Home made	N/A	Amplifier based on commercial OP (OPA544 by TI)
Helmholtz pairs	Home made	N/A	Coils made with standard AWG-14 wire
HMC588L	Honeywell	900405 Rev E	Digital three-axis magnetometer
MO99-2506	FWBell	129966	Single axis magnetic probe
Swimming apparatus	M2M Engineering Custom Scientific Equipment	N/A	Swimming apparatus composed by peristaltic pump and SMC Flow switch flowmeter with digital feedback
TECO 278	TECO	N/A	Thermo-cryostat