Ensaio de formação presynapse usando Presynapse organizador contas e "Neuron Ball" cultura

Resumo

A formação de presynapse é um processo dinâmico que inclui a acumulação de proteínas sináptica na ordem apropriada. Neste método, a formação do presynapse é provocada pelos grânulos conjugados com uma proteína do organizador do presynapse em folhas axonal da cultura da esfera do Neuron do "", de modo que a acumulação de proteínas sináptica seja fácil de ser analisada durante a formação do presynapse.

Resumo

Durante o desenvolvimento neuronal, a formação de sinapse é um passo importante para estabelecer circuitos neurais. Para formar sinapses, as proteínas sinápticas devem ser fornecidas em ordem apropriada pelo transporte de corpos celulares e/ou tradução local em sinapses imaturas. No entanto, não é totalmente compreendido como as proteínas sinápticas se acumulam em sinapses em ordem adequada. Aqui, nós apresentamos um método novo para analisar a formação pré-sináptica usando a combinação da cultura da esfera do neurônio com os grânulos para induzir a formação do presynapse. As esferas do Neuron que são agregados da pilha neuronal fornecem as folhas axonal longe dos corpos e dos dendrites da pilha, de modo que os sinais fluorescentes fracos dos presynapses possam ser detectados evitando sinais esmagadores de corpos da pilha. Como grânulos para desencadear a formação de presynapse, usamos grânulos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2), um organizador pré-sináptica excitatória. Usando este método, Nós demonstramos que o transportador vesicular 1 do glutamato (vGlut1), uma proteína sináptica do vesícula, acumulada em presynapses mais rapidamente do que Munc18-1, uma proteína da zona ativa. Munc18-1 acumulou a tradução-dependente no presynapse mesmo depois de remover corpos de pilha. Este achado indica o acúmulo de Munc18-1 por tradução local em axônios, não transporte de corpos celulares. Em conclusão, este método é apropriado analisar a acumulação de proteínas sináptica em presynapses e na fonte de proteínas sináptica. Como a cultura da esfera do neurônio é simples e não é necessário usar o instrumento especial, este método poderia ser aplicável a outras plataformas experimentais.

Introdução

A formação de sinapse é uma das etapas críticas durante o desenvolvimento de circuitos neurais^1,2,3. A formação de sinapses especializadas em compartimentos compostos de pré e pós-sinapses é um processo complexo e multipasso que envolve o reconhecimento adequado de axônios e dendritos, formação de zona ativa e densidade pós-sináptica, e alinhamento adequado de canais iônicos e receptores neurotransmissores^1,2. Em cada processo, muitos tipos de proteínas sinápticas se acumulam a estes compartimentos especializados em tempo adequado, transportando proteínas sinápticas de corpos celulares e/ou por tradução local nos compartimentos. Estas proteínas sinápticas são consideradas dispostas de forma organizada para formar sinapses funcionais. Disfunção de algumas proteínas sinápticas envolvendo a formação de sinapse resulta em doenças neurológicas^4,5. Entretanto, permanece obscuro como as proteínas sináptica acumulam no sincronismo apropriado.

Para investigar como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada, é necessário examinar a acumulação de proteínas sinápticas em ordem cronológica. Alguns relatos demonstraram imagens ao vivo para observar a formação de sinapse em cultura dissociada de neurônios^6,7. Entretanto, é demorado encontrar os neurônios que apenas começam a formação do sinapse a microscopia. Para observar a acumulação de proteínas sinápticas de forma eficiente, a formação de sinapse deve começar no momento em que os pesquisadores querem induzir a formação. O segundo desafio é distinguir o acúmulo de proteínas sinápticas devido ao transporte de corpos celulares ou tradução local em sinapses. Para esse efeito, o nível de tradução é necessário para ser medido a condição de que não permite o transporte de proteínas sinápticas de corpos celulares.

Nós desenvolvemos o ensaio novo da formação do presynapse usando a combinação de cultura da esfera do neurônio com grânulos para induzir a formação do presynapse⁸. A cultura da esfera do Neuron é desenvolvida para examinar o phenotype axonal, devido à formação de folhas axonal que cercam corpos da pilha^9,10. Foram utilizados grânulos magnéticos conjugados com repetição rica em leucina transmembrana neuronal 2 (LRRTM2) que é um organizador pré-sináptico para induzir presynapses excitatórias (Figura 1a)^11,12,13. Usando os grânulos LRRTM2, a formação do presynapse começa no momento em que os grânulos são aplicados. Isto significa que a formação de pré-sinapse começa em milhares de axônios de uma bola de neurônio ao mesmo tempo, assim, permite examinar o curso de tempos precisos de acumulação de proteínas sináptica eficientemente. Além disso, a cultura da bola de neurônio é fácil de bloquear o transporte de proteínas sinápticas de soma removendo corpos celulares (Figura 1b)⁸. Já confirmamos que os axônios sem corpos celulares podem sobreviver e são saudáveis pelo menos 4 h após a remoção de corpos celulares. Assim, este protocolo é adequado para investigar a partir de onde as proteínas sinápticas são derivadas (corpo celular ou AXON), e como as proteínas sinápticas se acumulam de forma organizada.

Protocolo

Os experimentos descritos neste manuscrito foram realizados de acordo com as diretrizes delineadas no Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade da cidade de Yokohama.

1. preparação de esferas do neurônio como a cultura de suspensão da gota (dias in vitro (div) 0-3)

Nota: os procedimentos descritos aqui para a preparação da cultura da esfera do neurônio são baseados no método relatado previamente pelo grupo de Sasaki com algumas modificações^9,10. Também adotamos diversos procedimentos do método Banker para a cultura dissociada¹⁴.

1. Confirmando os seguintes antes de começar a dissecção
   1. Prepare todas as soluções necessárias e esterilize-as por autoclave/filtração com antecedência.
   2. Mantenha-se pronto todos os instrumentos e materiais a ser usados em cada etapas desta cultura cortical do neurônio.
   3. Pulverize e limpe o armário do fluxo de ar laminar, a tabela da dissecção, a placa do estágio do stereomicroscope, as tesouras, e o fórceps com etanol 70%.
2. Eutanizar o rato em cima da aplicação de CO₂ e dissecar o abdômen para obter os embriões E16.
3. Retire os cérebros dos embriões com cuidado com a ajuda de pontas finas do fórceps e transfira-os em pratos da cultura da pilha de 60 milímetros que contêm 4 mL da solução de sal tamponada HEPES (HBSS).
   Nota: o meio de dissecção HBSS contém 10 mM de HEPES (pH 7,4), 140 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 1, 9 mM na₂HPO₄, 1,1 mm KH₂po₄, 5,6 mm D-glucose e 5,64 μm de fenol vermelho.
4. Retire o couro cabeludo, cortar o bulbo olfativo, separar córtices de cada hemisfério cerebral usando as pontas finas de fórceps estereomicroscópio, e transferir para outros 60 mm pratos contendo HBSS fresco. Use pelo menos 3-5 embriões para cada cultura separada da esfera do neurônio.
5. Corte os córtices em partes pequenas com as tesouras microdissecando da mola em uma capa laminar da cultura da pilha de fluxo.
6. Transfira os córtices triturados a um tubo de 15 ml e Trypsinize os córtices triturados em 4 ml de tripsina de 0,125% em HBSS para 4,5 minutos em um banho de água em 37 ° c.
   Nota: este tempo de tripsinização é crítico para a cultura eficiente do neurônio como o tempo crescente (> 4,5 min) conduz aos neurônios muito mais inoperantes.
7. Transfira os agregados celulares para um novo tubo de 15 mL contendo 10 mL de HBSS por uma pipeta de transferência estéril e incubar a 37 ° c durante 5 min. Repita este passo mais uma vez.
8. Transfira os agregados celulares para um novo tubo de 15 mL contendo 2 mL de meios Neurobasais contendo GlutaMax, suplemento B27 (meio NGB), 0, 1% DNase I e 10% de soro de cavalo.
9. Triturar os córtices tripsinizadas repetidamente pipetagem os acima e para baixo (3-5 vezes) usando o vidro fino fogo-lustrado pipeta de Pasteur.
   Nota: o diâmetro do vidro fino polido a fogo pipeta de Pasteur é muito importante como descrito no papel¹⁴do método do banqueiro. Se a pipeta é demasiado estreita para passar córtices, prepare pipetas possuindo 2-3 tamanhos diferentes, e tente a partir de pipeta maior.
10. Para preparar as esferas do neurônio, tome a suspensão acima da pilha e ajuste a densidade da pilha a 1 x 10⁶ Cells/ml usando o meio de NGB.
11. Cultura os neurônios corticais como gotas penduradas contendo 10.000 células/gota (1 gota é 10 μL) dentro das tampas superiores de 10 cm pratos de cultura.
12. Adicionar 7 ml de fosfato salina tamponado (PBS) para a parte inferior dos pratos de cultura, em seguida, manter em uma incubadora para 3 dias a 37 ° c com 5% co₂ condição umidificada para permitir a formação de bola de neurônio.

2. colocando bolas de neurônio em coberturas de vidro revestidas com PLL e manutenção da cultura (div 3-11)

Nota: antes do revestimento de coberturas de vidro com poli-L-lisina (PLL), lavar as lamelas usando detergente é importante. Os COVERSLIP de vidro são às vezes não tão limpos para a cultura neuronal e o revestimento uniforme com PLL. O revestimento não-uniforme de PLL pode conduzir à extensão axonal desigual de esferas do neurônio.

1. Mergulhe as coberturas em 1/20 diluído neutro não-fósforo detergente em cerâmica racks para 1-3 overnights.
2. Lave os lamínulas 8 vezes em água ultrapura e, em seguida, esterilize num forno a 200 ° c durante 12 h.
   Nota: todas as etapas daqui devem ser feitas em uma capa de cultura de célula de fluxo de ar laminar.
3. Transfira coberturas assadas para pratos de 100 mm. Após selar o prato por parafilm entre uma tampa e um prato inferior, os COVERSLIP cozidos podem ser mantidos para o armazenamento a longo prazo.
4. Opcional Aplique pontos de parafina nos lamínulas. Os pontos fazem o espaço para impedir as esferas do neurônio que desanexam dos COVERSLIP durante a imunomarcação pelo contato direto de esferas do neurônio aos pratos plásticos. Derreter a parafina em um frasco adequado em um banho de água quente em cerca de 90 ° c. Mergulhe uma pipeta Pasteur na parafina, em seguida, tocá-lo rapidamente para fazer três pontos perto da borda de uma lamínula.
5. Revestimento PLL (MW > 300.000) nas coberturas de vidro parafina-frisadas em pratos de 60-mm usando a solução de PLL (15 μg/mL no tampão do borato), e mantenha-os para pelo menos 1 h em uma incubadora do CO₂ .
6. Depois de lavar 4 vezes com PBS, transfira as coberturas revestidas com PLL para uma placa de 4 poços contendo 350 μL de meio NGB em cada poço e cloridrato de citosina β-D-arabinofuranoside (AraC, 3 μM) para a mídia para matar células divisórias.
7. Mantenha esta placa 4-well que contem os COVERSLIP PLL-revestidos na incubadora do co₂ pelo menos por 20 minutos para assegurar a temperatura do alcance médio 37 ° c antes de transferir esferas do neurônio.
8. Na div 3, quando "bolas de neurônio" são formadas muito bem, transferi-los para coberturas revestidas PLL dentro da placa de 4 poços (5 bolas neurônio/poço) mantidos na incubadora co₂ .
9. Após 48 h, substitua o meio de cultura da esfera do neurônio com meio arac-livre fresco de NGB. Use uma placa quente em uma capa da cultura da pilha do fluxo de ar laminar cuja a temperatura seja mantida pronta em 37 ° c imediatamente antes deste procedimento.
   Nota: é necessário executar o meio que muda tão ràpida como possível em uma placa quente para reduzir o tempo que as culturas estão na parte externa da incubadora do CO₂ .
10. Mantenha esta cultura da esfera do neurônio na incubadora do co₂ para até div 11.
    Nota: em div 11-12, as esferas do neurônio que estendem neuritos até 1-2 milímetros são usadas para experiências.

3. aplicando LRRTM2 grânulos na cultura da esfera do neurônio com ou sem corpos da pilha (div 11-12)

Nota: antes da aplicação de LRRTM2 grânulos na cultura da esfera do neurônio, recomenda-se remover corpos da pilha. Portanto, prepare LRRTM2 grânulos em primeiro lugar, em seguida, remova os corpos celulares e, mais tarde, aplique LRRTM2 grânulos para a cultura o mais cedo possível. O LRRTM2 biotinylated é fornecido pelo grupo de Nogi (Universidade da cidade de Yokohama) como o meio condicionado. Usam um vetor da expressão que inclui a seqüência do Acceptor da biotina e a ligase da biotina de e. coli BirA ^{15 anos} de ^{, 16} para anexar biotina a LRRTM2, e o vetor de expressão é transfected para Expi293F células incluídas no sistema de expressão Expi293. A informação vetorial está disponível na Figura 1 suplementar. Os grânulos LRRTM2-conjugated do estreptavidina de biotinylated reduziram o fundo da imunocoloração comparado extremamente ao LRRTM2-FC-grânulos conjugated da proteína A que são usados para o sistema do protótipo LRRTM2⁸.

1. Preparação de grânulos LRRTM2 biotinylated
   1. Para remover o excesso de biotina do meio condicionado de células Expi293F expressando LRRTM2 biotinylated, aplique 1,7 mL do meio condicionado misturado com 0,8 mL de PBS (total 2,5 mL) para a coluna de filtração de gel PD-10. A coluna PD-10 é pré-equilibrada com 25 mL de água ultrapura e 25 mL de PBS.
   2. Elute com 3,5 mL de PBS e recolhe o fluxo-através como um estoque LRRTM2.
      Nota: este estoque LRRTM2 pode ser dispensado a alíquotas e armazenada em-80 ° c para longo prazo. Os níveis de expressão de LRRTM2 biotinylated às vezes variam do lote ao lote. Assim, o volume apropriado do estoque LRRTM2 ao conjugado aos grânulos deve ser determinado para dar forma a presynapses bastante em esferas do neurônio, quando o lote novo do estoque LRRTM2 é usado na primeira vez.
   3. Tome 20 μL da suspensão de partículas magnéticas revestidas com streptavidina (diâmetro: 4-5 μm) a um tubo de microcentrífuga. Imobilize os grânulos a um instrumento handmade Unido com os ímãs permanentes do neodymium e lave três vezes com 100 μL de PBS-MCBC em tubos do microcentrifugador de 1,5 mL.
      Nota: PBS-MCBC contém PBS incluindo 5 mM MgCl_2,3mm CAcl₂, 0,1% BSA, e 0,1% completo EDTA-livre.
   4. Após a remoção completamente PBS-MCBC dos grânulos, adicione o volume predeterminado de estoque LRRTM2 (geralmente 500-1000 μL, veja a nota 3.1.2) aos grânulos lavados. Incubar a mistura utilizando rotador a 4 ° c por 1-2 h.
   5. Lave os grânulos duas vezes com 100 μL de PBS-MCBC, e mais tarde com 100 μL de meio NGB.
   6. Resuspend os grânulos LRRTM2 em 50 μl do meio de NGB para a aplicação à cultura da esfera do neurônio.
   7. Use os mesmos procedimentos para preparar as esferas de controle (controle negativo) em um outro tubo do microcentrifugador exceto a adição de proteínas biotinylated-LRRTM2.
2. Removendo corpos de células de bolas de neurônio em div 11-12 e aplicando LRRTM2 contas
   1. Rotule os poços de uma placa 4-well como "corpo da pilha (+)" e "corpo da pilha (-)".
   2. Corte o final de uma ponta amarela no ângulo de 45 ° com uma lâmina de barbear previamente pulverizada com 70% de etanol estereomicroscópio (Figura 1b).
   3. Coloque a ponta amarela na área do corpo da célula de uma bola de neurônio e retire os corpos celulares por sucção (Figura 1b).
   4. Para identificar cada condição especificada do experimento, Rotule os poços novamente como "LRRTM2 Beads" e "contas de controle".
   5. Aplique o LRRTM2 e esferas de controle na cultura da esfera do neurônio, e mergulhe à parte inferior das placas por 1 minuto usando ímãs da ferrite para começar a formação do presynapse. Este procedimento assegura para touchdown todas as contas ao mesmo tempo. Especialmente, seria eficaz para incubação de curto período de tempo (por exemplo, 30 min e 1 h) com LRRTM2 contas de forma síncrona.
   6. Para realizar experimentos de curso de tempo, rotule cada poço separado como 0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 4 h e 18 h e aplique LRRTM2 grânulos nos intervalos de tempo indicados.
   7. Após a adição de LRRTM2 grânulos, incubar a cultura da esfera do neurônio com os grânulos para o tempo especific (0 min a 18 h) para dar forma a presynapses.

4. imunocoloração e microscopia

Nota: fixar as células por 4 h através de incubação com LRRTM2 grânulos nas condições experimentais com e sem corpos celulares, como os axônios tendem gradualmente a morrer na ausência de corpos celulares após 4 h. Em caso do curso do tempo com grânulos LRRTM2, fixe as pilhas no tempo especificado indicado.

1. Fixar e manchar neurônios na cultura da esfera do neurônio após a formação do presynapse com grânulos LRRTM2
   1. Remova o meio de NGB e fixe as esferas do neurônio com o PFA de 4% em PBS (250 μl/poço) por 20 minutos na temperatura ambiente, e lave então com 500 μL de PBS 4 vezes cada 5 minutos.
   2. Lave as células fixas com TBS (solução tampão salina Tris: 50 mM Tris-HCl (pH 7,3) e 150 mM NaCl) por mais de 5 min.
   3. Permeabilize as células/axônios da cultura da esfera do neurônio com TBS contendo 0,3% Triton X-100 por 5 min.
   4. Mantenha as células 1 h para bloqueio com tampão de bloqueio (0,1% Triton X-100 e 5% NGS (soro de cabra normal) em TBS).
   5. Incubar as células com anticorpos primários; anti-Rabbit-vGlut1 (transportador vesicular do glutamato 1 (1:4000)) e anti-rato-Munc18-1 (1:300) diluído com o diluente do anticorpo para durante a noite em 4 ° c.
   6. Lave as coberturas 4 vezes com a reserva de imunofluorescência (IF) (0,1% Triton X-100 e 2% BSA em TBS) e incubar por 30 min com fluoróforo (Alexa Dye)-2 anticorpos conjugados; anti-mouse-IgG-Alexa 555 (1:500), anti-Rabbit-IgG-Alexa 488 (1:1000).
   7. Manchar os núcleos dos corpos celulares de neurônios por 5 min com 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, 1 μg/mL) em PBS.
   8. Lave as coberturas três vezes com PBS e, em seguida, monte em lâminas de vidro usando suportes de montagem contendo 167 mg/mL de álcool poli (vinil) e 6 mg/mL de N-propil galato.
   9. Guarde as lâminas de vidro num frigorífico a-20 ° c até à microscopia. Sinais fluorescentes das lâminas de vidro são detectáveis por pelo menos 1 ano quando as lâminas são armazenadas a-20 ° c.
2. Tirar imagens microscópio de fluorescência
   1. Capture o contraste diferencial da interferência e as imagens de IF um microscópio fluorescente invertido com uma câmera refrigerada do CCD usando a lente da imersão do óleo 60X. Para o software da aquisição da imagem, use um sistema instalado software do microscópio. Use Image J como software de análise de imagem.
   2. Meça a intensidade de IF em presynapses no AXON usando a seguinte fórmula; SE intensidades de região de interesse em grânulos (ROI) – off esferas região intensidade/axonal intensidade ao longo de 20 μm de grânulos – intensidade de fundo. Esta intensidade da relação fornece o índice da acumulação da proteína (figura 4a). Realize as medições em imagens originais de 16 bits usando o software Image J.
   3. Para quantificar o nível de acumulação de proteína particular em pré-sinapse induzida com LRRTM2 grânulos, sempre selecione a área longe de 2-campo de visão ou mais para além do corpo celular com microscópio (60X).
      Nota: a seleção da área na esfera do neurônio para a imagem latente é crucial porque os axônios densos estão perto do corpo da pilha e a periferia da esfera do neurônio pode fornecer o único AXON.
   4. Para a medida exata, escolha o campo axonal 5-Different (distância similar dos corpos da pilha)/COVERSLIP.
   5. Manter condições de imagem idênticas em diferentes dias e entre experimentos

Resultados

Aqui, nós mostramos resultados representativos da acumulação de proteínas pré-sináptica em presynapses LRRTM2-induced de folhas axonal da cultura da esfera do neurônio. Como proteínas pré-sinápticas, foi analisada a proteína de vesículas excitatórias vGlut1 e a proteína da zona ativa Munc18-1. Nós igualmente examinamos o curso do tempo da acumulação de vGlut1 e de Munc18-1 em presynapses, e obtivemos resultados que indicam a fonte de Munc18-1 nos presynapses usando axônios que removemos corpos de pilha ...

Discussão

Nós desenvolvemos o método novo para examinar a formação do presynapse estimulada com LRRTM2-Beads usando a cultura da esfera do neurônio. Atualmente, a maior parte do ensaio de formação pré-sinapse inclui grânulos revestidos de poli-D-lisina (PDL) e cultura dissociada/câmara microfluídica^20,21,22. Uma das vantagens deste método é LRRTM2-Beads. Quando LRRTM2 interagir com o neurexin para dar forma a presynapses exci...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibody diluent	DAKO	S2022
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	715-585-151
Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	711-545-152
mouse anti-Munc18-1	BD Biosciences	610336
B-27 Supplement (50X), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
Bovine Serum Alubumin (BSA)	Nacalai Tesque	01863-48
Cell-Culture Treated Multidishes (4 well dish)	Nunc	176740
Complete EDTA-free	Roche	11873580001
cooled CCD camera	Andor Technology	iXON3
Coverslip	Matsunami	C015001	Size: 15 mm, Thickness: 0.13-0.17 mm
Cytosine β-D-arabinofuranoside (AraC)	Sigma-Aldrich	C1768
4',6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride (DAPI)	Nacalai Tesque	11034-56
Deoxyribonuclease 1 (DNase I)	Wako pure chemicals	047-26771
Expi293 Expression System	Thermo Fisher Scientific	A14635
Horse serum	Sigma-Aldrich	H1270
image acquisition software	Nikon	NIS-element AR
Image analysis software	NIH	Image J	https://imagej.nih.gov/ij/
Inverted fluorecent microscope	Nikon	Eclipse Ti-E
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Neurobasal media	Thermo Fisher Scientific	#21103-049
Normal Goat Serum (NGS)	Thermo Fisher Scientific	#143-06561
N-propyl gallate	Nacalai Tesque	29303-92
Paraformaldehyde (PFA)	Nacalai Tesque	26126-25
Paraplast Plus	Sigma-Aldrich	P3558
Poly-L-lysine Hydrobromide (MW > 300,000)	Nacalai Tesque	28359-54
poly (vinyl alcohol)	Sigma	P8136
Prepacked Disposable PD-10 Columns	GE healthcare	17085101
rabbit anti-vesicular glutamate transporter 1	Synaptic Systems	135-302
SCAT 20X-N (neutral non-phosphorous detergent)	Nacalai Tesque	41506-04
Streptavidin-coated magnetic particles	Spherotech Inc	SVM-40-10	diameter: 4-5 µm
TritonX-100	Nacalai Tesque	35501-15
Trypsin	Nacalai Tesque	18172-94