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Resumo

Tau é uma proteína neuronal presente tanto no citoplasma, onde liga microtúbulos, e no núcleo, onde exerce funções não convencionais, incluindo a modulação dos genes relacionados à doença de Alzheimer. Aqui, descrevemos um método para investigar a função do tau nuclear, excluindo quaisquer interferências provenientes de Tau citoplasmamic.

Resumo

Tau é uma proteína de ligação microtúnuo expressa nos neurônios e sua principal função conhecida está relacionada à manutenção da estabilidade citosquelética. No entanto, evidências recentes indicaram que Tau também está presente em outros compartimentos subcelulares, incluindo o núcleo onde está implicado na proteção do DNA, na transcrição do rRNA, na mobilidade de retrotransposons e na organização estrutural do Nucléolo. Recentemente, demonstramos que tau nuclear está envolvido na expressão do gene VGluT1, sugerindo um mecanismo molecular que poderia explicar o aumento patológico da liberação de glutamato nos estágios iniciais da doença de Alzheimer. Até recentemente, o envolvimento do tau nuclear na modulação da expressão de genes-alvo tem sido relativamente incerto e ambíguo devido a limitações técnicas que impediram a exclusão da contribuição de Tau citoplasmic ou o efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau. Para superar essa incerteza, desenvolvemos um método para estudar a expressão de genes-alvo especificamente modulados pela proteína tau nuclear. Nós empregamos um protocolo que acople o uso de sinais da localização e do fration subcellular, permitindo a exclusão da interferência das moléculas citoplasmômicas de Tau. Mais notavelmente, o protocolo é fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis para estudar a função nuclear de Tau em outros tipos de células e condições celulares.

Introdução

As funções da proteína Tau no núcleo têm atraído interesse significativo nos últimos anos, uma vez que tem se mostrado intimamente associada com os ácidos nucleicos1,2,3,4,5,6. Na verdade, um estudo recente em todo o genoma demonstrou que Tau liga seqüências de DNA genic e intergênicos in vivo7. Um papel na organização nucleolar foi sugerido8,9,10,11. Além disso, Tau foi proposto para se envolver na proteção do DNA contra o estresse oxidativo e hipertermiômico5,10,12,13, enquanto tau mutado tem sido associada à instabilidade cromossômica e aneuploide14,15,16.

Até agora, os desafios em estudar as funções de Tau no compartimento nuclear permaneceram quase sem solução devido às dificuldades em dissecar a contribuição específica de Tau nuclear da contribuição de Tau citoplasmic. Além disso, as funções atribuídas às moléculas tau no compartimento nuclear, até agora, são apenas correlativas porque não têm uma demonstração inequívoca do envolvimento direto das proteínas nucleares Tau. De fato, o envolvimento de Tau na mobilidade de retrotransposons ou na transcrição rRNA ou na proteção do DNA11,12,17,18,19 também pode ser explicado pela contribuição de Tau citoplasmic ou pelo efeito de outros fatores a jusante não relacionados ao nuclear Tau.

Aqui, fornecemos um método que pode resolver este problema explorando um procedimento clássico para isolar o compartimento nuclear combinado com o uso de tau constrói 0N4R marcado com localização nuclear (NLS) ou sinais de exportação nuclear (NES). Esta abordagem elimina as questões complexas relacionadas com possíveis artefatos devido à repercussão das moléculas tau do compartimento citoplasmático. Além disso, as construções Tau-NLS e Tau-NES induzem o enriquecimento ou a exclusão das moléculas tau do compartimento nuclear, respectivamente, fornecendo controles positivos e negativos para o envolvimento de moléculas nucleares tau em uma função específica. O protocolo é tecnicamente fácil e é composto por métodos clássicos e confiáveis que são amplamente aplicáveis ao estudo da função nuclear de Tau em outros tipos de células, diferenciados ou não, como células cancerosas que reativam a expressão tau20,21. Além disso, pode ser aplicado também a outras proteínas que estão presentes tanto no citoplasma quanto no núcleo, a fim de dissecar funções biológicas relacionadas a diferentes compartimentos.

Protocolo

1. Cultura celular

  1. Células Cultura SH-SY5Y (linha de células neuroblastoma humanas, CRL-2266) em meio completo (o meio modificado eagle de Dulbecco:mistura de nutrientes F12 [DMEM/F-12] complementada com 10% de soro bovino fetal [FBS], 2 mM L-glutamina, 100 U/mL penicilina e 100 μg/mL estreptomicina). Manter as células em uma incubadora a 37 °C e 5% CO2. Crescer as células em placas de 10 cm e dividir quando confluent.

2. Diferenciação celular

  1. Para diferenciar as células SH-SY5Y, no dia seguinte ao revestimento, adicione 10 μM ácido retinóico (AR) para completar o meio por 5 dias.
  2. O sexto dia substitui médio por meio de diferenciação: DMEM/F-12 complementado com 50 ng/mL BDNF, 2 mM L-glutamina. Não adicione FBS ou antibióticos.
  3. Crescer as células em meio de diferenciação por 3 dias.

3. Chimeric Constrói Cloning

  1. Gerar Tau-NLS construir por clonagem por restrição digestão enzimática no quadro no final de 3' de Tau seqüência 0N4R (383aa) o 3xNLS (SV40NLS):5'-CCAAAAAAAAHAGAAGGTAGATCCAtCCAAAAAAGAGAAGGATCCAAAAAAAAGAAGAAGAAGAAAGGTA-3'.
    Nota: O 3xNLS no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição XhoI e BamHI no local de multiclonagem (MCS).
  2. Gere tau-nes construção por clonagem por restrição enzima digestão no quadro no final de 3' tau seqüência 0N4R (383aa) a seqüência NES: 5'-AGTGAGGCAGAACAAGCTGGAAGAGTTGGATGGGGACTCGCGTACA-3'.
    Nota: O NES no final de 3' de Tau é clonado no plasmid pCMV-Tau para expressão de mamíferos explorando os locais de restrição EcoRI e BamHI no MCS.
  3. Transforme a cepa DH5alpha E.coli com 100 ng de DNA a partir do passo 3.1 ou 3.2 e células de placa em placas LB-Agar com 100 mg/mL ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
  4. Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação durante a noite.
  5. Extraia plasmid com um miniprep do ADN(tabela dos materiais)e seqüência para verificar as construções.
  6. Transforme a cepa DH5alpha E. coli com a sequência de construções e células de placa verificadas em placas LB-Agar com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
  7. Escolha uma única colônia e spike as células em 5 mL de LB com ampicilina. Deixe as células crescerem a 37 °C em agitação por 2 h.
  8. Coloque as células do passo 3.7 em 200 mL de LB com ampicilina. Deixe crescer durante a noite a 37 °C.
  9. Pelotas as células a 3.500 x g por 10 min a 4 °C.
  10. Extrato plasmídeo com um dna maxiprep (Tabela de Materiais).

4. Transfecção celular

  1. Sementes 400.000 células do passo 1.1 em placas de 6 poços ou 20.000 células em lâminas de câmara de 8 poços. Amostras da placa quatro: células de controle a serem transpartidas com um vetor vazio, células a serem transpartidas com Tau não escaloado, células a serem transpartidas com Tau-NLS e células a serem transpartidas com Tau-NES.
  2. No dia seguinte à semeadura transfect 400 ng de DNA para cada poço usando os lipídios cationic(Tabela de Materiais)em placas de 6 poços ou 200 ng de DNA para cada poço para slides de câmara de 8 poços, de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Incubar o DNA e os lipídios cationic separadamente em 250 μL (para placas de 6 poços) ou 25 μL (para slides de câmara de 8 poços) de médio sérico reduzido para 5 min em RT. Em seguida, combiná-los para gerar o complexo dna-lipídios e incubar por 20 min.
    2. Substitua o meio de cultura por 2 mL (para placas de 6 poços) ou 250 μL (para slides de câmara de 8 poços) de meio de cultura completa fresco. Adicione o complexo dna-lipídio s as células e incubar a 37 °C durante a noite.
  3. Alternativamente, dna transfect com o reagente cationic polietiletilimina (PEI).
    1. Misture 2 μg de DNA e 6 μL de PEI com 200 μL de meio de cultura completa (para cada poço em placas de 6 poços), ou 1 μg de DNA e 3 μL de PEI com 100 μL de meio de cultura completa (para cada poço em slides de câmara de 8 poços) , vórtice e incubação de 10 min em RT.
    2. Adicione a mistura às células e adicione 1,8 mL de meio de cultura completa por poço em placas de 6 poços ou 150 μL de meio de cultura completa por poço em lâminas de câmara de 8 poços para alcançar o volume de revestimento.
  4. Mude o meio no dia seguinte à transfecção e adicione os meios de diferenciação, conforme descrito na etapa 2.2.

5. Imunofluorescência

  1. Retire o meio de cultura e lave as células com 1x PBS. Corrija células com 100% de gelo frio metanol para 3 min sem tremer. Retire a solução de fixação e lave brevemente com 1x PBS.
  2. Permeabilize com 0,1% surfactante não-iônico em 1x PBS por 5 min à temperatura ambiente (RT). Resumidamente, lave com 1x PBS, 3 vezes.
  3. Incubar células com tampão de bloqueio (0,1% Tween 20 e 1% BSA em PBS) por 30 min em RT em um agitador orbital.
  4. Incubado com anticorpos primários apropriados (por exemplo, anticorpo monoclonal monoclonal anti-Tau13) diluído 1:500 no bloqueio tampão durante a noite em 4 °C em um agitador orbital. Retire a solução de anticorpos e lave, brevemente, com 1x PBS.
  5. Incubado com anticorpos secundários conjugados ao fluorophore (por exemplo, anticorpos anti-rato de cabra conjugados a Alexa Fluor 633) diluído 1:500 no tampão de bloqueio por 1 h em RT. Remover a solução de anticorpos e lavar brevemente com 1x PBS 3 vezes.
  6. Para manchar núcleos, incubar com DAPI diluído 1:20,000 em bloqueio tampão por 10 min em RT. Wash com 1x PBS 3 vezes. Monte coverslips em um slide usando antifade montagem médio.

6. Blot ocidental

  1. Para coletar a pelota da pilha da etapa 4.4, remova o meio, e lave pilhas com PBS. Incubar com 500 μL de 0,1% de trippsina por 4 min a 37 °C. Adicione um volume igual de células médias completas e resuspende.
  2. Coletar células em um tubo e centrífuga a 500 x g por 5 min. No final da centrifugação remover cuidadosamente o supernatant. Adicione 1 mL de PBS, centrífuga a 500 x g por 5 min e retire cuidadosamente o supernatant. Armazenar pelotas de células no gelo para uso imediato ou congelar a -80 °C para armazenamento a longo prazo.
  3. Para extratos totais de proteína, incubar a pelota de células por 30 min no gelo em lupa (20 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 10% glicerol, 1% octylphenoxy poli (etilenoxia) etanol, ramificado(Tabela de Materiais), 10 mM EDTA) complementado com inibidores protease e phosphatase. De acordo com a abundância da pelota, use 50 μL a 100 μL de tampão de lyse.
    1. Centrífuga o extrato a 16.000 x g por 15 min. Recolher o supernatant e quantificar a concentração de proteína por qualquer ensaio quantificação padrão. Prepare as amostras de proteína para o SDS-PAGE misturando 20 μg de proteínas com 5 μL de 4x Laemmli buffer em um volume total de 20 μL e ferver a 100 °C por 5 min.
      Nota: A amostra pode ser armazenada a -20°C.
  4. Para fracionamentos subcelulares, resuspenda as células do passo 6.2 em meio completo e coleta 1 x 106 células por cada amostra. Centrífuga a 500 x g por 10 min para obter pelotas celulares para as seguintes etapas.
    1. Para isolar compartimentos subcelulares, fracionado de acordo com as especificações do kit. Para isolar cada fração, incubar a pelota celular do passo 6.4 com o amortecedor correspondente, centrífuga, recolher o supernatant e adicionar o próximo buffer para a pelota, conforme descrito em 6,4.1.1-6.4.1.5. Adicione em ordem o amortecedor de extração citoplasmática, o amortecedor de extração de membrana, o amortecedor de extração nuclear, o amortecedor de extração nuclear complementado com 5 mM CaCl2 e 3 U/μL microcococtal nuclease e tampão de extração citoesquelética.
      Nota: Todos os buffers devem ser complementados com inibidores da protease. Escala de volumes tampão de acordo com o volume da pelota celular.
      1. Para isolar a fração citossólica, as pelotas de células incubadas em 100 μL de tampão de extração citoplasmática gelada complementada com inibidores protease a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 500 x g a 4 °C por 5 min e transferem o supernatant para tubos pré-refrigerados.
      2. Adicione 100 μL de tampão de extração de membrana gelada complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.1, e incubar a 4 °C com mistura suave por 10 min. Centrífuga a 3.000 x g a 4 °C por 5 min e coletar o supernatant.
      3. Para a fração nuclear solúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.2 e vórtice. Incubar a 4 °C por 30 min, centrífuga a 5.000 x g a 4 °C por 5 min, e recolher o supernatant.
      4. Para a fração nuclear insolúvel, adicione 50 μL de buffer de extração nuclear complementado com inibidores da protease, CaCl2 e nuclease microcócica à pelota do passo 6.4.1.3 e vórtice. Incubar a 37 °C para 5 min, e depois vórtice novamente. Centrífuga a 16.000 x g em RT por 5 min e recolher o supernatant.
      5. Para a fração citoesquelética, adicione 50 μL de tampão de extração citoesquelética complementado com inibidores da protease à pelota do passo 6.4.1.4 e vórtice. Incubar 10 min em RT. Centrífuga o tubo em 16.000 x g por 5 min, recolher o supernatant e descartar a pelota.
        Nota: Volumes de buffer de escala de acordo com o volume celular, como indicado no protocolo do kit. Consulte o protocolo do kit para mais detalhes sobre incubação e tempo de centrífuga e temperatura22,23,24,25,26,27,28,29. Alternativamente, use todos os métodos padrão30 que, usando detergentes e aumentando a força iônica e a velocidade da centrífuga, separam o citosólico, o membrana-limite, o citoskeletal e as frações nucleares. Separe a fração nuclear solúvel e a fração nuclear insolúvel explorando amortecedores padrão da extração nuclear. A amostra pode ser armazenada a -20°C.
    2. Para o SDS-PAGE, adicione 7 μL de buffer 4x Laemmli a 20 μL de frações subcelulares obtidas a partir dos passos 6,4,1,1-6,4,1,5, ferva a 100 °C por 5 min.
  5. Carregue amostras em um gel de acrilamida e realize eletroforese em uma tensão constante de 120 V. Transfira proteínas para membrana nitrocelulose a 250 mA por 90 min.
  6. Verifique a eletroforese de gel de proteína adequada e aborrecto bem sucedido incubando a membrana por 5 min na solução de coloração Ponceau. Lave a membrana em água destilada até que o fundo esteja limpo. Retire a mancha continuando a lavar com Tris soline amortecida com Tween 20 (TBST) por 10 min em uma coqueteleira.
  7. Incubar a membrana com solução de bloqueio (5% de leite em TBST) para 1 h no RT em shaker. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
  8. Hibridize a membrana com o anticorpo primário na solução de bloqueio (1% de leite no TBST) durante a noite a 4 °C. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
  9. Hibridize a membrana com o anticorpo secundário sARRh-conjugado na solução de bloqueio para 1 h no RT. Lave 3 vezes com TBST por 5 min.
  10. Detecte a banda de proteínausando chemiluminescence. Quantifique a intensidade das bandas western blot por ImageJ. Normalize a expressão proteica no produto de um gene de limpeza: histona H2B para a fração solúvel e insolúvel nuclear, GAPDH para a fração citoplasmaee e extratos totais.

Resultados

A estratégia utilizada para dissecar o impacto do tau nuclear na expressão gênica evitando a contribuição de proteínas tau citoplasmasais tem sido retratada na Figura 1. Resumidamente, as proteínas Tau marcadas com NLS ou NES são acumuladas ou excluídas do compartimento nuclear, respectivamente. O efeito funcional deste desequilíbrio é a alteração da expressão gênica medida como produto do gene VGluT1.

Discussão

Descrevemos um método para medir o impacto da proteína tau nuclear na expressão gênica. Com este protocolo, a contribuição do tau citoplasmic é fortemente limitada. Os passos críticos deste protocolo são os seguintes: a diferenciação das células neuroblastoma humana SH-SY5Y, o fracionamento subcelular e a localização da proteína Tau no compartimento nuclear.

Primeiro, como mostrado na seção de resultados representativos, a diferenciação das células SH-SY5Y, adicionando RA e...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Scuola Normale Superiore (SNS14_B_DIPRIMIO; SNS16_B_DIPRIMIO).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Alexa Fluor 633 goat anti-mouse IgGLife TechnologiesA21050IF 1:500
anti Actin AntibodyBETHYL LABORATORIEA300-485Aanti-rabbit WB 1:10,000
anti GAPDH AntibodyFitzgerald Industries International10R-G109aanti-mouse WB 1:10,000
anti H2B AntibodyAbcamab1790anti-rabbit WB 1:15,000
anti Tau-13 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-21796anti-mouse WB 1:1,000; IF 1:500
anti Tubulin alpha AntibodyThermo Fisher ScientificPA5-16891anti-mouse WB 1:5,000
anti VGluT1 AntibodySigma-AldrichAMAb91041anti-mouse WB 1:500
BCA Protein Assay KitEurocloneEMPO14500
BDNFAlomone LabsB-250
Blotting-Grade BlockerBiorad1706404Non-fat dry milk
BOVIN SERUM ALBUMINSigma-AldrichA4503-50g
cOmplete MiniRoche11836170001protease inhibitor
Criterion TGX 4-20% Stain Free, 10 wellBiorad5678093
DAPIThermo Fisher Scientific62247
DMEM/F-12GIBCO21331-020
Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low GlucoseEurocloneECM0060L
EDTASigma-Aldrich0390-100mlpH = 8, 0.5 M
Foetal Bovine SerumEurocloneEC50182L
GlycerolSigma-AldrichG5516-500ml
Goat anti-mouse IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2005WB 1:1,000
Goat anti-rabbit IgG-HPRSanta Cruz Biotechnologysc-2004WB 1:1,000
IGEPAL CA-630Sigma-AldrichI8896-50mlOctylphenoxy poly(ethyleneoxy)ethanol
Immobilon WesternMERCKWBKLS0500
Lab-Tech Chamber slide 8 well glass slidenunc177402
L-glutamineEurocloneECB3000D100X
Lipofectamine 2000 transfection reagentThermo Fisher Scientific12566014cationic lipid
MethanolSigma-Aldrich322415-6X1L
MgCl2Sigma-AldrichM8266-100G
NaClSigma-AldrichS3014-1kg
Opti-MEM reduced serum mediumGibco31985070
PEISigma-Aldrich40,872-7
Penicillin/StreptomycinThermo Fisher Scientific1514012210,000 U/mL, 100 mL
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco A)OXOIDBR0014G
PhosStopRoche4906837001phosphatase inhibitor
QIAGEN Plasmid Maxi KitQiagen12163Step 3.10
Retinoic acidSigma-AldrichR2625-100mg
Subcellular Protein Fractionation Kit for cultured cellsThermo Fisher Scientific78840
Supported Nitrocellulose membraneBiorad1620097
TC-Plate 6wellSARSTEDT833,920
TCS SP2 laser scanning confocal microscopeLeicaN/A
Triton x-100Sigma-AldrichX100-500mlNon-ionic surfactant
Trypsin-EDTAThermo Fisher Scientific154000540.50%
Tween-20Sigma-AldrichP9416-100ml
VECTASHIELD antifade mounting mediumVector LaboratoriesH-1000
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification SystemsPromegaA1330Step 3.5

Referências

  1. Padmaraju, V., Indi, S. S., Rao, K. S. J. New evidences on Tau-DNA interactions and relevance to neurodegeneration. Neurochemistry International. 57 (1), 51-57 (2010).
  2. Rady, R. M., Zinkowski, R. P., Binder, L. I. Presence of tau in isolated nuclei from human brain. Neurobiology of Aging. 16 (3), 479-486 (1995).
  3. Krylova, S. M., Musheev, M., Nutiu, R., Li, Y., Lee, G., Krylov, S. N. Tau protein binds single-stranded DNA sequence specifically - The proof obtained in vitro with non-equilibrium capillary electrophoresis of equilibrium mixtures. FEBS Letters. 579 (6), 1371-1375 (2005).
  4. Vasudevaraju, P., Guerrero, E., Hegde, M. L., Collen, T. B., Britton, G. B., Rao, K. S. New evidence on α-synuclein and Tau binding to conformation and sequence specific GC* rich DNA: Relevance to neurological disorders. Journal of Pharmacy & Bioallied Sciences. 4 (2), 112-117 (2012).
  5. Wei, Y., et al. Binding to the minor groove of the double-strand, Tau protein prevents DNA damage by peroxidation. PLoS ONE. 3 (7), (2008).
  6. Qi, H., et al. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Characterization of Interaction of Tau with DNA and Its Regulation by Phosphorylation. Biochemistry. 54 (7), 1525-1533 (2015).
  7. Benhelli-Mokrani, H., et al. Genome-wide identification of genic and intergenic neuronal DNA regions bound by Tau protein under physiological and stress conditions. Nucleic Acids Research. 1, 1-18 (2018).
  8. Sotiropoulos, I., et al. Atypical, non-standard functions of the microtubule associated Tau protein. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 91 (2017).
  9. Lu, J., Li, T., He, R. Q., Bartlett, P. F., Götz, J. Visualizing the microtubule-associated protein tau in the nucleus. Science China Life Sciences. 57 (4), 422-431 (2014).
  10. Sultan, A., et al. Nuclear Tau, a key player in neuronal DNA protection. Journal of Biological Chemistry. 286 (6), 4566-4575 (2011).
  11. Sjöberg, M. K., Shestakova, E., Mansuroglu, Z., Maccioni, R. B., Bonnefoy, E. Tau protein binds to pericentromeric DNA: a putative role for nuclear tau in nucleolar organization. Journal of cell science. 119 (10), 2025-2034 (2006).
  12. Violet, M., et al. A major role for Tau in neuronal DNA and RNA protection in vivo under physiological and hyperthermic conditions. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 1-11 (2014).
  13. Hua, Q., He, R. Q. Tau could protect DNA double helix structure. Biochimica et Biophysica Acta - Proteins and Proteomics. 1645 (2), 205-211 (2003).
  14. Rossi, G., et al. A new function of microtubule-associated protein tau: Involvement in chromosome stability. Cell Cycle. 7 (12), 1788-1794 (2008).
  15. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT gene cause chromosome instability and introduce copy number variations widely in the genome. Journal of Alzheimer's Disease. 33 (4), 969-982 (2013).
  16. Rossi, G., et al. Mutations in MAPT give rise to aneuploidy in animal models of tauopathy. neurogenetics. 15 (1), 31-40 (2014).
  17. Sun, W., Samimi, H., Gamez, M., Zare, H., Frost, B. Pathogenic tau-induced piRNA depletion promotes neuronal death through transposable element dysregulation in neurodegenerative tauopathies. Nature Neuroscience. 21 (8), 1038-1048 (2018).
  18. Guo, C., et al. Tau Activates Transposable Elements in Alzheimer's Disease. Cell Reports. 23 (10), 2874-2880 (2018).
  19. Maina, M. B., et al. The involvement of tau in nucleolar transcription and the stress response. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 70 (2018).
  20. Bonneau, C., Gurard-Levin, Z. A., Andre, F., Pusztai, L., Rouzier, R. Predictive and prognostic value of the Tau protein in breast cancer. Anticancer Research. 35 (10), 5179-5184 (2015).
  21. Vanier, M. T., Neuville, P., Michalik, L., Launay, J. F. Expression of specific tau exons in normal and tumoral pancreatic acinar cells. Journal of Cell Science. 111 (1), 1419-1432 (1998).
  22. Liao, A., et al. Therapeutic efficacy of FTY720 in a rat model of NK-cell leukemia. Blood. 118 (10), 2793-2800 (2011).
  23. Cascio, S., Zhang, L., Finn, O. J. MUC1 protein expression in tumor cells regulates transcription of proinflammatory cytokines by forming a complex with nuclear factor-κB p65 and binding to cytokine promoters: Importance of extracellular domain. Journal of Biological Chemistry. 286 (49), (2011).
  24. Costello, D. A., et al. Long Term Potentiation Is Impaired in Membrane Glycoprotein CD200-deficient Mice. Journal of Biological Chemistry. 286 (40), 34722-34732 (2011).
  25. Roy, G., Placzek, E., Scanlan, T. S. ApoB-100-containing lipoproteins are major carriers of 3-iodothyronamine in circulation. Journal of Biological Chemistry. 287 (3), 1790-1800 (2012).
  26. Loo, L. H., et al. Heterogeneity in the physiological states and pharmacological responses of differentiating 3T3-L1 preadipocytes. Journal of Cell Biology. 187 (3), 375-384 (2009).
  27. Draker, R., Sarcinella, E., Cheung, P. USP10 deubiquitylates the histone variant H2A.Z and both are required for androgen receptor-mediated gene activation. Nucleic Acids Research. 39 (9), 3529-3542 (2011).
  28. Richard, D. J., et al. HSSB1 rapidly binds at the sites of DNA double-strand breaks and is required for the efficient recruitment of the MRN complex. Nucleic Acids Research. 39 (5), 1692-1702 (2011).
  29. Roger, L., Jullien, L., Gire, V., Roux, P. Gain of oncogenic function of p53 mutants regulates E-cadherin expression uncoupled from cell invasion in colon cancer cells. Journal of Cell Science. 123 (8), (2010).
  30. ten Have, S., Hodge, K., Lamond, A. I. Dynamic Proteomics: Methodologies and Analysis. Functional Genomics. , (2012).
  31. Siano, G., et al. Tau Modulates VGluT1 Expression. Journal of Molecular Biology. 431 (4), 873-884 (2019).
  32. Serdar, B. S., Koçtürk, S., Akan, P., Erkmen, T., Ergür, B. U. Which Medium and Ingredients Provide Better Morphological Differentiation of SH-SY5Y Cells?. Proceedings. 2 (25), 1577 (2018).
  33. Forster, J. I., et al. Characterization of differentiated SH-SY5Y as neuronal screening model reveals increased oxidative vulnerability. Journal of Biomolecular Screening. 21 (5), 496-509 (2016).
  34. Dwane, S., Durack, E., Kiely, P. A. Optimising parameters for the differentiation of SH-SY5Y cells to study cell adhesion and cell migration. BMC Research Notes. 6 (1), 1 (2013).
  35. Encinas, M., et al. Sequential Treatment of SH-SY5Y Cells with Retinoic Acid and Brain-Derived Neurotrophic Factor Gives Rise to Fully Differentiated, Neurotrophic Factor-Dependent, Human Neuron-Like Cells. Journal of Neurochemistry. 75 (3), 991-1003 (2002).

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