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Neste Artigo

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Resumo

Fornecido aqui é um protocolo para investigar as interações entre a forma nativa, prefibrillar, e fibrilas amiloides maduras de diferentes peptídeos e proteínas com mitocôndrias isoladas de diferentes tecidos e várias áreas do cérebro.

Resumo

Um corpo de evidência crescente indica que a permeabilização da membrana, incluindo as membranas internas tais como a mitocôndria, é uma característica comum e um mecanismo preliminar da toxicidade agregado-induzida amilóide em doenças neurodegenerativas. Entretanto, a maioria de relatórios que descrevem os mecanismos do rompimento da membrana são baseados em sistemas modelo do fosfolipídeo, e os estudos que alvejam diretamente os eventos que ocorrem no nível de membranas biológicas são raros. É descrito aqui um modelo para estudar os mecanismos da toxicidade do amilóide a nível da membrana. Para a isolação mitochondrial, o meio do inclinação da densidade é usado para obter preparações com contaminação mínima do mielina. Após a confirmação da integridade da membrana mitocondrial, é investigada a interação de fibrilas amilóides decorrentes de α-synucleina, insulina bovina e lisozima branca de ovo de galinha (HEWL) com mitocôndrias cerebrais de ratos, como modelo biológico in vitro. Os resultados demonstram que o tratamento de mitocôndrias cerebrais com conjuntos fibrilares pode causar diferentes graus de permeabilização da membrana e aprimoramento do conteúdo de Eros. Isto indica interações estrutura-dependentes entre fibrilas do amilóide e membrana mitochondrial. Sugere-se que as propriedades biofísicas das fibrilas amilóides e sua ligação específica às membranas mitocondriais possam fornecer explicações para algumas dessas observações.

Introdução

Transtornos relacionados ao amiloide, conhecidos como amiloiidoses, constituem um grande grupo de doenças definidas pelo surgimento de depósitos proteicos insolúveis em diferentes tecidos e órgãos1,2. Dentre eles, as desordens neurodegenerativas são as formas mais freqüentes em que os agregados proteicos aparecem no sistema nervoso central ou periférico2. Embora vários mecanismos tenham sido propostos para estarem envolvidos na toxicidade dos agregados amilóides3, um corpo crescente de evidências aponta para o rompimento da membrana celular e a permeabilização como o mecanismo primário da patologia amilóide4, a 5. Além da membrana plasmática, as organelas internas (ou seja, mitocôndrias) também podem ser afetadas.

Curiosamente, evidências emergentes sugerem que a disfunção mitocondrial desempenha um papel crítico na patogênese de distúrbios neurodegenerativos, incluindo a doença de Alzheimer e de Parkinson6,7. De acordo com essa questão, inúmeros relatos indicaram ligação e acúmulo de proteínas de peptídeo amilóide, α-sinucleina, huntingtina e SOD1 com as mitocôndrias8,9,10, 11. pensa-se que o mecanismo de permeabilização da membrana por agregados amiloides ocorra através da formação de canais discretos (poros) e/ou através de um mecanismo de detergente não específico5,12, trezeanos. Destaca-se que a maioria dessas conclusões tem sido baseada em relatos envolvendo sistemas de modelo fosfolipídeo, e estudos direcionados diretamente aos eventos que ocorrem nas membranas biológicas são raros. Claramente, esses bicamadas lipídico artificial não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, incluindo as das mitocôndrias, que são estruturas heterogêneas e compostas por uma grande variedade de fosfolipídios e proteínas.

No presente estudo, as mitocôndrias isoladas de cérebros de ratos são utilizadas como um modelo biológico in vitro para examinar os efeitos destrutivos das fibrilas amilóides decorrentes da α-sinucleina (como uma proteína amiloidogênica), a insulina bovina (como um peptídeo modelo mostrando homologia estrutural significativo com o insulin humano envolvido no amyloidosis injeção-localizado), e o lisozima branco do ovo de galinha (Hewl; como uma proteína modelo comum para o estudo da agregação do amilóide). As interações e possíveis danos das membranas mitocondriais induzidas por fibrilas amilóides são então investigadas observando-se a liberação de malato mitocondrial desidrogenase (MDH) (localizada na matriz mitocondrial) e de oxigênio reativo das mitocôndrias melhoramento de espécies (ROS).

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Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) de ciências médicas da Universidade de Teerão. Esforços máximos foram feitos para minimizar o sofrimento e os efeitos prejudiciais para os ratos, afiando as lâminas de guilhotina e aplicando movimentos resolutos e rápidos da lâmina.

1. homogeneização cerebral e isolamento mitocondrial

Nota: todos os reagentes para isolamento mitocondrial foram preparados de acordo com Sims e Anderson14.

  1. Preparação de buffers para isolamento mitocondrial
    1. Prepare uma solução de Tris-HCl 100 mM: pesar 0,605 g de Tris-HCl e dissolvê-lo em aproximadamente 40 mL de água deionizada (DW) em uma taça. Transfira a solução para um balão volumétrico de 50 mL e aumente o volume final para 50 mL adicionando DW.
    2. Prepare uma solução de EDTA de 10 mM: pesar 0,202 g de EDTA e dissolvê-lo em aproximadamente 40 mL de DW em um copo. Transfira a solução para um balão volumétrico de 50 mL e aumente o volume final para 50 mL adicionando DW.
      Nota: ambas as soluções podem ser armazenadas a 4 ° c durante pelo menos 4 semanas.
    3. Prepare uma solução de estoque de Tris-HCl/EDTA/sacarose: Adicione 30 mL de Tris-HCl de 100 mM e 30 mL de EDTA de 10 mM em um copo. Pesar 32,86 g de sacarose e adicioná-lo ao copo enquanto mexendo com um agitador magnético. Quando a sacarose é dissolvida, transfira a solução para um balão volumétrico de 100 mL e aumente o volume final para 100 mL adicionando DW.
      Nota: esta solução pode ser armazenar a 4 ° c por até 3 dias.
    4. Prepare um tampão de isolamento (IB): Adicionar 100 mL de Tris-HCl/EDTA/sacarose para cerca de 150 mL de DW. Ajuste o pH a 7,4 adicionando 0,1 M HCl. Aumente o volume final para 300 mL adicionando DW.
    5. Prepare o meio de gradiente de densidade de 15% (v/v) com IB adicionando 1,5 mL de meio de gradiente de densidade a 8,5 mL de IB frio.
    6. Prepare 10 mg/mL de solução de albumina sérica bovina (BSA): pesar 20 mg de BSA sem ácidos graxos e dissolvê-lo em aproximadamente 1,5 mL DW em um frasco de 2 mL. Aumente o volume final para 2 mL, adicionando DW e armazená-lo no gelo até o uso.
      Nota: Prepare recentemente as soluções das etapas 1.1.4 – 1.1.6 no dia do isolamento mitocondrial e armazene-as no gelo até o uso.
  2. Isolação do cérebro do rato
    Nota: a decapitação e a remoção cerebral de ratos machos (150 – 200 g) foram realizadas de acordo com Sims e Anderson14.
    1. Coloque um copo de 30 mL em um balde de gelo e adicione 10 mL de IB frio ao béquer.
    2. Decapitar o rato com uma pequena guilhotina animal e remover o cérebro do crânio dentro de 1 min de decapitação para limitar a deterioração das propriedades mitocondrial.
    3. Transfira rapidamente o cérebro para o béquer contendo IB frio.
  3. Homogeneização cerebral e preparação de mitocôndrias
    Nota: as frações mitocondriais foram isoladas de acordo com o protocolo descrito por Sims e Anderson14, com algumas modificações descritas anteriormente15. É importante trabalhar rapidamente e manter tudo no gelo durante todo o procedimento.
    1. Lave o tecido 2x com 30 mL de IB, transfira para um béquer contendo IB frio, e finamente picar o cérebro com uma tesoura.
    2. Adicione 10 volumes de IB pré-resfriado (cerca de 10 mL de IB por cérebro de rato).
    3. Transfira a suspensão do tecido para um homogeneizador de 20 mL de dounce frio.
    4. Homogeneize as partes do tecido usando nove cursos up-and-down com um pilão motorizado.
      Nota: Deixe a mistura no gelo por aproximadamente 30 s após cada conjunto de três traçados de homogeneização para garantir que o homogeneizar permaneça frio.
    5. Transfira o homogeneate para um tubo de centrifugação pré-refrigerado de 10 mL e centrifugue a 1, 300X g e 4 ° c durante 3 min.
    6. Decantar cuidadosamente o sobrenadante e transferi-lo para um tubo de centrifugação pré-refrigerado de 10 mL e centrifugar a 21, 000x g a 4 ° c durante 10 min.
    7. Descarte o sobrenadante e ressuscita a pelota em uma solução média de gradiente de densidade de 15% fria (5 mL para cada cérebro) mexendo suavemente a mistura com uma pipeta.
    8. Centrifugador em um rotor do fixo-ângulo em 30, 700x g em 4 ° c por 5 minutos usando a aceleração lenta (45 s de 0 rpm a 500 RPM seguidos pela aceleração normal) e pela desaceleração (nenhuns freios). Isso deve produzir duas bandas distintas de material (Figura 1a, esquerda).
    9. Usando uma pipeta de Pasteur, remova a faixa afiada do material acumulada na parte superior do inclinação, que contem na maior parte o myelin. Em seguida, remova a solução média de gradiente de densidade sobrejacente o material (na banda 2), tanto quanto possível, sem perder nenhuma fração mitocondrial enriquecida na banda 2.
      Nota: a banda 2 contém as mitocôndrias sinápticas e não sinápticas.
    10. Adicione 8 mL de IB à fração mitocondrial enquanto mexendo suavemente a mistura com uma pipeta.
    11. Centrifugador em 16, 700x g em 4 ° c por 10 minutos e remova com cuidado o sobrenadante, deixando a pelota frouxa inferior unperturbado.
    12. Adicionar 1 mL de 10 mg/mL de ácido graxo BSA livre para o tubo de centrifugação, enquanto mexendo suavemente a mistura com a ponta de uma pipeta. Aumente o volume final para 5 mL por cérebro, adicionando IB.
    13. Centrifugador em 6, 900x g em 4 ° c por 10 minutos, que deve produzir uma pelota firme (Figura 1a, direita).
    14. Decantar o sobrenadante e resuspender suavemente a pelota mitocondrial em IB, alíquota-los em 0,5 tubos de ml, e armazenar em nitrogênio líquido até o uso.

2. determinação da concentração proteica

Nota: a concentração proteica é medida utilizando-se o método de Lowry et al.16.

  1. Preparação de soluções para o ensaio Lowry
    1. Prepare a solução a: pesar 0,4 g de NaOH e 2 g de na2co3 e dissolva-se em 80 ml de DW, em seguida, transfira a solução para um balão volumétrico de 100 ml e aumente o volume para 100 ml adicionando DW.
    2. Prepare a solução B: pesar 0,1 g de tartarato de sódio de potássio e 0, 5 g de CuSO4 e dissolver em 8 ml de DW, em seguida, transferir a solução para um balão volumétrico de 10 ml e aumentar o volume para 10 ml adicionando DW.
      Nota: ambas as soluções A e B podem permanecer estáveis a 4 ° c por até 6 meses.
    3. Preparar a solução C: Adicionar 0,5 mL de solução de folina a 7,5 mL de DW.
      Nota: Prepare a solução C fresca e mantenha-a afastada da luz até ao uso.
    4. Prepare os padrões de BSA com concentrações finais de 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 μg/mL combinando 0, 20, 40, 60, 80, 100 e 120 μL de 1 mg/mL de BSA, respectivamente, com DW suficiente para fazer 1000 μL de solução.
  2. Medição da concentração proteica
    Nota: para maior precisão, execute esta etapa em Triplicate.
    1. Adicionar 50 μL de soluções padrão e homogeneato mitocondrial a cada poço de uma placa de poço 96, seguida da adição de 45 μL de solução A. Em seguida, incubar a placa por 10 min em um banho de água morna fixado em 50 ° c.
    2. Adicionar 5 μL de solução B e incubar a placa durante 10 min no escuro à temperatura ambiente (RT).
    3. Adicionar 150 μL de solução C e incubar a placa durante 10 min num banho de água quente a 50 ° c.
    4. Coloque a placa em um leitor de placas e registre os valores de absorvância para padrões e suspensão mitocondrial em 650 nm. Em seguida, usando uma curva de calibração, calcule o teor de proteínas da mitocôndria.

3. determinação da integridade da membrana mitocondrial

Nota: a integridade da membrana mitocondrial é confirmada pela medição da atividade da malato desidrogenase (MDH) nas mitocôndrias isoladas antes e após o rompimento da membrana por Triton X-100.

  1. Diluir o homogeneato mitocondrial para 1 mg/mL com IB frio e colocado em dois tubos de 1,5 mL (tipicamente 195 μL de mitocôndrias por tubo).
  2. Adicionar 5 μL de 20% (v/v) Triton X-100 (diluído com DW) a um tubo (como um controlo positivo para a atividade enzimática máxima) e 5 μL de DW para outro tubo (para controlo) seguido de mistura com um agitador.
  3. Incubar os tubos por 10 min em um banho de água morna fixado em 30 ° c.
  4. Mitocôndria da pelota pela centrifugação dos tubos em um rotor do fixo-ângulo em 16.000 x g e em 4 ° c por 15 minutos.
  5. Colete cuidadosamente os sobrenadantes resultantes para ensaio a atividade de MDH mitocondrial usando um ensaio espectrofotométrico padrão descrito na seção a seguir.
  6. Calcule a integridade da membrana mitocondrial da seguinte forma:
    figure-protocol-9202

4. determinação da atividade de MDH

Nota: a atividade da MDH foi mensurada espectrofotometricamente, conforme descrito por Sottocasa et al.17.

  1. Preparação de soluções para o ensaio de atividade MDH
    1. Prepare uma solução de Tris-HCl 50 mM (pH = 7,5): Prepare uma solução de 7,9 mg/mL em DW usando Tris-HCl, e ajuste o pH para 7,5 a 25 ° c com 1,0 M NaOH.
    2. Prepare uma solução de oxaloacetato de 50 mM: Prepare uma solução de 6,6 mg/mL utilizando oxaloacetato em Tris-HCl.
      Nota: esta solução não é estável uma vez na solução e deve ser preparada imediatamente antes do uso.
    3. Prepare uma solução de β-NADH de 10 mM: Prepare uma solução de 7,81 mg/mL utilizando β-NADH em Tris-HCl.
  2. Determinação da atividade de MDH
    Nota: as concentrações finais de ensaio numa mistura de reacção de 1,0 mL são de 50 mM de Tris-HCl, oxaloacetato de 5 mM e 0,1 mM de β-NADH.
    1. Ajuste o espectrofotômetro a 25 ° c e a 340 nm. Pipetar 890 μL de tampão Tris-HCl, 100 μL de solução de oxaloacetato e 10 μL de solução de NADH para uma cubeta em branco e 880 μL de tampão Tris-HCl, 100 μL de solução de oxaloacetato e 10 μL de solução de NADH para uma amostra de uma cubeta.
    2. Incubar as Cutelas no espectrofotômetro por 3 – 4 min e referência em branco.
    3. Em seguida, adicione 10 μL de homogeneizar mitocondrial (1 mg/mL) à cubeta da amostra, misture imediatamente por inversão e grave diminuições na absorvência devido à oxidação de NADH a 340 nm durante 1 min.

5. α-sinucleina in vitro, insulina bovina e formação de fibrila Hewl

  1. Preparação de proteínas
    1. α-synuclein:
      Nota: a expressão e purificação da α-synucleina recombinante é realizada conforme descrito por Hoyer et al.18 com algumas modificações, e a pureza da α-synucleina é confirmada por SDS-PAGE.
      1. Dialyze purified α-synuclein durante a noite de encontro ao Saline fosfato-tamponado (PBS).
      2. Determinar a concentração proteica utilizando um coeficiente de extinção de 5600 M-1 cm-1 a 275 Nm19.
      3. Aliquots proteína em 1,5 mL tubos e armazenar a-80 ° c até o uso.
    2. Insulina bovina e HEWL:
      1. Forneça a insulina bovina e a HEWL.
      2. Dissolver cada proteína em tampão glicina 50 mM (pH = 1,6; ajustar o pH com HCl).
      3. Determinar a concentração de insulina bovina e Hewl usando um coeficiente de extinção de 1,0 e 2,63 para 1,0 mg/ml a 276 nm e 280 nm, respectivamente20,21.
  2. Indução de fibrilação amilóide
    1. Preparação de soluções para fibrilação amilóide:
      1. Prepare a tioflavina T (ThT) tampão: pesar 0,3 g de NaH2po4 e dissolvê-lo em 80 ml de DW, ajustar o pH para 6,5, e aumentar o volume para 100 ml, adicionando DW.
      2. Prepare a solução de ações ThT (5 mM): pesar 1,6 mg de ThT e dissolvê-lo em 1 mL de tampão ThT, passar por um papel de filtro de 0,22 μm, e manter afastado da luz a 4 ° c até o uso.
        Nota: esta solução pode ser armazenar a 4 ° c por até 4 semanas.
      3. Preparar a solução ThT (1 mM): Adicionar 200 μL de solução de stock ThT (5 mM) a 800 μL de tampão ThT.
        Nota: esta solução pode ser armazenada a 4 ° c por até 1 semana.
    2. Formação de fibrila in vitro α-synuclein amilóide:
      1. Adicionar alíquotas (294 μL) de solução proteica (200 μM) e 6 μL de solução de ThT (1 mM) a 1,5 mL de tubos seguidos de agitação.
      2. Incubar os tubos em um termomisturador a 37 ° c agitação constante a 800 rpm por 4 dias.
      3. Tome alíquotas (10 μL) de amostras incubadas após intervalos de tempo regulares e adicione 490 μL de tampão ThT, misturado completamente, e incubar por 5 min em RT.
      4. Ajuste a excitação e as larguras da fenda da emissão como 5 nanômetro e 10 nanômetro, respectivamente, e a fluorescência da medida ThT pela excitação em 440 nanômetro e pela emissão em 485 nanômetro usando um espectrofotômetro da fluorescência.
    3. Formação de fibrila de insulina amilóide bovina in vitro:
      1. Adicionar 637 μL de solução proteica (250 μM) a 1,5 mL de tubo. Em seguida, adicione 13 μL de solução de ThT (1 mM) seguido de agitação.
      2. Adicionar alíquotas (200 μL) de solução proteica (250 μM) contendo 20 μM ThT a cada poço de uma placa de poço de fundo transparente 96 e selar a placa com fita de vedação cristalina.
      3. Coloque a placa num leitor de placas de fluorescência e incubar a 57 ° c sem agitação.
      4. Medir a fluorescência de ThT em intervalos de 30 minutos, com excitação a 440 nm e emissão a 485 nm, por 12 h.
        Nota: agitar a chapa durante 5 s antes de cada medição.
    4. Formação de fibrila in vitro HEWL amilóide:
      1. Adicionar alíquotas (200 μL) de solução proteica) 1 mM) contendo 20 μM ThT a cada poço de uma placa de poço de fundo transparente 96 e selar a placa com fita de vedação cristalina.
      2. Coloque a placa num leitor de placas de fluorescência e incubar a 57 ° c sem agitação.
      3. Meça a fluorescência de ThT em intervalos de 2 h, com excitação em 440 nanômetro e emissão em 485 nanômetro, por 4 dias.
        Nota: para todas as três proteínas, a formação de fibrila amilóide é confirmada por microscopia de força atômica (Figura 2b).

6. tratamento das mitocôndrias com fibrilas amilóides, ensaio de libertação de MDH e medição de ROS

  1. Incubação de mitocôndrias isoladas com fibrilas amilóides
    1. Gire sobre o centrifugador e o banho de água morno e ajuste a 4 ° c e a 30 ° c, respectivamente.
    2. Usando se, diluir homogeneate mitocondrial para uma concentração final de 1 mg/mL.
    3. Prepare duas séries de 1,5 mL de tubos contendo homogeneatos mitocondriais (uma série para ensaio de liberação de MDH e outra para medição de ROS mitocondrial).
    4. Adicionar alíquotas de fibrilas frescas ou amilóides de α-synucleina, insulina bovina ou HEWL (em concentrações finais de 5 μM, 10 μM, 20 μM e 25 μM; usar PBS ou tampão glicina como controle) para homogeneato mitocondrial (volume final = 200 μL) (ver tabela 1, tabela 2 , e tabela 3) seguida de agitar suavemente a solução com uma pipeta.
      Nota: para o ensaio de libertação de MDH, utilize Triton X-100 (numa concentração final de 0,5% [v/v]) como um controlo positivo para a libertação máxima da enzima.
    5. Incubar tubos contendo suspensões mitocondrial por 30 min em banho de água morna definido para 30 ° c.
    6. Meça a liberação mitochondrial MDH e o índice dos ROS como esboçado nas seções 6,2 e 6,3.
  2. Ensaio de libertação de MDH mitocondrial
    1. Centrifugue os homogeneatos mitocondriais incubados a 16.000 x g durante 15 minutos e, em seguida, colete cuidadosamente os sobrenadantes resultantes da atividade de MDH mitocondrial, conforme descrito na seção 4.
    2. Calcule a liberação de MDH como uma fração do efeito máximo (Triton X-100) como segue:

figure-protocol-16751

  1. Medição de ROS mitocondrial
    Nota: o conteúdo de ROS mitocondrial é determinado com o diacetato de diidrodichlorocarboxyfluorescein (DCFDA)22de precursores fluorogénicos sensíveis à oxidação.
    1. Prepare soluções para medição de ROS mitocondrial. Prepare uma solução de 50 μM de DCFDA dissolvendo-se em metanol (Prepare fresco) e uma solução de succinato de 200 mM dissolvendo-se em DW.
    2. Pipetar 191 μL de homogeneiza mitocondrial incubada a cada poço de uma placa de poço de 96 e adicionar 4 μL de 50 μM de DCFDA (1 μM de concentração final) e 5 μL de succinato de 200 mM (concentração final de 5 mM).
    3. Incubar a placa por 30 min em um banho de água morna ajustada em 30 ° c ao agitar delicadamente.
    4. Carregue a placa em um leitor da placa da fluorescência e meça a intensidade da fluorescência, com excitação em 485 nanômetro e emissão em 530 nanômetro.

7. análise estatística

  1. Realize todos os experimentos pelo menos 2x ou 3x com ensaios de triplicado e realize testes estatísticos adequados. Aqui, os resultados são apresentados como média ± DP, e o teste tpareado de Student foi utilizado para calcular significância estatística. Os valores de p inferiores a 0, 1 e 0, 5 foram considerados estatisticamente significantes (* p < 0, 5; * * p < 0, 1).

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Resultados

O protocolo descreve um modelo para estudar as interações do fibrila do amilóide com as mitocôndria do cérebro do rato como um modelo in vitro biológico. Para a preparação mitocondrial, o meio de gradiente de densidade de 15% (v/v) foi usado para remover mielina como maior contaminação do tecido cerebral14. Como mostrado na Figura 1a, a centrifugação em 30.700 x g produziu duas bandas distintas de material, mielina (...

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Discussão

Uma riqueza de resultados experimentais sustenta a hipótese de que a citotoxicidade dos agregados fibrilares está significativamente associada à sua capacidade de interagir e permeabilizar as membranas biológicas4,5. No entanto, a maioria dos dados são baseados em bicamadas lipídico artificial que não refletem necessariamente as propriedades intrínsecas das membranas biológicas, que são estruturas heterogêneas com uma grande variedade de fosfolipídios...

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Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por subsídios do Conselho de pesquisa do Instituto de estudos avançados em ciências básicas (IASBS), Zanjan, Irã.

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Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetateSigma35845
Ammonium sulfateMerck1012171000
Black 96-well plateCorning
Black Clear-bottomed 96-well plateCorning
Bovine insulinSigmaI6634
Bovine Serum Albumin (BSA)SigmaA2153
BSA essentially fatty acid-freeSigmaA6003
CentrifugeSigma
Crystal clear sealing tapeCorning
CuSO4Sigma451657
Dialysis bag (cut off 2 KDa)SigmaD2272
Dounce homogenizerPotter Elvehjem
EDTASigmaE9884
Fluorescence plate readerBioTek
Fluorescence spectrophotometerCary Eclipse VARIAN
FolinMerckF9252
GlycineSigmaG7126
GuillotineMade in Iran
HClMerckH1758
Hen Egg White Lysozyme (HEWL)SigmaL6876
Na2CO3SigmaS7795
NaH2PO4SigmaS7907
NaOHMerckS8045
OxaloacetateSigmaO4126
PercollGE Healthcare
Phosphate Buffer Saline (PBS)SigmaCS0030
PMSFSigmaP7626
Potassium sodium tartrateSigma217255
Quartz cuvetteSigma
Spectrophotometeranalytik jenaSPEKOL 2000 model
SuccinateSigmaS2378
SucroseMerck1076871000
ThermomixerEppendorph
Thioflavin TSigmaT3516
Tris-HClMerck1082191000
Triton X-100SigmaT9284
TryptoneQUELAB
Water bathMemmert
Yeast ExtractQUELAB
β-NADHSigmaN8129

Referências

  1. Merlini, G., Bellotti, V. Molecular mechanisms of amyloidosis. New England Journal of Medicine. 349, 583-596 (2003).
  2. Berg, I. Modeling amyloid disease in Drosophila melanogaster, Linköping Studies in Science and Technology Dissertation No. 1320. , Linköping University. Linköping Institute of Technology, Department of Physics, Chemistry and Biology (2010).
  3. Kagan, B. L. Protein aggregation, ion channel formation, and membrane damage. Protein Misfolding, Aggregation, and Conformational Diseases. Uversky, V. N., Fink, A. L. , Springer US. New York. 223-236 (2006).
  4. Demuro, A., et al. Calcium dysregulation and membrane disruption as a ubiquitous neurotoxic mechanism of soluble amyloid oligomers. The Journal of Biological Chemistry. 280, 17294-17300 (2005).
  5. Kayed, R., et al. Permeabilization of lipid bilayers is a common conformation-dependent activity of soluble amyloid oligomers in protein misfolding diseases. The Journal of Biological Chemistry. 279, 46363-46366 (2004).
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