Realizando xenoenxertos de músculo esquelético humano em camundongos imunodeficientes

Resumo

Doenças humanas complexas podem ser desafiadoras para modelar em sistemas de modelos laboratoriais tradicionais. Aqui, nós descrevemos uma aproximação cirúrgica para modelar a doença do músculo humano com a transplantação de biópsias humanas do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Resumo

Os efeitos do tratamento observados em estudos em animais muitas vezes não conseguem ser recapitulados em ensaios clínicos. Embora esse problema seja multifacetado, uma razão para essa falha é o uso de modelos laboratoriais inadequados. É desafiador modelar doenças humanas complexas em organismos laboratoriais tradicionais, mas esta questão pode ser contornada através do estudo de xenoenxertos humanos. O método cirúrgico que descrevemos aqui permite a criação de xenoenxertos de músculo esquelético humano, que podem ser usados para modelar a doença muscular e realizar testes terapêuticos pré-clínicos. um Conselho de revisão institucional (IRB)-protocolo aprovado, espécimes de músculo esquelético são adquiridos de pacientes e, em seguida, transplantados em NOD-Rag1^NULLIL2rγ^NULL (NRG) hospedeiro camundongos. Esses camundongos são hospedeiros ideais para estudos de transplante devido à sua incapacidade de fazer linfócitos maduros e, portanto, não conseguem desenvolver respostas imunes adaptáveis mediadas por células e humorais. Camundongos hospedeiros são anestesiados com isoflurano, e os músculos do rato tibial anterior e extensor dos dedos longos são removidos. Uma parte do músculo humano é colocada então no compartimento tibial vazio e suturada aos tendões proximal e longe do ponto de origem do músculo do longo do peroneus. O músculo xenografado é espontaneamente vascularizado e inervado pelo hospedeiro do camundongo, resultando em músculo humano regenerado de forma robusta que pode servir de modelo para estudos pré-clínicos.

Introdução

Tem sido relatado que apenas 13,8% de todos os programas de desenvolvimento de medicamentos submetidos a ensaios clínicos são bem-sucedidos e levam a terapias aprovadas¹. Quando esta taxa de sucesso for mais elevada do que os 10,4% relatados previamente², há ainda uma sala significativa para a melhoria. Uma abordagem para aumentar a taxa de sucesso dos ensaios clínicos é melhorar os modelos laboratoriais utilizados na investigação pré-clínica. A administração de alimentos e drogas (FDA) requer estudos em animais para demonstrar a eficácia do tratamento e avaliar a toxicidade antes dos ensaios clínicos de fase 1. No entanto, muitas vezes há concordância limitada nos desfechos de tratamento entre estudos em animais e ensaios clínicos³. Além disso, a necessidade de estudos pré-clínicos em animais pode ser uma barreira intransponível para o desenvolvimento terapêutico em doenças que não têm um modelo animal aceito, o que geralmente é o caso de doenças raras ou esporádicas.

Uma maneira de modelar a doença humana é transplantar o tecido humano em camundongos imunodeficientes para gerar xenoenxertos. Existem três principais vantagens para os modelos de Xenoenxerto: primeiro, eles podem recapitular as complexas anormalidades genéticas e epigenéticas que existem na doença humana que podem nunca ser reprodutíveis em outros modelos animais. Em segundo, os xenoenxertos podem ser usados para modelar doenças raras ou esporádicas se as amostras do paciente estiverem disponíveis. Terceiro, os xenoenxertos modelam a doença dentro de um sistema completo in vivo. Por estas razões, nós supor que os resultados da eficácia do tratamento em modelos do xenograft são mais prováveis traduzir aos testes nos pacientes. Os xenoenxertos de tumores humanos já foram utilizados com sucesso para desenvolver tratamentos para cânceres comuns, incluindo mieloma^{múltiplo, bem}como terapias personalizadas para pacientes individuais^4,5,6, o ⁷.

Recentemente, os xenoenxertos têm sido usados para desenvolver um modelo de doença muscular humana⁸. Neste modelo, os espécimes humanos da biópsia do músculo são transplantados nos hindmembros de ratos immunodeficientes de NRG para dar forma a xenoenxertos. Os myofibers humanos transplantados morrem, mas as pilhas de haste humanas do músculo atuais no xenograft expandem subseqüentemente e diferenciam-se em myofibers humanos novos que repovoam o lamina básico humano enxertado. Conseqüentemente, os myofibers regenerados nestes xenoenxertos são inteiramente humanos e são revascularizados espontâneamente e inervado pelo anfitrião do rato. Importante, o tecido muscular do paciente da distrofia muscular fascioscapulohumeral (FSHD) transplantado em ratos recapitula características chaves da doença humana, a saber expressão do fator⁸da transcrição DUX4 . A FSHD é causada pela superexpressão de DUX4, que é epigeneticamente silenciada no tecido muscular normal^9,10. No modelo de FSHD xenograft, o tratamento com um morfolino DUX4-specific foi mostrado para reprisificar com sucesso DUX4 expressão e função, e pode ser uma opção terapêutica potencial para pacientes de FSHD¹¹. Estes resultados demonstram que os xenoenxertos do músculo humano são uma aproximação nova para modelar a doença do músculo humano e para testar terapias potenciais nos ratos. Aqui, nós descrevemos em detalhe o método cirúrgico para criar xenoenxertos humanos do músculo esqueletal em ratos immunodeficientes.

Protocolo

Todo o uso de espécimes de pesquisa de sujeitos humanos foi aprovado pelo Conselho de revisão institucional (IRB) da Johns Hopkins para proteger os direitos e o bem-estar dos participantes. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidado e uso de animais da Universidade Johns Hopkins (IACUC), de acordo com o guia nacional de saúde (NIH) para o cuidado e uso de animais de laboratório. Macho NOD-Rag1^NULLIL2rγ^NULL (NRG) camundongos hospedeiros (8-12 semanas de idade) são usados para realizar experimentos xenograft. Estes ratos são alojados em racks ventilados e são dadas HEPA-filtrado, temperado, e ar humidificado, bem como osmose reversa filtrada água hiperclorada. Os ratos são fornecidos água e uma dieta antibiótica irradiada (tabela de materiais) ad libitum, e a instalação fornece 14 h de luz para 10 h de escuro como controlado pelo temporizador central.

1. preparação do equipamento

1. Adquira NOD-Rag1^NULLIL2r γ^null (NRG) camundongos, 8-12 semanas de idade.
2. Equipamento cirúrgico da autoclave: tesouras, fórceps, suporte da agulha, grampeador cirúrgico (tabela dos materiais), grampos da ferida, limpezas cirúrgicas (tabela dos materiais), e taça (Figura 1a).
3. Prepare 50 mL de meios musculares (20% soro bovino fetal, 2% extrato de embrião de pintinho, 1% antibiótico/antimicótico em presuntos F10 médio). Manter todos os produtos químicos/drogas/soluções utilizadas para a cirurgia à temperatura ambiente, a menos que indicado de forma diferente no protocolo.
4. Prepare uma seringa de 1 mL com uma agulha de 26 G que seja 3/8 polegadas de comprimento contendo 2 mg/mL de analgésico (tabela de materiais), e coloque no gelo. O analgésico pode ser diluído para a concentração adequada usando salina tampão fosfato estéril (PBS).

2. Preparação cirúrgica

1. Obtenha uma biópsia do músculo humano um protocolo IRB-aprovado dos pacientes cujos os músculos exibem a força > 4-/5 na escala de MRC (Conselho de pesquisa médica)¹². Coloque o espécime de pesquisa em um prato de Petri de 100 mm x 15 mm contendo meios musculares.
   Nota: A escala do MRC é utilizada na prática clínica como uma avaliação da força muscular com 0 não mostrando contração, 5 mostrando potência normal e 4 (4-a 4 +) mostrando movimento contra resistência¹². Nós encontramos que os músculos com fraqueza suave a moderada (MRC > 4-/5) mostram tipicamente a patologia da doença mas não são substituídos extensivamente pelo tecido gordo ou pela fibrose, ambo impedem a regeneração do xenograft. No caso do tecido da autópsia onde uma contagem recente de MRC não está disponível, a qualidade do músculo pode ser alcançada através da observação bruta. As biópsias do músculo que são cor-de-rosa pálido na aparência ou têm grandes áreas do tecido gordo não são prováveis ao xenograft com sucesso.
2. Retire qualquer fáscia remanescente ou tecido adiposo do espécime com tesouras cirúrgicas usando um microscópio estéreo e fonte de luz para ajudar a visualização.
3. Dissecar a biópsia muscular em cerca de 7 mm x 3 mm x 3 mm peças com tesoura cirúrgica usando o microscópio estéreo e uma fonte de luz. Assegure-se de que as fibras estejam dispostas longitudinalmente dentro da amostra.
4. Coloc o prato de Petri que contem o músculo dissecado no gelo. Em média, os xenoenxertos são mantidos em mídia por 4 horas, enquanto as cirurgias estão sendo executadas. Entretanto, as biópsias foram armazenadas nos meios por 24 h antes do xenotransplantar, e este atraso não parece impactar negativamente a transplantação ou a regeneração.
5. Coloque suturas sintéticas, não absorvíveis (tabela de materiais) em um prato de Petri de 100 mm x 15 mm contendo 70% de etanol.
6. Configurar um circuito de anestesia de procedimento duplo: Organize o circuito de respiração Mapleson E no microscópio estéreo e coloque a câmara de indução em um gabinete de biossegurança (Figura 1a,B).
7. Obter o peso do rato NRG colocando em uma taça autoclavada em uma escala, e transferência para a câmara de indução. Induzir anestesia isoflurano a 3%. Uma vez alcançada a profundidade anestésica apropriada — avaliada pela observação da frequência respiratória, relaxamento muscular e falta de movimento voluntário — reduza o ajuste do vaporizador para 1,5% para o restante da cirurgia.
8. Transfira o rato da câmara de indução para o circuito respiratório de Mapleson e e aplique pomada oftálmico aos olhos.
9. Retire o cabelo sobrejacente ao tibial anterior (ta) do tornozelo ao joelho com um aparador, seguido de um tratamento de 1 min com loção para depilação (tabela de materiais) (Figura 2a).
10. Desinfete o local cirúrgico por limpando a perna com solução de iodo-povidona. Em seguida, lave o Povidone-Iodo restante com 70% de etanol.
11. Injete o rato por via subcutânea com analgésico, como o carprofeno, (tabela de materiais) numa dose de 5 mg/kg.

3. cirurgia de Xenoenxerto

1. Tape a perna e faça uma incisão reta sobre o músculo tibilalis anterior (TA) com tesoura e pinça de íris originada nos tendões distais e terminando abaixo do joelho (Figura 2b).
2. Separe a pele do músculo que usa a dissecção sem corte com tesouras cirúrgicas.
3. Corte através do epimísio do músculo ta com tesouras começando no tendão e terminando no joelho.
   Nota: Este é um corte muito superficial (menos de 0,5 mm; Figura 2b, linha tracejada preta), e o ta subjacente não deve ser danificado no processo, pois isso tornaria a remoção mais desafiadora. Quando realizada corretamente, as fibras musculares irá relaxar visivelmente.
4. Corte o tendão distal do TA com tesoura, agarre o tendão com pinça de íris, e puxe o TA para cima em direção ao joelho (Figura 2C).
5. Corte o tendão distal do extensor digitorum longo (EDL) com tesoura e puxe a EDL para o joelho (Figura 2D). Uma vez que o tendão proximal do músculo peroneus longo (pl) é visível, retire a EDL com tesouras (Figura 2D, linha tracejada verde).
6. Retire o TA com tesouras (Figura 2D, linha tracejada azul) e use um esfregue cirúrgico molhado com PBS e leve pressão para atingir a hemostasia (Figura 2e).
7. Rosqueie uma sutura através do tendão e da guarnição proximal do longo do peroneus (pl), deixando aproximadamente 1,5 de polegada da linha em um ou outro lado do tendão (Figura 2F).
8. Realize a primeira metade de um nó quadrado cirúrgico de duas mãos, mas não aperte: isso dará forma a um círculo. Coloc um xenograft neste círculo e aperte o laço para fixar o xenograft. Complete a outra metade do nó quadrado (Figura 2G,H). Isto suturará o xenograft ao tendão proximal do PL.
9. Sutura da rosca através do tendão PL distal e repita a técnica do nó quadrado da etapa 3,8 para amarrar o Xenoenxerto ao tendão distal (Figura 2h,I).
   Nota: A artéria tarsal medial e a veia podem estar próximas ou em cima do tendão distal do PL. Não coloc suturas através ou em torno destas embarcações. É fácil dizer se uma sutura foi coloc impropriamente enquanto os vasos Blanch ou sangram. Se isso ocorrer, remova a sutura e coloque em um local diferente.
10. Puxe a pele sobre o músculo xenografados, sele com colagem cirúrgica, e coloc 2-3 grampos cirúrgicos sobre a incisão (Figura 2j).
11. Coloque o mouse em uma gaiola limpa em uma almofada aquecida para recuperar. Monitore o mouse até estar totalmente consciente e periodicamente nos próximos dias para sinais de infecção sistêmica local e para garantir que o local cirúrgico não seja reaberto.
    Nota: Uma dose única de analgésico como descrito na etapa 2,11 é tipicamente suficiente para alívio da dor. No entanto, os camundongos também devem ser monitorados quanto à dor persistente (por exemplo, claudicação, revestimento de babados, postura curvada) e, se necessário, re-dosado com analgésico a 24 h no pós-operatório.

4. coleção xenograft

Nota: Os xenoenxertos são tipicamente coletados entre 4 a 6 meses após a cirurgia. No entanto, as coletas foram realizadas até 12 meses após a cirurgia.

1. Coloque uma taça coberta contendo 200 mL de 2-metilbutano em uma caixa contendo gelo seco por um mínimo de 30 min antes da coleta de Xenoenxerto.
2. Induzir anestesia isoflurano a 3% em câmara de indução. Uma vez que a profundidade anestésica apropriada é conseguida, reduza o ajuste do vaporizador a 1,5% para o restante da cirurgia.
3. Transfira o rato da câmara de indução para o circuito de respiração Mapleson E arranjado num microscópio estéreo.
4. Remova o cabelo que sobrejacente o tibial anterior do tornozelo ao joelho com um aparador e uma loção da remoção do cabelo. As suturas que prendem o xenograft no lugar podem ser vistas através da pele (Figura 3a).
5. Tape a perna e use tesouras e pinças de íris para abrir a pele sobre o Xenoenxerto até que ambas as suturas sejam visíveis (Figura 3B). A pele que sobrejacente o xenograft pode ser removida como mostrado para fazer a remoção do xenograft mais fácil.
6. Use um bisturi para cortar entre o xenograft e a tíbia (Figura 3B, a seta denota o local inicial e a direção da incisão). Isto libertará um lado do xenograft.
7. Use um bisturi para cortar entre o músculo pl eo músculo gastrocnêmio (Figura 3C, incision ao longo epimísio rotulado com seta). O PL será removido com o xenograft.
8. Corte abaixo da sutura distal e através do tendão distal do PL (Figura 3D, corte ao longo da linha pontilhada).
9. Remova o xenograft e o PL agarrando a sutura com o fórceps da íris e desviando o para o joelho ao usar a tesoura para cortá-la longe do músculo subjacente (Figura 3E).
10. Corte acima da sutura proximal com tesoura para remover o xenograft e o PL (Figura 3F, corte ao longo da linha pontilhada em 3E).
11. Coloque a amostra em um pequeno pedaço de papelão ou plástico, e fixar o mais próximo possível das suturas. Ao fixar o espécime, esticar delicadamente o músculo para assegurar-se de que a orientação da fibra esteja mantida durante o processo de congelação da pressão. Depois que os pinos estão firmemente no lugar, deslize o músculo acima dos pinos assim que descansa apenas acima do cartão.
    Nota: Alternativamente, uma extremidade do xenograft pode ser montada no tragacanto em uma cortiça, ou pode ser submergida inteiramente no composto óptimo da temperatura de corte (O.C.T.) em um cryomold. Com o cuidado, a conformação muscular pode ser mantida com ambos os métodos.
12. Congele o xenograft no 2-methylbutane pre-cooled.
13. Loja xenograft em-80 ° c.
14. Imediatamente após a coleta de Xenoenxerto, eutanizar camundongos de acordo com as diretrizes da American Veterinary Medical Association:
    1. Coloc ratos em uma câmara selada com um sistema apropriado da eliminação do gás waste. Use isoflurano em uma concentração de 3-4% para induzir anestesia.
    2. Uma vez alcançada a profundidade anestésica apropriada — avaliada pela observação da frequência respiratória, relaxamento muscular e falta de movimento voluntário — aumente o ajuste do vaporizador para 5% para induzir a morte. Deixe os ratos na câmara por um adicional de 2 minutos após a respiração cessou. A morte é verificada observando-se que os camundongos não conseguem se recuperar dentro de 10 min após a overdose de isoflurano.
    3. Finalmente, realize luxação cervical nos camundongos.
       Nota: No caso de camundongos bilateralmente xenografados, o Xenoenxerto contralateral pode ser salvo para uma coleta posterior. Para realizar uma coleção da sobrevivência, abra a pele que sobrejacente o xenograft com um único corte reto com tesouras cirúrgicas, e remova o xenograft como descrito nas etapas 4,6 a 4,10. Em seguida, feche a pele sobre o compartimento tibial vazio usando cola cirúrgica e grampos. Trate o rato com analgésico como descrito na etapa 2,11 e coloc o rato na gaiola limpa na almofada heated para recuperar. Monitore o rato até que inteiramente consciente e periòdicamente sobre os próximos dias para sinais da infecção sistemática local e assegure-se de que o local cirúrgico não esteja reaberto.

5. Xenoenxerto imunoistoquímica

1. Use um criostat para cortar as seções de 10 a 12 μm do xenograft coletado em corrediças positivamente carregadas (tabela dos materiais).
2. Encha o frasco da mancha com metanol e pre-esfrie em-20 ° c por 30 minutos.
3. Coloc corrediças no metanol frio do gelo por 10 minutos para fixar e permeabilize as seções do xenograft.
4. Coloque as lâminas no frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
5. Bloco com anti-mouse IgG (tabela de materiais) para 2 h a 4 ° c.
6. Blot com anticorpos primários, como A spectrina, lamina A/C e miosina embrionária (tabela de materiais) em PBS suplementado com soro de cabra a 2% durante a noite a 4 ° c.
7. Coloque os slides em um frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
8. Blot com anticorpos secundários conjugados fluorescentes-corante (tabela de materiais) em PBS suplementado com soro de cabra a 2% por 1 h à temperatura ambiente.
9. Coloque as lâminas no frasco de coloração e lave 3x com tampão fosfato salina (PBS) por 5 min.
10. Coloque o meio de montagem (tabela de materiais) sobre as seções de xenoenxertos, coloque a lamínula na parte superior e use esmalte para selar a lamínula.

Figura 2: cirurgia de Xenoenxerto. (A) o cabelo é removido do local cirúrgico. (B) uma incisão é feita sobre o tibial anterior (ta). Os tendões distais do TA e do extensor longo do digitorum (EDL) são marcados com setas. A linha tracejada preta indica onde o epimísio será cortado na etapa 3,3. (C) o tendão distal do ta é cortado e o músculo é puxado até o joelho. (D) o tendão do EDL é cortado e o EDL é puxado até o joelho. Isto expõe o tendão proximal do longo do peroneus (pl) marcado com uma seta. Linhas tracejadas indicam onde cortar com tesouras para remover o EDL (verde) e PL (azul). (E) os EDL e ta são removidos. (F) uma sutura é colocada através do tendão proximal do pl. (G) o xenograft é coloc no compartimento tibial vazio e suturado ao tendão proximal do pl usando um nó quadrado cirúrgico da dois-mão. (H) uma sutura é colocada através do tendão distal do pl, marcada com uma seta, e outro nó quadrado cirúrgico de duas mãos é usado para suturar o Xenoenxerto para o tendão distal. (I) o Xenoenxerto é totalmente transplantado e suturado para o pl. (J) a pele é fechada com cola cirúrgica. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3:4 mês coleção xenograft. (A) o cabelo é removido do local cirúrgico. Suturas são visíveis a pele. (B) a pele que sobrejacente o xenograft é removida. Então o xenograft é agarrado com o fórceps da íris na sutura longe do ponto de origem e puxado delicadamente para cima. A partir do tornozelo, um bisturi é usado para cortar ao longo da tíbia e libertar o Xenoenxerto. A seta mostra o início da incisão ao longo da tíbia. (C) puxando o músculo gastrocnêmio ao lado, uma linha branca fraca de epimísio que separa o músculo do longo do peroneus (pl) e o gastrocnêmio (mostrado pela seta) torna-se visível. Use o bisturi para cortar ao longo desta linha para separar o PL dos outros músculos da perna. (D) o lado direito do xenograft, e o pl estão agora livres dos outros músculos na perna e estão prontos para a remoção. A linha tracejada indica onde cortar com tesouras cirúrgicas para começar a remover o xenograft e o PL. (e) após o corte abaixo da sutura longe do ponto de origem, deflexionar o xenograft para o joelho. A linha tracejada indica onde cortar com tesouras cirúrgicas para remover o xenograft e o PL do compartimento tibial. (F) o compartimento tibial vazio com o xenograft e o pl removidos com sucesso. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

Como demonstrado por Yuanfan Zhang et al., este protocolo cirúrgico é um método direto para produzir xenoenxertos de músculo esquelético humano⁸. Xenoenxertos regenerados tornam-se espontaneamente inervado e exibem contratilidade funcional. Além, o músculo xenografados dos pacientes de FSHD recapitula mudanças na expressão de gene observadas em pacientes de FSHD⁸.

Em nossa experiência, aproximadamente 7 de 8 xenoenxertos executados dos ...

Discussão

Os xenoenxertos derivados do paciente são uma forma inovadora de modelar a doença muscular e realizar estudos pré-clínicos. O método descrito aqui para criar xenoenxertos do músculo esqueletal é rápido, direto, e reprodutível. Cirurgias unilaterais podem ser realizadas em 15 a 25 minutos, ou bilateralmente em 30 a 40 minutos. Os xenoenxertos bilaterais podem fornecer flexibilidade experimental adicional. Por exemplo, os pesquisadores podem realizar o tratamento localizado de um Xenoenxerto, com a outra esquerda ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm x 15 mm Petri dish	Fisher Scientific	FB0875712
2-Methylbutane	Fisher	O3551-4
20 mm x 30 mm micro cover glass	VWR	48393-151
Animal Weighing Scale	Kent Scientific	SCL- 1015
Antibiotic-Antimycotic Solution	Corning, Cellgro	30-004-CI
AutoClip System	F.S.T	12020-00
Castroviejo Needle Holder	F.S.T	12565-14
Chick embryo extract	Accurate	CE650TL
CM1860 UV cryostat	Leica Biosystems	CM1860UV
Coplin staining jar	Thermo Scientific	19-4
Dissection Pins	Fisher Scientific	S13976
Dry Ice - pellet	Fisher Scientific	NC9584462
Embryonic Myosin antibody	DSHB	F1.652	recommended concentration 1:10
Ethanol	Fisher Scientific	459836
Fetal Bovine Serum	GE Healthcare Life Sciences	SH30071.01
Fiber-Lite MI-150	Dolan-Jenner	Mi-150
Forceps	F.S.T	11295-20
Goat anti-mouse IgG1, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-21121	recommended concentration 1:500
Goat anti-mouse IgG2b, AlexaFluor 594	Invitrogen	A-21145	recommended concentration 1:500
Gum tragacanth	Sigma	G1128
Hams F-10 Medium	Corning	10-070-CV
Histoacryl Blue Topical Skin Adhesive	Tissue seal	TS1050044FP
Human specific lamin A/C antibody	Abcam	ab40567	recommended concentration 1:50-1:100
Human specific spectrin antibody	Leica Biosystems	NCLSPEC1	recommended concentration 1:20-1:100
Induction Chamber	VetEquip	941444
Iris Forceps	F.S.T	11066-07
Irradiated Global 2018 (Uniprim 4100 ppm)	Envigo	TD.06596	Antibiotic rodent diet to protect again respiratory infections
Isoflurane	MWI Veterinary Supply	502017
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155	surgical wipes
Mapleson E Breathing Circuit	VetEquip	921412
Methanol	Fisher Scientific	A412
Mobile Anesthesia Machine	VetEquip	901805
Mouse on Mouse Basic Kit	Vector Laboratories	BMK-2202	mouse IgG blocking reagent
Nail Polish	Electron Microscopy Sciences	72180
NAIR Hair remover lotion/oil	Fisher Scientific	NC0132811
NOD-Rag1null IL2rg null (NRG) mice	The Jackson Laboratory	007799	2 to 3 months old
O.C.T. Compound	Fisher Scientific	23-730-571
Oxygen	Airgas	OX USPEA
PBS (phosphate buffered saline) buffer	Fisher Scientific	4870500
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
ProLong™ Gold Antifade Mountant	Fisher Scientific	P10144 (no DAPI); P36935 (with DAPI)
Puralube Ophthalmic Ointment	Dechra	17033-211-38
Rimadyl (carprofen) injectable	Patterson Veterinary	10000319	surgical analgesic, administered subcutaneously at a dose of 5 mg/kg
Scalpel Blades - #11	F.S.T	10011-00
Scalpel Handle - #3	F.S.T	10003-12
Stereo Microscope	Accu-scope	3075
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
Suture, Synthetic, Non-Absorbable, 30 inches long, CV-11 needle	Covidien	VP-706-X
1ml Syringe (26 gauge, 3/8 inch needle)	BD Biosciences	329412
Trimmer	Kent Scientific	CL9990-KIT
Vannas Spring Scissors, 8.0 mm cutting edge	F.S.T	15009-08
VaporGaurd Activated Charcoal Filter	VetEquip	931401
Wound clips, 9 mm	F.S.T	12022-09