Um método para estudar a formação de novo dos domínios da cromatina

Resumo

Este método é projetado para seguir a formação de domínios de cromatina mediada por PRC2 em linhas celulares, e o método pode ser adaptado para muitos outros sistemas.

Resumo

A organização e a estrutura dos domínios da cromatina são exclusivas para linhagens de células individuais. Sua desregulação pode levar a uma perda na identidade celular e/ou doença. Apesar dos esforços enormes, nosso entendimento da formação e propagação dos domínios da cromatina ainda é limitado. Os domínios da cromatina foram estudados em condições de estado estacionário, o que não é propício para seguir os acontecimentos iniciais durante o seu estabelecimento. Aqui, apresentamos um método para reconstruir os domínios da cromatina inducivelmente e seguir sua re-formação em função do tempo. Embora, aplicado primeiramente ao exemplo da formação repressivas PRC2-negociada do domínio da cromatina, poderia facilmente ser adaptado a outros domínios do cromatina. A modificação e/ou a combinação deste método com a genômica e as tecnologias de imagem fornecerá ferramentas inestimáveis para estudar o estabelecimento de domínios de cromatina em grande detalhe. Acreditamos que esse método irá revolucionar nossa compreensão de como os domínios da cromatina se formam e interagem uns com os outros.

Introdução

Os genomas eucarióticos são altamente organizados e as mudanças na acessibilidade da cromatina controla diretamente a transcrição do gene¹. O genoma contém tipos distintos de domínios de cromatina, que se correlacionam com a atividade transcricional e o tempo de replicação^2,3. Estes domínios da cromatina variam no tamanho de alguns kilobases (KB) a mais de 100 KB e são caracterizados por um enriquecimento em modificações distintas do histona⁴. As questões centrais são: como esses domínios são formados e como eles são propagados?

Um dos domínios mais bem caracterizados da cromatina é promovido através da atividade do complexo repressivo Polycomb 2 (PRC2). PRC2 é um complexo de múltiplas subunidades composto por um subconjunto do grupo polycomb (PcG) de proteínas^{5,6, e}catalisa a mono-, di-e trimetilação de lisina 27 de histona H3 (H3K27me1/ME2/ME3)^{7,8, 9,10}. H3K27me2/ME3 estão associados a um Estado repressivo da cromatina, mas a função de H3K27me1 é obscura^6,11. Um dos componentes centrais do PRC2, o desenvolvimento embrionário do ectoderma (EED), liga-se ao produto final da catálise PRC2, H3K27me3, através de sua gaiola aromática e esta característica resulta na estimulação alosterica de PRC2^12,13. A atividade enzimática PRC2 é crucial para preservar a identidade celular durante o desenvolvimento como a expressão inadequada de certos genes de desenvolvimento que são contraindicados para uma linhagem específica, seria prejudicial^5,6 . Assim, desvendar os mecanismos pelos quais o PRC2 promove a formação de domínios de cromatina repressiva em mamíferos é de fundamental importância para a compreensão da identidade celular.

Todos os sistemas experimentais passados projetados investigar a formação do domínio da cromatina que inclui domínios PRC2-negociados da cromatina, foram executados condições de estado estacionário, que são incapazes de seguir os eventos de desdobramento da formação do domínio da cromatina em Células. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado para gerar um sistema celular induzível que monitora o recrutamento inicial e a propagação de domínios de cromatina. Especificamente, nós nos concentramos em rastrear a formação de domínios de cromatina repressiva mediada por PRC2 que compõem H3K27me2/3. Esse sistema que pode captar os detalhes mecanísticos da formação do domínio da cromatina, pode ser adaptado para incorporar outros domínios da cromatina, como os domínios amplamente estudados, compreendendo H2AK119ub ou H3K9me. Em combinação com a genômica e as tecnologias de imagem, essa abordagem tem o potencial de abordar com sucesso várias questões-chave na biologia da cromatina.

Protocolo

Geração de mESCs induzível do salvamento de eed

1. cultura celular

1. Use pilhas de haste embrionárias do rato C57BL/6 livre de alimentador (mESCs) que possuem um transgene CreERT2 estàvel integrado, que possa translocate ao núcleo em cima da administração de 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)¹³.
2. Cresça os mESCs no meio ESC convencional^14,15, suplementado com 1000 U/ml LIF, inibidor de 1 μm Erk PD0325901 e 3 μm GSK3 inibidor CHIR99021. Para o meio ESC convencional, use DMEM Knockout contendo 15% de soro bovino fetal (FBS), 2 mM L-glutamina, 1X penicilina/estreptomicina e 0,1 mM 2-Mercaptoetanol.
3. Use placas revestidas com 0,1% de solução de gelatina para cultivo de mESCs.

2. geração de clonal EED Knockout (KO) mESCs

1. Guia de design RNAs (gRNAs) para excluir exon 10 e exon 11 de cópia endógena de EED em mESCs usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling¹⁶. EED-KO-gRNA-1 atinge o intron imediatamente a montante do exon 10 e EED-KO-gRNA-2 atinge o intron imediatamente a jusante de exon 11. A aplicação simultânea destes gRNAs exclui o exon 10 e o exon 11 pela junção de extremidade não-homologous (NHEJ).
2. Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 2013¹⁷.
3. Num formato de placa de 6 poços, transfecção 2 x 10⁵ mESCs com 1 mg de cada eed-ko-grna-1 e eed-ko-grna-2 (ver tabela de materiais) utilizando o reagente de transfecção seguindo as instruções do fabricante. Mude a mídia 24 h após a transfecção.
4. Dois dias após o transfection, isolam pilhas positivas de GFP usando a classificação fluorescência-ativada da pilha (FACS). Espere que a eficiência do transfection varie em torno de 10-30%. Classifique em torno de 5 x 10⁵ células para capturar suficiente GFP células positivas para o chapeamento.
5. Placa os isolados GFP positivo mESCs em 15 placas do cm pre-Coated com gelatina 0,1% (10-20 X10³ pilhas por a placa) para a colheita da colônia.
6. Cresça as pilhas no meio do ESC por aproximadamente uma semana até que as únicas colônias sejam visíveis. Mude a mídia a cada 2 dias.
7. Escolha um mínimo de 48 colônias usando 20 μL de ponta de micropipeta. Raspe sobre a colônia ao aspirar na ponta da micropipeta. Não quebre a colônia em células simples. Transfira a colônia para uma placa de poço contendo accutase (20 mL) 96.
8. Incubar as colônias por 10 min a 37 ° c até que todas as células sejam dissociadas.
9. Adicione 200 mL de mídia ESC em cada poço usando pipeta multicanal.
10. Misture bem e placa as células em duas placas separadas 96 bem usando pipeta multicanal.
11. Use uma das placas de 96 poços para genotipagem e manter o outro crescendo até que a genotipagem seja concluída. Use a solução de extração de DNA para extrair o DNA da placa de 96 poços seguindo as instruções do fabricante.
12. Use os primers de genotipagem Gnt_EED-ko-up e Gnt_EED-KO_down, que abrangem o site excluído e executam a genotipagem PCR com Taq DNA polymerase seguindo as instruções do fabricante.
    Nota: outros tipos de DNA polymerases também podem ser usados para genotipagem, no entanto, Taq DNA polimerase oferece conveniência como a reação de PCR pode ser diretamente carregada em um gel quando seu buffer de reação colorida é usado.
    1. Observar um produto de DNA de menor peso molecular em células com um apagamento homozygous relativo ao Wild-Type (WT) caso.
       Nota: para gerar PRC2 células nulas, a deleção homozygous de exons 10 e 11 é necessária para destabilizar e degradar EED, uma subunidade essencial do núcleo PRC2¹³. A eficiência de segmentação CRISPR é de cerca de 10%.
13. Valide a supressão do exon 10 e 11 de EED e da perda de proteína de EED pelo sequenciamento de Sanger e pela mancha ocidental, respectivamente.
14. Confirme a depleção de EED e H3K27me2/ME3 de cromatina em células EED KO por ChIP-Seq usando anticorpos contra H3K27me2/ME3 e EED. Use o protocolo dado em Oksuz et al., 2017¹⁵ para experimentos com chip-Seq.

3. Engenharia de eed Knockout mESCs para abrigar CRE-ERT2 based induzível eed expressão

1. Design gRNA (EED-gRNA-inducible) para introduzir um corte dentro do intron seguinte exon 9 de EED usando a ferramenta de design CRISPR em Benchling¹⁶ (ver tabela de materiais).
2. Clone gRNAs em pSpCas9 (BB)-2A-GFP (PX458) usando instruções em Ran et al., 2013¹⁷.
3. Projete um ADN modelo doador que compreenda a seqüência do cDNA do EED após o exon 9 e uma etiqueta do C-terminal Flag-HA a montante de uma seqüência do T2A-GFP, tudo na orientação reversa com respeito à seqüência endógena do gene.
   1. Flanqueando a gaveta com um Splice-Acceptor e uma sequência de poliadenilação aninhada entre os locais de loxP invertidos heterólogos (lox66 e lox71)¹⁸.
   2. Inclua pelo menos 500 BP de braços de homologia de cada extremidade. Divida o molde do doador em 2 segmentos de fragmentos do gene de gBlocks (veja gBlock-1, gBlock-2-WT "https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI" e gBlock-2-Cage-Mutant "https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM") e monte-os em Vetor de PCR Blunt usando a clonagem de Gibson seguindo as instruções do fabricante.
      Nota: gblock-2 contém um resíduo aromático (Y365) dentro da gaiola de EED que é importante para a interação com H3K27me3¹². gBlock-2-WT contém resíduo tipo selvagem, enquanto gblock-2-Cage-Mutant contém a gaiola-mutante de EED (Y365A), incapaz de ligar a H3K27me3. Induzível WT eed resgate é denotado como i-WT-r e induzível gaiola-mutante eed resgate é denotado como i-MT-r para a conveniência.
4. Em um formato da placa de 6 poços, transfecção 2 x 10⁵ mESCs com 1 magnésio do grna (eed-grna-inducible) e 1 magnésio dos moldes do doador (i-WT-r ou i-MT-r) usando o reagente do transfection e isole pilhas positivas do GFP usando FACS.
5. Siga as etapas 2.3-2.11 para isolar colônias individuais prontas para genotipagem para direcionamento bem-sucedido.
6. Use os primers de genotipagem Inducible_Genotype-FW-1 e Inducible_Genotype-Rev-1, que abrangem a gaveta inserida e executam a PCR genotipagem usando Taq DNA polymerase.
   Nota: a eficiência de segmentação para CRISPR é de cerca de 10%.
   1. Confirme a integração correta da gaveta pelo PCR usando os primers Inducible_Genotype-FW-2 e Inducible_Genotype-Rev-2 , que são fora dos braços da homologia.
      Nota: a integração homozygous da gaveta é necessária para realizar o salvamento eficiente de EED. Anote que as pilhas com integração homozygous produzirão um único produto grande do ADN em comparação ao WT EED, que produzirá um produto curto.
7. Confirme a integração do cassette pelo sequenciamento de Sanger.
8. Confirme a inversão da gaveta e a expressão de EED e outros componentes do núcleo PRC2 (por exemplo, EZH2 e SUZ12) em cima da administração 4-OHT pelo western blotting.
9. Confirme a expressão de T2A-GFP e percentual de flip por citometria de fluxo. Observe que a expressão de GFP é indicativa de inversão da gaveta e a expressão de EED.

4. após a nucleação e disseminação da atividade PRC2 na cromatina

1. Confirme que os mESCs i-WT-r e i-MT-r não têm expressão com vazamento de GFP por citometria de fluxo. No caso de expressão com vazamento de GFP, isole células GFP-negativas por FACS antes de iniciar o experimento.
2. Expanda os mESCs i-WT-r e i-MT-r em placas de 5 15 cm (5x 10⁶ células por placa).
3. Induzir a expressão de WT ou Cage-Mutant EED pela administração de 0,5 mM 4-OHT para 0 h, 12 h, 24 h, 36 h e 8 dias (placa de 1 15 cm por condição). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h. isolar as células recombinadas com êxito por FACS usando GFP. Ajuste o tempo dos tratamentos de forma que todas as condições sejam coletadas de uma só vez.
4. Executar ChIP-Seq para H3K27me2, H3K27me3 para investigar o seu depósito temporal para cromatina em resposta à re-expressão de WT ou Cage-Mutant EED. Use o protocolo ChIP-Seq, incluindo a preparação da biblioteca detalhada em Oksuz et al., 2017¹⁵.
5. Use o controle de pico em cada amostra para permitir a comparação quantitativa entre os diferentes pontos temporais¹⁹.
   1. Para o controle de espiga, use a cromatina da Drosophila melanogaster (em uma proporção de 1:50 para a cromatina derivada de mesc), bem como o anticorpo H2Av específico de Drosophila (1 μL de anticorpo H2Av por 4 μg de cromatina de Drosophila de acordo com instruções do fabricante) em cada amostra.
   2. Prepare a cromatina da Drosophila de forma semelhante à dos mESCs usando o protocolo detalhado em Oksuz et al., 2017¹⁵.
6. Mapeie a seqüência de leituras para ChIP-Seq para mm10 genoma com bowtie 2 usando parâmetros padrão²⁰.
7. Normalize o mouse ChIP-Seq lê para Spike-em Drosophila ler contagens²¹. Calcule o fator de normalização de Spike-in usando a seguinte fórmula: 1 x 10⁶/Unique Drosophila ler contagens. Esperar para obter cerca de 1 x 10⁶Drosophila ler contagens e 20 x 10⁶ mouse ler contagens por experimento.
   1. Não inclua a cromatina da Drosophila ao sequenciamento das amostras de entrada.
8. Use genomecov ferramenta de bedtools para converter arquivo Bam em bedgraph²². Em seguida, converta o bedgraph no arquivo Bigwig usando a ferramenta bedgraphtobigwig de USCS^23,24. Consulte o seguinte script:
   Gen = "caminho para o genoma mm10"
   Chr = "trajeto aos tamanhos do cromossoma mm10"
   inp_bam = "caminho para o arquivo Bam de entrada"
   Multiply = "calcula o fator de normalização de Spike-in"
   bedtools genomecov-BG-Scale $multiply-IBAM $inp _ Bam-g $gen > Output. bedGraph
   classificar-K1, 1-K2, 2n output. bedGraph > output_sorted. bedGraph
   Método bedGraphToBigWig output_sorted. bedGraph $chr output.bw
9. Visualize as densidades de leitura do ChIP-Seq carregando os arquivos Bigwig no navegador do genoma USCS²⁴.

5. monitoramento da emergência e crescimento dos focos H3K27me3 nos núcleos do mESCs

1. Placa 1x 10⁴ mESCs em corrediças de câmara de 8 poços pré-revestidas com 0,1% de gelatina.
2. No dia seguinte, começar a realizar 4-OHT consecutivos (0,5 mM) induções para recolher as células expressando EED para pontos de tempo indicados (0 h, 12 h, 24 h e 36 h). Mude a mídia após 12 h para tratamentos com mais de 12 h.
3. Fixar os mESCs com paraformaldeído a 4% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) à temperatura ambiente (RT) por 10 min.
4. Permeabilize as células com PBS/0,25% Triton X-100 em RT por 30 min.
5. Bloqueie as células com PBS/5% de burro sérico/0,1% Triton X-100 (buffer de bloqueio) em RT por 30 min.
6. Diluir H3K27me3 anticorpo primário 1:500 no buffer de bloqueio e adicionar sobre as células.
7. Incubar as células com anticorpo primário durante a noite a 4 ° c.
8. No dia seguinte, realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.
9. Diluir o anticorpo secundário (Alexa fluor 595) 1:1000 no buffer de bloqueio e adicionar às células.
   1. Realize todas as incubações no escuro nos seguintes passos como anticorpos secundários conjugados com Alexa fluor são sensíveis à luz.
10. Incubar o anticorpo secundário durante 2 h na RT.
11. Realize 3 lavas com PBS/0,1% Triton X-100.
12. Diluir DAPI (1 mg/mL) 1:4000 com PBS/0,1% Triton X-100 e adicionar às células.
13. Incubar as células com DAPI por 10 min em RT.
14. Monte as células com o Aqua Mount.
15. Imagem das células com microscopia confocal na ampliação de 63X.
16. Processar e pseudocolorir as imagens usando uma distribuição de ImageJ, Fiji²⁵.

Resultados

Um esquema geral do sistema de resgate condicional
Figura 1 mostra o esquema de segmentação para resgatar condicionalmente células eed ko com WT ou Cage-Mutant (Y365A) eed que é expressa a partir do locus eed endógeno. Depois de bater para fora EED, uma subunidade de núcleo de PRC2 que é essencial para sua estabilidade e atividade enzimática, uma gaveta dentro do intron que segue o exon 9 de EED é introduzida (Figura 1). A gaveta con...

Discussão

Uma abordagem poderosa para entender os detalhes mecanísticos durante a formação de um determinado domínio da cromatina, é primeiro interromper o domínio e, em seguida, rastrear sua reconstrução em andamento dentro das células. O processo pode ser pausado a qualquer momento durante a reconstrução para analisar detalhadamente os eventos em andamento. Estudos prévios sobre os domínios da cromatina não conseguiram resolver tais eventos, pois foram realizados em condições de estado estacionário (por exemplo,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(Z)-4-Hydroxytamoxifen (5 mg)	Sigma	H7904-5MG	For induction of EED expression
16% Paraformaldehyde aqueous solution (10x10 ml)	Electron Microscopy Sciences	15710	For immunofluorescence
2-mercaptoethanol	LifeTechnologies	21985-023	For mESCs culture
2% Gelatin Solution	Sigma	G1393-100ml	For mESCs culture
Accutase 500 ML	Innovative Cell Tech/FISHER	AT 104-500	For mESCs culture
Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresaerch	711-585-152	For immunofluorescence
Aqua-Mount Mounting Medium	FISHER/VWR	41799-008	For immunofluorescence
CHAMBER SLD TC PRMA 8-CHM 16 PK	Fisher Sci	177445PK	For immunofluorescence
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) - 10 mg	Life Tech	D1306	For immunofluorescence
ERK inhibitor, PD0325901	Stemgent	04-0006	For mESCs culture
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein	Millipore/Fisher	ESG1107	For mESCs culture
FBS Stem Cell Qualified	Atlanta	S10250	For mESCs culture
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L	For Donor template cloning
GSK3 inhibitor, CHIR99021	Stemgent	04-0004	For mESCs culture
H3K27me2 (D18C8) rabbit mAB	Cell Signaling	9728S	Antibody for ChIP-seq
H3K27me3	Cell Signaling	9733S	Antibody for ChIP-seq
Histone H2Av antibody (pAb)	Active motif	39715	Spike-in control for ChIP-seq
Knockout DMEM	Invitrogen	10829-018	For mESCs culture
L-glutamine	Sigma	G7513	For mESCs culture
Lipofectamine 2000	LifeTech	11668019	For transfection
MangoTaq DNA Polymerase	Bioline	BIO-21079	For Genotyping PCR
Normal donkey serum (10 mL)	Jackson ImmunoResearch	017-000-121	For immunofluorescence
Penicillin-Streptomycin	Sigma/Roche	P0781	For mESCs culture
pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458)	Addgene	48138	For gRNA cloning
QuickExtract DNA Extraction Solution	Lucigen	QE0905T	For Genotyping PCR
Triton X-100	Sigma	T8787-250ML
Zero Blunt PCR Cloning Kit	Thermo Fisher	K270020	For Donor template cloning
Primers/gBlocks
EED-KO-gRNA-1			Sequence: ctctggctactgtcaactag. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-KO-gRNA-2			Sequence: TAGGCTATGACGCAGCTCAG. gRNAs pairs to knockout EED in C57BL/6 ESCs for i-WT-r and i-MT-r systems.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-WT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-l2LLlWNEnLrfGXcbdCxI. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
EED-gRNA-inducible			Sequence: atggcaccccgaaattagaa. gRNA and Donor to generate i-WT-r system in the EED-KO background.
i-MT-r Donor			https://benchling.com/s/seq-n8eiZCB2XAkOuzzpv6qM. gRNA and Donor to generate i-MT-r system in the EED-KO background.
Genotyping Primers
Gnt-EED-KO-FW-1			Sequence: ctgtaggctgccatctgtga. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Gnt-EED-KO-REV-1			Sequence: agccagggctacacagagaa. Wild type allele will produce a product of 1.9 kb. Knockout allele will produce a product of 200 bp.
Inducible_Genotype-FW-1			Sequence: tgcagtgaaacaaatttggaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-REV-1			Sequence: gagaggggtggcactgtaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 1863 bp. The wild type allele will produce a product of ~200 bp.
Inducible_Genotype-FW-2			Sequence: ccccctctttctccttttct. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.
Inducible_Genotype-REV-2			Sequence: atgcctgggtgaatgaaaaa. When the casette is inserted, the primers will produce 3200 bp. The wild type allele will produce a product of 1560 bp.