Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Resumo

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Resumo

As proteínas geralmente exercem funções biológicas através de interações com outras proteínas, seja em conjuntos proteicos dinâmicos ou como parte de complexos formados de forma estável. O último pode elegantemente ser resolvido de acordo com o tamanho molecular usando a electroforese nativa do gel do poliacrilamida (BN-página). O acoplamento de tais separações à espectrometria maciça sensível (BN-MS) foi estabelecido bem e permite teoricamente a avaliação exaustiva do complexome extraível em amostras biológicas. No entanto, esta abordagem é bastante trabalhosa e fornece resolução de tamanho complexo limitado e sensibilidade. Além disso, sua aplicação permaneceu restrita a abundantes proteínas mitocondrial e plastid. Assim, para a maioria das proteínas, ainda faltam informações sobre a integração em complexos proteicos estáveis. Aqui apresentamos uma abordagem otimizada para o perfilamento complexome compreendendo separação de BN-PAGE em escala preparativa, amostragem de submilímetro de largas faixas de gel por corte de cryomicrotome e análise espectrométrica de massa com quantificação de proteínas sem rótulo. Os procedimentos e ferramentas para etapas críticas são descritos detalhadamente. Como uma aplicação, o relatório descreve a análise complexome de uma fração solubilizado endosome-enriquecida da membrana dos rins do rato, com as 2.545 proteínas perfiladas no total. Os resultados demonstram a identificação de proteínas uniformes, da membrana da baixo-abundância tais como os canais de íon intracelular assim como os testes padrões de alta resolução, complexos da montagem da proteína, incluindo isoforms do glicosilação. Os resultados estão de acordo com análises bioquímicas independentes. Em síntese, esta metodologia permite a identificação abrangente e imparcial de complexos proteicos (super) e sua composição de subunidades, proporcionando uma base para investigar a dinâmica de estequiometria, montagem e interação de complexos proteicos em qualquer sistema biológico.

Introdução

A separação BN-PAGE foi primeiramente acoplada diretamente à análise de LC-MS (BN-MS) pelos grupos de pesquisa de Majeran¹ e Wessels² usando o fatiamento manual de pistas do gel da BN-página. Suas análises identificaram um número abundante de complexos proteicos da membrana com composição conhecida do subunidade dos plastídios da planta e das mitocôndria da pilha de HEK, respectivamente. No entanto, essas análises estavam longe de ser abrangentes e não permitiriam a identificação imparcial de novos conjuntos. O desempenho dos espectrómetros de massa e dos métodos de quantificação sem rótulo melhorou consideravelmente desde então, o que permitiu análises abrangentes de BN-MS. Isto cunhou o termo "perfilamento complexome". Por exemplo, Heide e colegas de trabalho analisaram as mitocôndrias do coração de rato identificando e aglomerando 464 proteínas mitocondrial, confirmando assim muitas montagens conhecidas. Além, encontraram TMEM126B para ser um subunidade novo e crucial de um complexo específico³do conjunto. Os resultados comparáveis (com 437 perfis mitochondrial da proteína) foram obtidos em um estudo paralelo de mitocôndria da pilha de HEK⁴.

Apesar dessas melhorias, várias questões permaneceram que restringem o pleno potencial da BN-MS para o perfilamento complexome. Uma grande limitação é a resolução efetiva de tamanho de complexos que é determinado por dois fatores: a (i) qualidade da separação BN-PAGE, que depende da uniformidade do gradiente de poros da matriz de gel, bem como da estabilidade/solubilidade dos complexos amostrais, e (II) tamanho da etapa da amostragem do gel, que é no melhor 1 milímetro ao usar a fatiagem manual convencional^5,6. A baixa resolução de tamanho não só perde as isoformas complexas sutis e heterogeneidades, mas também impacta negativamente a amplitude dinâmica e a confiança da atribuição e quantificação de subunidades de novo e imparcialidade.

Outros desafios incluem a precisão da quantificação de proteínas e a cobertura da faixa dinâmica real de abundâncias protéicas na amostra por espectrometria de massas. Portanto, a aplicação do perfil complexome de BN-MS permaneceu largamente restrita a amostras biológicas com menor complexidade, alta expressão de complexos-alvo e propriedades de solubilização favoráveis (i.e., plastids, mitocôndrias e microorganismos)^6,7,8,9,10.

Recentemente, introduzimos o cryomicrotome slicing-Assisted BN-MS (csBN-MS), que combina uma amostragem de submilímetro precisa de faixas de gel BN-PAGE com análise abrangente de MS e processamento de dados MS elaborado para determinação de perfis proteicos com alta confiança¹¹. A aplicação a uma preparação mitochondrial da membrana dos cérebros do rato demonstrou a definição complexa eficaz previamente não atendidas do tamanho e a cobertura máxima de subunidades oxidativos do complexo Chain respiratório (oxphos) (isto é, 90 de 90 MS-acessíveis). Este exemplo também identificou uma série de novos conjuntos proteicos.

Descritos aqui estão os procedimentos otimizados para a separação preparativa BN-PAGE de complexos proteicos (não restritos a uma fonte biológica específica), fundição de grandes géis preparativos de BN-PAGE, corte de cryomicrotome de vias de gel amplas e dados MS Processamento. O desempenho do perfilamento de alta resolução é demonstrado para uma preparação complexa da proteína das membranas endosome-enriquecidas do rim do rato. Finalmente, os benefícios de aumentar a definição e a precisão da quantificação espectrométrica maciça são discutidos.

Protocolo

1. preparative BN-PAGE

1. Preparação do gel
   1. Use um sistema vertical do electroforese do gel do médio-à-grande formato (distância da separação do gel de > 10 cm; 14 cm x 11 cm, espaçador de 1,5 milímetros) com refrigerar eficaz ajustado a 10 ° c.
   2. Cast linear ou hiperbólico poros gradiente gel (1.5-3.0 mm espaçadores) usando um agitador de duas câmaras gradiente misturador impulsionado por uma bomba (ver tabela de materiais e reagentes). No exemplo apresentado (linear gradiente gel 1%-13%):
      1. Prepare uma solução de 13 mL para a câmara frontal (mistura) constituída por: 13% acrilamida (a partir de 30% de solução de ações, 37,5:1,0 acrilamida: bisacrilamida), 0,75 M de Ácido aminocapróico, 50 mM bis-tris (pH = 7,0) e 10% de glicerol.
      2. Prepare uma solução de 10 mL para a câmara de reservatório constituída por: 1% acrilamida (a partir de 30% de solução de ações, 37,5:1,0 acrilamida: bisacrilamida), 0,75 M de Ácido aminocapróico, 50 mM bis-tris (pH = 7,0), e 0,2% CL-47 detergente.
   3. Inicie o agitador e adicione 30 microlitros de APS (peroxodisulfato de amônio, solução de estoque de 10%) e 2,5 μL de TEMED (N, n, N ', n'-tetrametil etilenodiamina) e 2,5 microlitros de TEMED à solução na câmara frontal. Inicie a bomba e abra a válvula dianteira (o fluxo deve ser ajustado para completar a fundição em 10 min). Após 1 min, adicione 90 μL de APS e 5 μL de TEMED à solução na câmara do reservatório e abra a conexão da câmara.
   4. Permita que o gel polimerize lentamente mas completamente para pelo menos 24 h na temperatura ambiente (RT) para gerar um inclinação homogêneo do tamanho de pore. Quando mantido úmido, o gel polimerizado pode ser armazenado na posição vertical a 4 ° c por até 1 semana.
      Nota: intencionalmente, a parte superior do gel terá uma consistência macia/viscoso. Isto será removido mais tarde mas permite a entrada Lisa das proteínas no gel, com risco mínimo da precipitação da proteína que pode de outra maneira conduzir aos artefatos da migração (isto é, estrias ou precipitação da proteína).
2. Preparação e carregamento da amostra
   1. Prepare os slots de carregamento inserindo espaçadores apropriados (por exemplo, tubos de silício) entre as placas de vidro para separar 0,5-2,0 mg de proteína. As ranhuras devem ser feitas pelo menos 3 cm de largura (ou melhor, 5-6 cm de largura).
   2. Solubilize ~ 2,5 mg de membrana (preparação de endosome-enriquecido com rim de rato) em 2 mL de tampão de solubilização contendo 1% (p/v) detergente não desnaturante (Complexolyte CL-47) durante 30 min no gelo. Ultracentlee Gate (corte de sedimentação = 200 S ou menos; 130.000 x g/11 min é usado aqui).
   3. Concentrar o solubilisate em um curto 50%/20% (w/v, 0,3 ml cada) gradiente passo de sacarose por ultracentlee por 1 h em 400.000 x g. O rendimento final da proteína deve ser de pelo menos 1 mg.
   4. Adicione 0, 5% (w/v) Coomassie G-250 ao solubilisate e carregue a amostra no gel. Limitar a carga proteica a uma secção transversal de 10-15 μg/mm² gel Lane para obter alta resolução e evitar artefactos resultantes da precipitação proteica.
3. Condições de execução de BN-PAGE
   1. Para a execução de buffers, prepare um tampão de cátodos padrão consistindo de 50 mM de tricina, 15 mM de bis-Tris e 0, 1% de Coomassie G-250. Prepare um tampão padrão do ânodo que consiste em 50 milímetros de bis-tris (pH = 7,0).
   2. Execute um BN-Page preparativa em 10 ° c durante a noite usando um protocolo de tensão de três etapas¹³ consistindo em: uma fase do equilíbrio por 30 minutos em 100 v, então uma rampa lenta (de 3 h) à tensão máxima (40-50 comprimento do gel de V/cm) que é mantida finalmente por pelo menos 6 h para foco do ponto final das proteínas.
      Nota: recomenda-se pausar a electroforese quando a parte dianteira da migração alcangou o meio do gel e troca o amortecedor do cátodos para o amortecedor fresco sem Coomassie G250. Isso ajuda a evitar artefatos de precipitação no gel resultante do colapso local da estrutura de poros da matriz.

2. amostragem e digestão do gel

1. Excisão de pistas de gel
   1. Após a corrida, digitalizar os géis para fins de documentação, mantendo-o entre as placas de vidro.
   2. Desmontar as chapas e extirpar a (s) secção (ões) de juros.
   3. Pegue uma tira de amostra da pista para análise por 2D BN/SDS-PAGE e coloração de proteínas ou western blotting (como mostrado na Figura 1B) para determinar regiões de interesse, resolução de tamanho complexo eficaz e abundância de proteínas.
   4. Fixar faixas de gel selecionadas duas vezes por pelo menos 30 min com 30% (v/v) etanol e 15% (v/v) de ácido acético.
   5. Transfira a amostra para o meio de incorporação e deixe-a mergulhar e equilibrar por pelo menos 2 h a 4 ° c, mantendo a laje de gel em câmara lenta em um agitador orbital.
      Nota: a separação do gel deve ser cuidadosamente inspecionada para a qualidade geral de separação e artefatos de migração. Bandas de gel representando proteínas dominantes devem ser livres de distorção e homogênea em intensidade. Artefatos locais no gel devem ser excisados ou deixados de fora da análise.
2. Incorporação e corte de cryomicrotome
   Nota: esta é uma versão melhorada do procedimento de incorporação descrita e foto-documentado previamente que permite incorporar e fatiar de faixas mais amplas do gel de até 8 cm¹¹.
   1. Primeiramente, corte faixas fixas do gel em seções (aqui, 3 cm) exatamente paralelas ao teste padrão da frente/faixa da migração da proteína. Para facilitar o manuseio, coloque cada seção em um suporte de filme plástico com dimensões iguais.
   2. Transfira as pistas para um tubo aberto com rolhas (fechadas na parte inferior, perfuradas centralmente no topo, alinhadas precisamente com as extremidades superior e inferior da secção de gel).
   3. Mergulhe o cilindro brevemente em nitrogênio líquido para iniciar rapidamente a solidificação. O meio de incorporação transparente solidifica dentro de segundos e torna-se branco na cor.
   4. Encha a cavidade com meio de incorporação, mergulhe-a brevemente em nitrogênio líquido e congele o cilindro a-20 ° c por várias horas.
      Nota: refrigerar o cilindro ràpida mergulhando o no nitrogênio líquido ajuda a evitar o deslocamento da laje do gel dentro do tubo. A distorção deve ser evitada para garantir alta resolução na seguinte análise de MS.
   5. Após a desmontagem, retire a película plástica e transfira o bloco com a seção encaixada do gel a um refrigerado, maior no diâmetro, cilindro do metal coloc em um apoio liso (isto é, prato de Petri) e selado com o meio de incorporação na parte externa do cilindro. Encha o cilindro com o meio de incorporação e congele completamente.
   6. Repita este procedimento com o outro lado do cilindro para obter um bloco sólido com superfícies coplanares.
   7. Retire o bloco do cilindro, Cole-o com meio de incorporação em um suporte de metal pré-arrefecido e insira o suporte na máquina de criocirurgia (criotomo). A superfície do bloco deve ser cuidadosamente alinhada com relação ao plano de fatiamento. Deixe-a equilibrar a temperatura ideal para o processo de fatiamento (aqui,-15 ° c).
      Nota: Use um ciclo de corte manual de progressão lenta de 0,1 mm de tamanho até atingir a superfície da seção de gel incorporada para garantir o posicionamento correto.
   8. Colha as fatias do gel uma após a outra, com uma espessura desejada final do tamanho da etapa de 0,25 milímetros, e transfira-as individualmente aos tubos da reação com baixas propriedades da ligação da proteína.
      Nota: neste set-up, as fatias uniformes do gel podem prontamente ser obtidas tão finas quanto 0,1 milímetros e tão grossos quanto 0,5 milímetros.
3. Digestão de Tryptic
   1. Realize a digestão Tríptico do em-gel após a lavagem extensiva das fatias do gel (pelo menos três círculos adicionais da lavagem são recomendados remover os componentes poliméricos do meio de incorporação) que seguem um procedimento padrão¹¹.
   2. Peptídeos eluída secos a vácuo e redissolvem em 0,5% (v/v) de ácido trifluoroacético agitando a 37 ° c (10 min) seguido de sonication banho (5 min) e breve centrifugação.

3. espectrometria de massas

1. nanoHPLC e MS set-up
   1. Carregue amostras digeridas em uma pré-coluna C18 (tamanho de partícula = 5 μm; diâmetro = 300 μm) com 0, 5% (v/v) de ácido trifluoroacético usando uma nano-HPLC (livre de separação) acoplada a um espectrómetro de massa com alta resolução.
   2. Elute capturou peptídeos com um gradiente aquoso-orgânico (eluente A): 5 min 3% B, 120 min de 3% B a 30% B, 20 min de 30% B a 99% B, 5 min 99% B, 5 min de 99% B a 3% B, 15 min 3% B (vazão = 300 nL/min).
      Nota: as fatias do gel de csBN-MS conduzem tipicamente às amostras com baixa à abundância intermediária do peptide e a um grau limitado de complexidade. a análise de nanoLC-MS/MS deve conseqüentemente ser executada com um set-up que fornece a sensibilidade razoável e a velocidade de sequenciamento, a definição maciça elevada (> 100000) e a escala dinâmica máxima (eficazmente 3-4 ordens de magnitude). No entanto, ele não requer dimensões de coluna longa ou gradientes de eluição estendidos além de 3 h.
   3. Peptídeos eluída separados em um emissor (identificação 75 μm; Tip = 8 μm) embalaram manualmente aproximadamente 20 cm com material C18 (tamanho de partícula = 3 μm). Electrospray as amostras em 2,3 quilovolts (modalidade positiva do íon) no capilar aquecido da transferência (° c 250) do espectrómetro maciço.
   4. Realize análises com as seguintes configurações de instrumento¹¹: tempo máximo de injeção de MS/ms = 400 MS; duração da exclusão = 60 s; limiar mínimo de sinal = 5.000 contagens, Top 10 precursores fragmentados; largura de isolamento = 1,0 m/z).
      Nota: para facilitar a calibração da massa, o tempo de retenção e a atribuição de sinais peptídicos em um grande número de conjuntos de dados ou medições, recomenda-se realizar as respectivas séries de medição MS sem interrupções ou alterações nos parâmetros e no hardware ( ou seja, na mesma coluna/emissor C18).
2. Identificação de proteínas (dados MS avaliados como descrito anteriormente¹¹)
   1. Extraia listas de pico de espectros de íons de fragmento usando a ferramenta "msconvert. exe" (parte do ProteoWizard).
   2. Mude todos os valores do precursor m/z para cada conjunto de dados pelo deslocamento mediano de m/z de todos os peptídeos atribuídos a proteínas em uma pesquisa preliminar de banco de dados com tolerância de massa peptídeo de 50 ppm.
   3. Pesquise as listas de pico corrigidas com um mecanismo de pesquisa adequado (aqui, mascote 2.6.2) contra todas as entradas do mouse do banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot (Release 2018_11).
   4. Selecione "acetil (proteína N-termo)", "Carbamidomethyl (C)", "GLN | Pyro-Glu (N-Term Q), glu | Pyro-Glu (N-termo E) "," oxidação (M) ", e" Propionamide (C) "como modificações variáveis.
   5. Ajuste o peptide e a tolerância maciça do fragmento a ± 5 ppm e a ± 0,8 da, respectivamente, e permita uma clivagem tríptico faltada. Ajuste o corte do valor da espera para a identificação do peptide a 0,5 ou menos. Use uma pesquisa de banco de dados de chamariz para determinar a taxa de descoberta falsa positiva (FDR). Defina o FDR para 1% ou aplique critérios de qualidade adicionais para garantir uma identificação confiável.
      Nota: o experimento apresentado identificou mais de 3.500 proteínas, com um peptídeo médio FDR de 4,4 ± 0,77% (n = 101 amostras de fatia), ou 3.000 proteínas quando o peptídeo FDR foi ajustado para 1%. É importante ressaltar que foram utilizados critérios mais rigorosos para a seleção de proteínas perfiladas (2.568). Incluiu todas as proteínas que foram identificadas com pelo menos dois peptídeos, pelo menos um deles sendo específico de proteínas, em pelo menos uma das amostras de 101 fatias.
3. Quantificação de proteínas
   1. Use intensidades de sinal peptídeo (volumes de pico [PVs]) para quantificação de proteínas que são obtidas a partir de exames completos FT e corretas para o tempo de retenção e mudanças em massa usando o software apropriado (aqui, MaxQuant v 1.6.3).
   2. Alinhe os conjuntos de dados do MS um por um para referenciar os tempos de eluição do peptídeo de referência (média total) usando a regressão LOESS. Atribua PVs a peptídeos diretamente (identificação baseada em MS/MS) ou indiretamente (ou seja, com base em seu tempo de correspondência m/z e eluição dentro de tolerâncias muito estreitas).
      Nota: Este protocolo utiliza o software em casa para atribuição dos peptídeos denominados "inseridos". Os parâmetros ajustados resultam em tolerâncias de harmonização do tempo de m/z e de eluição eficazes de ± 2 ppm e de ± 1 minuto, respectivamente (veja Figura 2A, B).
   3. Correto para variações sistemáticas de execução em execução na carga peptídica e eficiência de ionização por recalagem da intensidade do peptídeo calculada a partir das diferenças medianas das intensidades de peptídeos relativos entre amostras de fatias vizinhas (Figura 2C).
   4. Filtre dados PV para outliers e atribuições falso-positivas restantes identificadas pela análise de consistência PV interna.
   5. Normalize PVs de cada peptídeo para seus valores máximos em todos os conjuntos de dados de fatia produzindo perfis de abundância de peptídeos relativos.
   6. Finalmente, calcule os perfis relativos da abundância da proteína como as médias de pelo menos dois (e até seis ou 50%, o que valor é maior) do melhor correlacionando perfis do peptide sobre uma janela de três fatias consecutivas. Isso permite a ponte de valores de PV ausentes e reduzindo o ruído.
      Nota: isto finalmente resultou em 2.545 (de 2.568 pré-selecionados) perfis proteicos (Figura 2D).
4. Caracterização de complexos proteicos
   1. Analise os perfis proteicos realizando primeiro a detecção de pico usando o método Maxima local e ajuste consecutivamente as distribuições normais a esses picos, produzindo a posição (i.e., índice de fatia ou tamanho complexo aparente) de seus máximos e FWHM (largura total em intensidade do meio máximo) (Inset da Figura 4).
      Observação: no conjunto de dados, os perfis são analisados automaticamente usando scripts personalizados. Os menores valores de FWHM são indicativos da resolução de tamanho efetivo da abordagem (aqui, 6 x 0,25 = 1,5 mm).
   2. Use picos complexos de proteínas de referência com massa molecular definida (conforme relatado no banco de dados UniProtKB/Swiss-Prot) para a análise de regressão linear dos valores de (massa molecular prevista) de $64 para converter índices de número de fatia em tamanhos moleculares aparentes (i.e., tamanho complexo aparente no kDa).
      Nota: foram selecionados 23 complexos de marcadores na amostra (Figura 4) com base em (i) formas monodispersa de picos de perfil, (II) suporte experimental de pesos moleculares e (III) distribuições ao longo das seções de gel de BN-Page investigadas.

Resultados

A grande maioria dos estudos convencionais de BN-MS, bem como a abordagem de csBN-MS de alta resolução recentemente estabelecida, foram aplicadas a preparações mitocondrial e plastid que são (i) prontamente disponíveis, (II) têm complexidade limitada e (III) expressam complexos proteicos alvo (membrana) em altas densidades. Este protocolo estende a aplicação do perfilamento complexome de alta resolução às membranas não-mitochondrial que expressam proteínas Low-abundantes, sobre que pouca informação em sua integração em complexos está disponível. Para fins de demonstração, optou-se por uma preparação de membrana enriquecida com endosome do rim do camundongo obtido por centrifugação de gradiente de densidade.

A otimização desta preparação tem sido guiada pela proteína marcador TPC1 que forma canais iônicos intracelulares predominantemente localizados em endosomas precoces e recicláveis¹². Também é altamente expresso em células tubulares proximais renais, como demonstrado pela análise imuno-histoquímica de seções de tecido renal (Figura 1A). Estas membranas foram solubilizadas delicadamente (Complexolyte 47 em uma baixa relação da proteína: detergente de 1:8) e concentraram-se em uma almofada da sacarose por ultracentlee gação. Este último acabou por ser um passo importante para remover o excesso de componentes de menor peso molecular (ou seja, detergentes, lipídios, sais, polímeros orgânicos e metabólitos) que tendem a impactar negativamente na resolução de separações preparativas de BN-PAGE.

A separação complexa em um gel nativo do gradient do poliacrilamida de 1%-13% (w/v) (Figura 1B, painel médio) mostrou as faixas fortemente manchadas da proteína com os artefatos muito pequenos da migração. A separação SDS-PAGE de uma tira estreita do gel de BN-PAGE (Figura 1b, quadro encaixotado no vermelho) como uma segunda dimensão seguiu pela análise ocidental do borrão mostrou um teste padrão bem resolvido de populações complexas TPC1-associadas distintas (Figura 1b , painel superior, marcado por setas vermelhas), provavelmente resultante da associação com subunidades proteicas adicionais e/ou modificações pós-translacionais (como a glicosilação¹²). Uma seção de 3 cm do interesse foi extirpada, reparada, e processada para o fatiamento do cryomicrotome como descrito¹¹. As etapas individuais deste procedimento (em particular, o alinhamento preciso da seção larga do gel), que é da importância crítica para preservar a definição durante a amostragem, são documentadas no vídeo de acompanhamento. A seção incorporada do gel foi cortada finalmente em 101 fatias do gel com uma espessura uniforme de 0,25 milímetros (Figura 1B, painel mais baixo), que foram digeridos separada e analisados pela espectrometria maciça LC-acoplada do elevado desempenho.

Além do que a definição do tamanho, a qualidade da quantificação da proteína é chave para o perfilamento complexome bem sucedido. Com a configuração e as configurações de MS utilizadas, a análise das amostras foi bastante abrangente, resultando em uma identificação média de mais de 1.000 proteínas e 10.000 peptídeos (8.200 dos quais eram específicos de proteínas) por fatia, e cerca de 3.000 proteínas e 43.000 peptídeos (38.500 dos quais foram específicos de proteínas) no total. No entanto, devido à natureza estocástica do sequenciamento de MS/MS dependente de dados e suas limitações na faixa dinâmica, a informação de intensidade ainda era fragmentária para proteínas menos abundantes. Conseqüentemente, um procedimento elaborado do processamento de dados do MS¹¹foi executado que seja baseado na atribuição exata dos sinais do peptide (volumes máximos [PVS] = intensidades peptide-relacionadas do sinal integradas sobre m/z e tempo) sobre a série inteira de conjuntos de dados.

Como mostrado na Figura 2A, B, os desvios de sinais peptídicos em massa e tempo de retenção que permaneceram após A calibração foram idênticos para MS-Sequenced e para PVS indiretamente atribuídos (com tolerâncias muito estreitas de < 1 ppm e < 0,5 min para 95% de os PVs), indicativos de uma taxa muito baixa para atribuição de PV falso-positivo. Os outliers restantes foram filtrados com base em sua consistência com outros PVs relacionados. Uma vez que todas as medições de MS foram executadas consecutivamente na mesma configuração de LC-MS sem alterações nos parâmetros ou componentes de hardware, variações Run-to-Run (determinadas como a mediana de todas as intensidades PV em uma amostra em relação àquelas nas fatias vizinhas) foram pequenas e facilmente eliminadas por reescalonamento dos conjuntos de dados PV (Figura 2C). A informação resultante da intensidade do peptide foi usada então para reconstruir 2.545 perfis relativos da abundância da proteína. Como mostrado na Figura 2D, mais de 75% desses perfis proteicos foram baseados em pelo menos três peptídeos específicos de proteínas independentes.

Em seguida, o protocolo avaliou a relevância do tamanho da etapa da amostragem de gel BN-PAGE para a resolução de complexos proteicos. Para esse fim, os conjuntos de dados de fatia foram Unidos pela soma das informações PV de duas, três ou quatro fatias consecutivas, simulando assim o resultado para tamanhos de degrau de 0,5 mm, 0,75 mm e 1 mm (comparado com a amostragem original de 0,25 mm). A Figura 3 ilustra os perfis de abundância resultantes para a proteína TPC1 como um exemplo (A-D). Em 0,25 mm, as intensidades relativas e a separação de tamanho das populações complexas associadas ao TPC1 (Figura 3A) foram agradavelmente concordantes com os resultados da análise Western blot (Figura 1B, painel superior); embora, o perfil mostrou algum ruído, principalmente resultante de valores ausentes ("lacunas") na matriz PV utilizada para quantificação.

A junção de duas fatias correspondendo a 0,5 mm manteve as intensidades corretas e a separação dos complexos associados ao TPC1 e o ruído de quantificação removido (Figura 3B). Ao contrário, os tamanhos maiores da etapa de 0,75 milímetros e de 1 milímetro (Figura 3C, D) conduziram a uma perda da definição do tamanho e aboliram a discriminação de subpopulações complexas TPC1. Deve-se notar que a grande maioria das análises convencionais de BN-MS publicadas usam fatias cortadas manualmente de 2 mm (cerca de 60 para cobrir toda a pista de gel)^7,8,9,10.

A conversão da distância da migração ou do índice da fatia ao tamanho molecular é baseada geralmente em marcadores, em proteínas padrão nativas comercialmente disponíveis ou em complexos endógenos bem caracterizados da proteína com composição conhecida do subunidade (na maior parte [super] complexos da cadeia respiratória oxidativa mitocondrial [OXPHOS])¹³. Entretanto, desde que a separação BN-PAGE é baseada na seção transversal molecular eficaz que é determinada não somente pela massa molecular mas igualmente pela estrutura 3D e pelo número de lipídios, do detergente, e das moléculas associadas de Coomassie, as proteínas individuais podem mostrar desvios maiores. Portanto, optou-se por utilizar conjuntos maiores de complexos proteicos como marcadores¹¹. O gráfico na Figura 4 mostra 23 marcadores selecionados com uma subunidade representativa mostrada como um círculo preto, indicando os valores de valor de sua massa molecular prevista (de acordo com o banco de dados uniprotkb/Swiss-Prot) vs. o índice de fatia do pico máximo do perfil correspondente. Os últimos foram obtidos a partir de ajustes gaussianas automatizados para os dados relativos à abundância, como mostrado no conjunto da Figura 4 , mostrando o exemplo com acompanhante BCS1. A regressão linear (linha vermelha) forneceu uma função para converter valores de índice de fatia em tamanhos moleculares aparentes, que variaram de 160-630 kDa, ao longo da seção de gel investigada.

Finalmente, a análise forneceu informações sobre complexos bem caracterizados e demonstrou a existência de novas subunidades e montagens complexas. Exemplos que destacam diferentes aspectos do complexome são mostrados na Figura 5 (a-C: proteínas expressas ou preferencialmente localizadas em compartimentos endossômicos; D-F: complexos de outras localizações subcelulares). A proteína ferritina de transporte de ferro é conhecida por formar complexos de 24 subunidades leves (FRIL1) e/ou pesadas (FRIH), com um peso molecular total de 440 kDa¹⁴ (Figura 5a, seta preenchida). Os perfis da subunidade (Figura 5a) sugerem a existência de pelo menos duas formas menores do complexo (com uma massa aparente de 360 kDa e 340 kDa; setas abertas) com estequiometrias de cadeia pesada/leve distintas (melhor visíveis após o rescalamento de abundâncias, Inset da Figura 5A) que estão abundantemente presentes em endosomas.

Em contrapartida, os complexos nicalin-^{nomo1 15} (Figura5D), o complexo núcleo gama-secretase¹⁶ (Figura5B), e a maquinaria¹⁷ da GPI-transamidase (Figura 5e) mostram proporções da abundância de suas subunidades do núcleo sobre a escala inteira do tamanho e independente da associação com proteínas adicionais. Isso indica que suas subunidades são exclusivas entre si. Vacuolar H⁺-atpases são complexos Multiproteicos montados a partir de uma piscina de mais de 20 subunidades de forma modular com um peso molecular total de cerca de 900 kDa. A Figura 5C revela subcomplexos com composições distintas de pelo menos 17 subunidades, representando intermediários (DIS) de montagem biológica ou subcomplexos gerados pelas condições experimentais, alguns dos quais também foram observada em um estudo recente do BN-MS¹⁸. Outro exemplo complexo de múltiplas proteínas é o Proteassoma¹⁹ (Figura 5F). A inspeção próxima dos perfis da abundância das subunidades alfa e beta que formam o núcleo do Proteassoma 20s sugere duas populações complexas principais com diferenças subtis no tamanho (590 kDa e 575 kDa, indicados por setas cinzentas) e integração de três subunidades beta.

Em síntese, o perfil complexome de csBN-MS de membranas renais enriquecidas com endosome fornece resultados abrangentes e detalhados sobre a (i) integração de proteínas-alvo uniformes e de baixa abundância em complexos, (II) composição complexa geral da subunidade e estequiometria, e (III) complexos heterogeneidades, subestruturas e (DIS) intermediários de montagem.

Figura 1: separação preparativa de BN-Page de membranas solubilizadas endosome-enriquecidas do rim do rato usando a canaleta intracelular TPC1 como um marcador. (A) localização imuno-histoquímica da proteína TPC1 em túbulos proximais renais por microscopia confocal. Verde: anti-TPC1 anticorpo¹² coloração visualizado com secundário Cy3-biotinylated cabra anti-coelho IgG; vermelho: lectina de tetragonolobus de lótus biotinylated (LTL, 10 μg/ml, FITC-conjugated) marcando a superfície Luminal de células túbulo proximal. O Inset mostra a coloração de uma seção correspondente de um rim TPC1-KO como um controle negativo. As barras da escala branca são 20 μm. Igualmente da nota é expressão TPC1 forte em vesículas intracelular, conhecidas das experiências independentes para representar cedo e recicl endossomos¹². B) separação preparativa da BN-página de 2,5 mgs de membranas solubilizadas endosome-enriquecidas em um gel do inclinação do poliacrilamida de 1%-13% (w/v). Uma pista estreita (emoldurada em vermelho) foi cortada para posterior análise de SDS-PAGE/Western blot (painel superior), resolvendo diferentes complexos TPC1-associados e padrões de glicosilação (setas vermelhas: anti-TPC1/anti-Rabbit HRP/ECL Prime; verde: posições e predito massas [MDa] de complexos proteicos de marcadores identificados pela coloração total da proteína [mancha do borrão do rubi de SYPRO]) do borrão. Da direita para a esquerda: na⁺/k⁺-transportando ATPase, dimer complexo citocromo b-C1, ATP sintase, NADH: oxiorredutase ubiquinona. Uma seção de 3 cm do interesse da pista do gel foi extirpada, encaixada no meio de incorporação do tecido, montada, e cortada em 101 seções (0,25 milímetros) ao longo da parte dianteira da migração da proteína usando um cryomicrotome (painel mais baixo; Veja a ligação video). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: parâmetros-chave que determinam a precisão da atribuição e quantificação do sinal MS, bem como a profundidade de análise. (A) distribuição de erros de massa relativa (em ppm) após calibração m/z de MS/MS seqüenciados (barras vermelhas) e indiretamente atribuídos (ou seja, com base em tempos de massa e retenção de correspondência estreita, ver protocolo; barras azuis) sinais peptídicos. Isso sugere um erro de massa final de < 1 ppm (para 95% dos sinais/PVs atribuídos) e taxa muito baixa de atribuições de falsos positivos. (B) distribuição de desvios do tempo de retenção da Nano-HPLC da média total após o alinhamento do tempo da eluição de sinais do peptide, usando A regressão de loess (Veja o protocolo) e a codificação da cor como usado em (A). O erro de tempo é inferior a 30 s para > 95% dos sinais peptídicos/PVs atribuídos. (C) variação Run-to-Run das intensidades totais de MS plotadas em relação à média das duas amostras vizinhas. Esses fatores de escala foram aplicados às tabelas PV brutas para minimizar erros técnicos sistemáticos. (D) informações peptídicas utilizadas para o cálculo de perfis de abundância relativa de proteínas. Após a filtragem de peptídeos específicos de proteínas para valores atípicos, mal pontuados ou identificações únicas (ver protocolo), foram determinados perfis de abundância de proteínas de 2.545, > 75% dos quais foram baseados em pelo menos três peptídeos com confiança razoável. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: impacto crítico do tamanho da etapa na amostragem de gel na resolução complexome de TPC1. Os conjuntos de dados foram unidos por somar as intensidades de sinal em grupos de 1, 2, 3 e 4 fatias consecutivas (A-D, respectivamente) e processadas de forma idêntica para simular tamanhos de etapas diferentes em corte de gel conforme indicado. O perfil TPC1 mostra algum ruído (oversampling) em 0,25 milímetros mas boa definição do tamanho de três populações complexas (Veja também Figura 1B), que é preservada pela maior parte em uma largura da etapa de 0,5 milímetros. A discriminação destas populações torna-se perdida como 1 milímetro é aproximado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: determinação do peso molecular aparente. foram utilizados 23 complexos marcador com composição molecular definida (conforme indicado, de acordo com UniProtKB/Swiss-Prot) como marcadores de tamanho. Os valores logarítmicos de seus pesos moleculares esperados (em kDa) foram plotados versus o índice máximo da fatia do pico do perfil da subunidade representativa indicada da proteína (círculos cheios no preto). A conexão de regressão linear a esses dados (linha vermelha) forneceu uma função convertendo valores de índice de fatia em pesos moleculares aparentes. O Maxima máximo foi determinado pelos ajustes Gaussian automatizados aos picos do perfil da proteína como mostrado no Inset (direito) para a proteína BCS1 do acompanhante (dados preliminares no azul, limites ajustados indicados por linhas alaranjadas, função do ajuste no vermelho). Além, estes ajustes determinaram larguras Half-máxima máximas (linha verde, 6,5 fatias, ou 1,6 milímetros para o exemplo mostrado) com os complexos de focalização os mais afiados que medem em torno de um gel de 1,5 milímetros. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: exemplos de perfis de subunidades complexas de proteínas. Abundância relativa de proteínas vs. peso molecular aparente plotado para A corrente pesada e clara da ferritina (A) que revelaAheterogeneidade molecular da estequiometria da subunidade da ferritina, mais claramente visível após o reescalonamento das abundâncias (Inset). A seta preenchida e as setas abertas denotam o complexo completo (440 kDa) e dois subcomplexos, respectivamente. A gama-secretase (B) subunidades quantitativamente integradas em uma população complexa de núcleo único. Os subcomplexos de H⁺-atpases vacuolar (C) exibiram múltiplas montagens com composição subunitária distinta, todas expressas em endosomas. As proteínas nomo1 e nicalin (D) formaram um complexo exclusivo (GPI-transamidase), que é uma maquinaria enzimática multisubunidade formando vários complexos. (E) o complexo do núcleo de Proteassoma 20s mostrando (F) um padrão subcomplexo sutil com duas populações indicadas por flechas em cinza, todas originadas de outras localizações subcelulares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

O estudo apresentado construiu na técnica de CSBN-MS previamente aferido com uma preparação mitochondrial¹¹ e incorporou melhorias na preparação da amostra, no processamento do gel, e na avaliação dos dados do MS. A análise focalizada de uma seção do gel BN-PAGE da separação em grande escala forneceu um jogo detalhado dos dados que mostram medidas da qualidade comparáveis ao estudo com membranas mitochondrial. Os erros de massa e tempo de retenção, bem como as variações de Run-to-Run, foram mantidos muito baixos e forneceram a base para determinar perfis confiáveis de abundância de proteínas. A resolução de tamanho pareceu ser boa, com larguras de pico meia-máxima tão baixas quanto seis fatias (correspondendo a 1,5 mm, Figura 4) e diferenças de tamanho relativo de menos de 10% resolvidas (Figura 3, Figura 5A). Esses valores não atenderam totalmente à qualidade de resolução de tamanho da análise anterior de csBN-MS das mitocôndrias (apesar do tamanho da etapa de amostragem de gel menor escolhida), mas eles são significativamente melhores do que o desempenho de BN-MS convencional ou MS de exclusão de tamanho abordagens²⁰ que recentemente se tornaram populares.

A importância de uma alta resolução efetiva de tamanho complexo é sublinhada pelo experimento de simulação na Figura 3 (utilizando os complexos associados ao TPC1) que dificilmente podem ser resolvidos pela análise de Western blot 2D BN/SDS-PAGE (Figura 1B). Estes resultados sugerem que o corte de 0,25 milímetros neste caso conduziu a algum oversampling, mas este ainda provou ser útil para a eliminação do "ruído da quantificação" sem comprometer a definição eficaz do tamanho. Assim, em consonância com os resultados anteriores¹¹, um tamanho de etapa de amostragem de ~ 0,3 mm é geralmente recomendável.

Notavelmente, a discriminação de complexos TPC1-Associated é perdida completamente com a amostragem do gel de 1 milímetro, que é o tamanho o menor da etapa fornecido pelo fatiamento manual em BN-MS convencionais^5,6. Isso pode explicar o fato de que, apesar das poderosas tecnologias MS estarem disponíveis, muito poucos complexos proteicos e subunidades foram identificados de novo pelo perfil complexome. Além de seu bom poder de resolução, csBN-MS oferece alta versatilidade. Complexos ligados à membrana e complexos proteicos solúveis variando de 50 kDa a vários MDa podem ser efetivamente resolvidos em um único experimento com viés mínimo¹¹. Isto contrasta com as técnicas alternativas da separação usadas para o perfilamento complexome como a exclusão do tamanho ou a cromatografia da troca iónica, que operam com subconjuntos de proteínas solúveis com determinadas escalas do tamanho ou propriedades da carga. Na desvantagem, csBN-MS é menos escalável (carga máxima de ~ 3 mg de proteína por gel), pode ser tecnicamente desafiador, e não pode ser automatizado.

Globalmente, os resultados demonstram que o perfil complexome baseado em csBN-MS pode ser aplicado com sucesso a alvos não mitocondriais, mas também indicar alguns desafios associados. Assim, a extração eficiente e a estabilidade bioquímica de complexos proteicos exigem mais otimização, e as etapas de limpeza e ainda podem ser limitadas. Dentro da janela de tamanho investigado, o número de complexos proteicos bem focados e monodispersantes foi realmente consideravelmente menor (dados não mostrados) em comparação com uma amostra mitocondrial. Também é recomendável reduzir as cargas de amostra BN-PAGE para obter a separação aceitável do gel. Cargas mais elevadas podem necessitar de vias de gel mais amplas que são mais difíceis de processar corretamente para fatiar (ver vídeo que acompanha). Além disso, a complexidade proteica das amostras foi maior (em torno de duas vezes) do que as escavações de fatias derivadas de mitocôndrias, levando a mais valores de PV ausentes e uma faixa dinâmica reduzida. De fato, algumas pequenas proteínas esperadas para fazer parte dos complexos mostrados na Figura 5 faltavam nas análises. Esses problemas podem ser resolvidos no futuro usando instrumentos de MS mais rápidos e mais sensíveis ou modos de aquisição independentes de dados.

A preparação da amostra é altamente crítica para a recuperação complexa da proteína, a estabilidade, e a qualidade da separação do gel. Os parâmetros e procedimentos devem ser otimizados para cada tecido de origem, lisado de células, membrana (fração) e complexo proteico de interesse. As seguintes recomendações gerais são fornecidas que podem ajudar a estender aplicações de csBN-MS:

(i) preparar amostras frescas e evitar o aquecimento/congelamento, diluições fortes, alterações nas condições de reserva e atrasos desnecessários;

(II) uso de buffers que são essencialmente desprovidos de sais (substitua com 500-750 mM de betaína ou Ácido aminocapróico), sobre um pH neutro, e contendo até 1% (p/v) de detergente não desnaturante (relação proteína: detergente entre 1:4-1:10 para solubilização de membrana complexos proteicos, nenhum detergente necessário para complexos proteicos solúveis);

(III) teste cuidadoso e ajuste das condições de detergente por BN-PAGE analítica, uma vez que estes podem impactar fortemente a eficiência da solubilização complexa, a representação de complexos proteicos de membrana na amostra, estabilidade e homogeneidade de micelas de detergente proteico. Estes últimos são pré-requisitos para que as proteínas se concentrem como bandas distintas/populações complexas em géis BN-PAGE. A literatura precedente oferece uma escala larga de detergentes neutros. No entanto, DDM (n-Dodecyl β-d-maltoside)^1,2,4,5,6 e digitonin^{3,5,7,8, 9,10,13,18} foram as escolhas mais populares para análises de BN-MS até agora. Deve-se enfatizar que qualquer condição de detergente representa necessariamente um comprometimento entre a eficiência de solubilização e a preservação das interações protéicas e pode não ser igualmente adequada para todos os tipos de proteínas-alvo e material de origem;

(IV) remoção de polímeros carregados como fibrilas, filamentos, polylysine, DNA e abundantes componentes de peso molecular inferiores (i.e., metabólitos, lipídios ou peptídeos). Isto pode ser conseguido por ultracentlee, filtração do gel, ou diálise. Isto é particularmente importante para os lisados totais da pilha ou do tecido;

(v) adição de Coomassie G-250 (concentração final 0,05%-0,1%) e sacarose (para aumentar a densidade de carga, a concentração final de 10%-20% [w/v]) para a amostra pouco antes do carregamento, para limpar por ultracentlee curto, carregar a amostra sem perturbação, e iniciar a corrida imediatamente depois disso.

Como perspectiva futura, o perfil complexome baseado em csBN-MS oferece opções de multiplexação para estudar dinâmicas complexas de proteínas ou alterações relacionadas a condições biológicas específicas. A separação combinada de amostras metabolicamente etiquetadas como propor para a criação de perfil baseada tamanho-exclusão²¹ parece direta, mas pode ser dificultada pela troca espontânea da subunidade nos complexos que ocorrem independentemente da separação usada Método. Alternativamente, as amostras rotuladas podem ser resolvidas em faixas de gel vizinhas, que podem então ser cofatiadas ou combinadas pós-digerindo para análise diferencial com alta sensibilidade e robustez.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1	Bio Rad	#1610158	Recommended for acrylamide gradient gel solutions up to 13%
30% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio Rad	#1610154	Recommended for acrylamide gradient gel solutions >13%
SYPRO Ruby Protein Blot Stain	Bio Rad	#1703127	Total protein stain on blot membranes; sensitive and compatible with immunodetection
Coomassie Brilliant Blue G-250	Serva	no. 35050	Centrifugate stock solutions prior to use
ComplexioLyte 47	Logopharm	CL-47-01	Ready-to-use detergent buffer (1%) for mild solubilization of membrane proteins
Embedding Medium / Tissue Freezing Medium	Leica Biosystems	14020108926	Embedding medium for gel sections to be sliced by a cryo-microtome
Immobilon-P Membrane, PVDF, 0,45 µm	Merck	IPVH00010
ECL Prime Western Blotting Detection Reagent	GE Healthcare	RPN2232
Plastic syringe with rubber stopper, 20-30 ml	n.a.	n.a.	any supplier, important for making gel section embedding tool
broad razor blade	n.a.	n.a.	any supplier, for BN-PAGE gel trimming / excision of lanes
metal tube / cylinder, ca. 4 cm long	n.a.	n.a.	mold for embedding and freezing of gel samples
Protein LoBind Tubes, 1.5 ml	Eppendorf	Nr. 0030108116	highly recommended to minimize protein/peptide loss due to absorption
sequencing-grade modified trypsin	Promega	V5111
C18 PepMap100 precolumn, particle size 5 µm	Dionex / Thermo Scientific	P/N 160454
PicoTip emitter (i.d. 75 µm; tip 8 µm)	New Objective	FS360-75-8
ReproSil-Pur 120 ODS-3 (C18, 3 µm)	Dr. Maisch GmbH	r13.93.	columns packed manually
rabbit anti-TPC1 antibody	Gramsch Laboratories	custom production	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
Cy3-biotinylated goat anti-rabbit IgG	Vector Laboratories	CY-1300	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
biotinylated Lotus tetragonolobus lectin, FITC-conjugated	Vector Laboratories	#B1325	described in Castonguay, et al., 2017 (Reference 12)
cryo-microtome Leica CM1950	Leica Biosystems	14047743905
Mini Protean II Cell with wetblot unit	Bio Rad	n.a.	for SDS-PAGE and Westernblot (not sold any more)
Penguin Midi Gel Electrophoresis System	PeqLab	n.a.	for BN-PAGE (not sold any more)
Zeiss Axiovert 200 M microscope + Photometrics Coolsnap 2 digital camera	Zeiss / Photometrics	n.a.
peristaltic pump (IP high precision multichannel)	Ismatec	ISM940	for casting of gradient polyacrylamide gels
gradient mixer with stirring (two chambers)	selfmade, alternatively Bio Rad	1652000 or 1652001	for casting of gradient polyacrylamide gels, manual provides instructions to cast linear or hyperbolic gradient gels (http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1652000.pdf)
ultracentrifuge Sorvall M120 with S80 AT3 rotor	Sorvall / Thermo Scientific	n.a.	for sample preparation (not sold any more)
UltiMate 3000 RSLCnano HPLC	Dionex / Thermo Scientific	ULTIM3000RSLCNANO
Orbitrap Elite mass spectrometer	Thermo Scientific	IQLAAEGAAPFADBMAZQ