Um modelo de spheroid 3D como um sistema mais fisiológico para fibroblastos associados ao cancro diferenciação e invasão in vitro estudos

Resumo

O objetivo deste protocolo é estabelecer um modelo in vitro 3D para estudar a diferenciação de fibroblastos Cancer-associados (CAFs) em um tumor a granel-como o ambiente, que pode ser abordado em diferentes sistemas de análise, tais como a imunofluorescência, transcricional análise e imagens de células de vida.

Resumo

Definir o modelo ideal para um estudo in vitro é essencial, principalmente se estudar processos fisiológicos como a diferenciação de células. No estroma do tumor, os fibroblastos do anfitrião são estimulados por pilhas de cancro para diferenciar-se. Assim, adquirem um phenotype que contribua ao microambiente do tumor e apoie a progressão do tumor. Ao usar o modelo esferóide, foi criado um sistema modelo in vitro 3D, no qual analisamos o papel do laminin-332 e sua integrina receptor α3β1 nesse processo de diferenciação. Este sistema do modelo do esferóide reproduz não somente as condições do microambiente do tumor em uma maneira mais exata, mas igualmente é um modelo muito versátil desde que permite estudos a jusante diferentes, tais como a mancha imunofluorescente de ambos intra e extracelular marcadores, bem como as proteínas da matriz extracelular depositadas. Além disso, análises transcricional por qPCR, citometria de fluxo e invasão celular podem ser estudadas com este modelo. Aqui, nós descrevemos um protocolo de um modelo do esferóide para avaliar o papel do integrina α3β1 de CAFS e seu ligand ectopicamente depositado, laminin-332, na diferenciação e em suportar a invasão de pilhas de cancro pancreatic.

Introdução

O microambiente tumoral é um nicho muito complexo e extremamente importante para a manutenção e progressão das células tumorais¹. É formado não só pelas células cancerosas, mas também por fibroblastos stromal. As pilhas do tumor são cercadas por um estroma que seja específico e diferente do estroma de tecidos normais². Laminin-332 é uma proteína da matriz extracelular expressada ectopicamente no estroma de tumores diferentes, como do adenocarcinoma pancreatic³. Além disso, a composição bioquímica do ECM e também suas propriedades biofísicas, como rigidez e tensão, mudam dentro do volume tumoral⁴. Este estroma do tumor, ou "estroma reactivo", é causado por uma adaptação dos fibroblasto às pilhas de cancro vizinhas e pelo recrutamento de outros jogadores muito importantes que desenvolvem um ambiente favorável e de suporte para a progressão do tumor. A diferenciação de fibroblasto stromal conduz aos fibroblastos Cancer-associados (CAF). Essas células podem ser identificadas por meio de diferentes marcadores como α-actina de músculo liso (αSMA)⁵ ou antígeno neural/glial 2 (NG2)⁶.

O modelo in vitro mais adequado para recapitular o microambiente tumoral (TME) com CAFS é difícil de selecionar. O método para imitar parâmetros fisiológicos do TME de forma rentável e reprodutível deve ser considerado para tal sistema modelo. Dentro do TME, diferentes processos, como a proliferação, diferenciação, migração e invasão dos diferentes tipos de células ocorrem. Estes processos celulares podem ser realizados individualmente com diferentes métodos. No entanto, as condições experimentais devem considerar as interações celulares com a ECM do estroma tumoral, uma vez que a rigidez do substrato influencia o processo de diferenciação da CAF. R.G. Wells comentou sobre o impacto da rigidez matricial no comportamento celular e destacou que a organização citoesquelética e o status de diferenciação observados em células cultivadas in vitro podem ser artefactos⁷. Diferentes estímulos parecem estar envolvidos na diferenciação do Caf, incluindo a tensão mecânica^5,7. Para evitar isso, substratos macios 2D podem ser possíveis abordagens para estudos de diferenciação, pois contorna o problema do plástico de prato de cultura rígida. Uma superfície 2D macia, em que os fibroblastos podem ser crescidos, pode ser colagénio-eu revestido géis do poliacrilamida, por meio de que a rigidez do gel pode ser manipulada pela concentração de poliacrilamida e pelo cross-linker do gel. A adesão e a formação de fibras de estresse ricas em αSMA são aprimoradas em fibroblastos, juntamente com a rigidez do gel⁸. Estes resultados salientam a importância dos andaimes de substrato macio para modelos de diferenciação in vitro mais fisiológicos. Entretanto, em nossas mãos a reprodutibilidade experimental e a imagem latente destes géis eram desafiantes. Para superar essas deficiências, mudamos o sistema de substrato 2D macio para um modelo de esferóide 3D para estudos de diferenciação e invasão. Este modelo é mais clinicamente relevante e, semelhante a um organoide in vitro, recapitula interações celulares in vivo, produção e deposição de ECM, bem como o comportamento celular⁹.

Spheroids são formados quando as células não têm um substrato para aderir. Quando as células são deixadas sem uma superfície adesiva, elas agregam para formar uma estrutura mais ou menos esférica. Se os esferoides são compor de um tipo de pilha, são chamados homospheroids; se compor de dois ou mais tipos diferentes da pilha formam heterospheroids.

Entre os diferentes métodos para a preparação do esferóide, realizamos o protocolo usando placas de fundo redondo não aderentes 96-well. É muito eficaz em relação aos custos. Aqui, nós produzimos ambos os homospheroids dos fibroblasto, CAF ou CAFs que faltam a subunidade do integrina α3 para examinar o processo da diferenciação e heterospheroids de CAFs ou de integrina α3 KO CAFs e pilhas pancreatic da carcinoma do duto (AsPC-I e PANC-I) para estudar a invasão na matriz circundante.

O alvo para estes estudos era usar CAFs preliminar isolados das biópsias pancreatic humanas da carcinoma. No entanto, as biópsias para obter as células são escassas e, por essa razão, os CAFs utilizados nestes estudos foram imortalizados usando Lentivirus contendo HTERT. Eles são chamados de iCAFs, e suas contrapartes normais, fibroblastos pancreáticos primários humanos, são denominados iNFs. Os fibroblasto pancreatic humanos e as pilhas pancreatic da carcinoma do duto, AsPC-I e PANC-I, estão disponíveis comercialmente.

Este protocolo foi utilizado para estudar o efeito da interação laminina-332-integrina no processo de diferenciação da CAF. Para comprovar a especificidade dessa interação e sua função, foram utilizados compostos inibidores: BM2, um anticorpo monoclonal que bloqueia o local de ligação da integrina a cadeia¹⁰de laminina-332 α3, ou lebein 1, um composto derivado de veneno de cobra que bloqueia a integrinas de ligação à laminina α3β1, α6β1 e α7β1^11,12.

Para o ensaio da invasão, as pilhas tinham sido transacidas com o Lentivirus que contem o cDNA que codifica mCherry (iCAFs e integrina α3 KO iCAFs) ou GFP (AsPC-I e PANC-I) para distinguir os tipos diferentes da pilha nos heterospheroids. A transdução das células para imortalizá-las e/ou rotulá-las com a expressão de proteína fluorescente (mCherry e GFP) é descrita em um estudo prévio¹³, que deve ser consultado para obter mais informações.

Protocolo

1. esferoides 3D como um modelo in vitro para a diferenciação de fibroblast/CAF usando diferentes compostos inibidores de TGF-β1 da interação célula-matriz

1. Misture 1 parte de solução de metilcelulose de 6 mg/mL e 3 partes de meios de cultura celular, MEM suplementado com 1% de soro bovino fetal inativado por calor (FBS) e 1% de penicilina/estreptomicina para obter a solução de formação de esferóide.
2. Ressuscitou os fibroblastos normais imortalizados recentemente descongelados (iNFs), o CAF imortalizado (iCAFs) ou a integrina α3β1 KO iCAF (passagem até 25) na solução de formação de esferóides. Se preparando 1 96 placa de poço, prepare um excesso de solução de formação de esferóide, 10 mL e adicione 75.000 células, tendo em mente que cada esferóide é composto por 750 células, e que 100 μL são distribuídos por cada poço da placa.
3. Se as citocinas ou os inibidores da integrina forem incluídos no estudo, adicione estes compostos à suspensão celular, a fim de incorporá-los nos esferóides durante a sua formação. Note-se que as iNFs são estimuladas com 10 ng/mL de TGF-β1, a fim de desencadear a diferenciação. Se for caso disso, adicionar compostos inibidores juntamente com TGF-β1, tais como 20 μg/mL BM2 ou 10 μg/mL de lebein 1.
4. Prepare os homospheroídeos da CAF da mesma maneira, mas sem o estímulo TGF-β1, já que eles são diferenciados. Prepare o integrina α3 KO CAF homospheroids sem a adição de qualquer composto.
5. Distribua a solução da formação do esferóide em uma placa do multi-poço do fundo redondo 96 adicionando 100 μl da solução em cada poço. Toda vez que a solução esferóide é distribuída nos poços, misture bem pipetando para cima e para baixo, várias vezes.
6. Coloc a placa na incubadora da cultura da pilha para 24 h para permitir que um esferóide seja dado forma em cada poço.
7. Colete os esferóides após cerca de 24 h e use-os para diferentes finalidades a jusante: coloração imunofluorescente, tempo real (RT) q-PCR e citometria de fluxo. Para detectar a expressão de antígenos intra e extracelulares, incluindo a deposição de proteínas de ECM dentro do esferóide, use coloração imunofluorescente. Após a desintegração de esferoides em únicas pilhas, quantifique o receptor membrana-ancorado pelo fluxo cytometry. Para detectar a ativação do gene e as mudanças transcricional, use o RT q-PCR do mRNA isolado das pilhas do esferóide.

2. coloração imunofluorescente de esferóides

1. Colete os esferóides após cerca de 24 h em um tubo de reação de 1,5 mL por condição experimental ou por proteína a ser analisado. Por exemplo, coloque os esferóides de iNFs estimulados com TGF-β1 em um tubo diferente das iNFs de controle, que não foram tratadas. Para evitar a ruptura de esferóides devido a forças de cisalhamento muito fortes, corte a extremidade da ponta da pipeta para ampliar o orifício. Inclua pelo menos 5-10 esferóides em um tubo de reação, para permitir réplicas e levar em conta as possíveis perdas durante as etapas de lavagem.
2. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
3. Lave com 50 μL de 1X PBS. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, conforme descrito em 2,2.
4. Dependendo da proteína a ser manchada, fixar com 50 μL de paraformaldeído 4% em PBS por 20 minutos à temperatura ambiente (para αSMA, NG2 e integrina α3β1) ou com 50 μL de metanol por 10 min a-20 ° c (para laminina-332 subunidades).
5. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
6. Permeabilize as células com 0,1% Triton-X em PBS por 4 min à temperatura ambiente.
7. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
8. Incubar os esferóides em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA, por 1 h em RT para bloquear sítios de interação protéico não específicos.
9. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos primários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA a 4 ° c durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anti-αSMA CY-3 conjugados e NG2 a 5 μg/mL; BM2 anti-laminina α3, 6F12 anti-laminina β3 e anti-laminina γ 2 20 μg/mL.
10. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
11. Incubar os esferóides com 30 μL de anticorpos secundários em PBS, 2,5% FBS e 1% BSA em RT por 90 min. Os seguintes anticorpos secundários utilizados foram: Alexa 488 anti-coelho e anti-rato (5 μg/mL).
12. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3 três vezes.
13. Incubar as células com 30 μL de solução de coloração DAPI durante 4 min à temperatura ambiente.
14. Repita a etapa de lavagem conforme explicado nas etapas 2.2-2.3.
15. Coloc os esferoides em uma corrediça de vidro, em uma gota de PBS, usando um Pipet de vidro de Pasteur.
16. Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser usando uma ampliação de 10x. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha (15-20 planos da pilha). Para estabelecer os ajustes do laser no microscópio, use um esferóide compor das pilhas negativas para o antígeno do interesse ou um esferóide manchado somente com o anticorpo secundário. Reutilizar as mesmas configurações para todas as amostras que serão comparadas.
17. Analise as imagens microscópicas com o software ImageJ como publicado anteriormente¹⁴. As etapas são resumidas na Figura 1 suplementar. Como pano de fundo, determine a densidade de sinal integrada de uma região de interesse (ROI) livre de células. Calcule a fluorescência total corrigida da célula (TCCF) como:
    
18. Determine a fluorescência total corrigida (TCF) dos esferóides como o TCCF normalizado para a área de esferóide e o número de pilhas.
    

3. RT q-PCR de homospheroids

1. Para executar RT-qPCR, colete pelo menos 288 esferóides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem sem perturbar os esferóides peletizados.
2. Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Centrifugue os esferóides com uma centrífuga de bancada para cerca de 30-60 s em 1.000 x g. Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem, sem perturbar os esferóides peletizados.
3. Dissociar os esferóides com 250 μL de 4 mg/mL de colagenase B, 50 μg/mL DNase I, 2% BSA, 1 mM CaCl₂ em PBS a 37 ° c por cerca de 30-45 min, suavemente vortexing e pulsando intermitentemente por alguns segundos a cada 5 min.
4. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 3,2.
5. Isole o RNA total das células de esferóides desintegrados usando um kit de isolamento de RNA comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
6. Reverter transcrito o mRNA isolado em cDNA com um kit comercial, de acordo com as instruções dos fabricantes.
7. Quantificar os níveis de transcrição em repetições por PCR em tempo real. Os primers utilizados foram: α-SMA: FW 5 ′-CCGACCGAATGCAGAAG GA-3 ′, Rev 5 ′ ACAGAGTATTTGCGCTCCGAA-3 ′¹⁵; Corrente laminin α3: FW 5 ′-GCTCAGCTGTTTGTGGTTGA-3 ′, Rev 5 ′-TGTCTGCATCTGCCAATAGC-3 ′¹⁶; Laminin β3 Chain: FW 5 ′-GGCAGATGATTAGGGCAGCCGAGGAA-3 ′ rev 5 ′-CGGACCTGCTGGATTAGGAGCCGTGT-3 ′¹⁷; Laminin γ2 Chain: FW 5 ′-GATGGCATTCACTGCGAGAAG-3 ′ rev 5 ′-TCGAGCACTAAGAGAACCTTTGG-3 ′ ¹⁶; NG2: FW 5 ′-CTGCAGGTCTATGTCGGTCA-3 ′ rev 5 ′-TTGGCTTTGACCCTGACTATG-3 ′¹⁸; integrina α3 subunit: FW 5 '-AGGGGACCTTCAGGTGCA-3 ' Rev 5 '-TGTAGCCGGTGATTTACCAT-3 '¹⁹; TOP-1: FW 5 ′-CCAGACGGAAGCTCGGAAAC-3 ′ rev 5 ′-GTCCAGGAGGCTCTATCTTGAA-3 ′²⁰.
8. Corrija os valores de CT para o CT-valor de um gene de referência endógeno como TOP-1 usando a equação: 2^-δδct. ΔΔCt = ΔCt (amostra-alvo) – ΔCt (amostra de referência) e ΔCt = TC do gene alvo ou gene de referência – TOP-I.

4. análise da citometria de fluxo da expressão da integrina

1. Para análise citométrica de fluxo, colete pelo menos 288 esferoides (correspondendo a placas 3 96-well) em um tubo de reação de 50 mL. Centrifugue por 5 min a 1.000 x g e Retire cuidadosamente o sobrenadante contendo metilcelulose introduzindo pipetagem.
2. Lave com 1 mL de 1X PBS e transfira os esferóides para um tubo de reacção de 1,5 mL. Repita a etapa de centrifugação e Retire cuidadosamente a PBS introduzindo pipetagem.
3. Dissociar os esferoides conforme descrito na etapa 3,3.
4. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,2.
5. Para bloquear sítios de ligação não específicos e impedir a ligação de anticorpos relevantes para a detecção aos receptores Fcγ (CD16, CD32 e CD64), incubar as células em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo (ou soro de outra espécie animal, os anticorpos dos quais não serão utilizado no experimento) e 0,1% BSA por 20 min a 4 ° c com rotação.
6. Em caso de coloração de marcadores intracelulares, fixar/permeabilizar as células conforme descrito na etapa 2.2-2.5.
7. Incubar as células com os anticorpos primários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo primário para 10 μg/mL.
8. Lave com 100 μL de PBS + 0,1% de BSA três vezes, com etapas da centrifugação no centrifugador superior do banco em 1.000 x g no meio.
9. Incubar as células com os anticorpos secundários em 100 μL de PBS contendo 2% de soro de cavalo e 0,1% de BSA por 30 min a 4 ° c com rotação. Diluir o anticorpo secundário para 10 μg/mL.
10. Repita a etapa de lavagem conforme explicado na etapa 4,7.
11. Analise 2,0 x 10⁴ células manchadas em um citometro de fluxo. Portão para células únicas ao vivo através do gráfico de pontos FSC-SSC e analisar a fluorescência das células fechadas no canal apropriado para o fluoróforo selecionado.

5. ensaio de invasão usando heterospheroids

1. Prepare a solução de formação de esferóides para heteroesferoides, contendo os diferentes tipos de células e médiuns correspondentes, como resumidos na tabela 1. As pilhas tinham sido transadas previamente com o Lentivirus que contem vetores para a expressão de mCherry ou de GFP.
2. Encha 100 μL da solução de formação de esferóide em cada poço da placa e incubar a placa na incubadora da cultura celular por 24 h para permitir que um esferóide seja formado em cada poço.
3. Preparar 60 μL de mistura de matriz gelatinosa contendo 2 mg/mL de colágeno de cauda de rato I, 30% de matriz de gelifying comercial e 2,5 μg/mL de laminina-332 num tubo de reacção de 1,5 mL. Distribua rapidamente 15 μL em 3 poços da câmara de angiogênese μ-slide. Incorpore um esferóide em cada poço que contem já o gel.
4. Se necessário, ajuste ràpida a posição do esferóide ao centro do poço com uma pipeta o microscópio.
5. Repita as etapas 5.2-5.3 para os heterospheroids seguintes e repita-os outra vez para os homospheroids.
6. Incubar os géis na incubadora por 1 h para solidificar e, em seguida, sobrepor suavemente os géis com meio de cultura celular.
7. Imagem os esferoides pela microscopia de fluorescência em um microscópio da exploração do laser. Tome a seção transversal ótica diferente do esferóide em planos óticos diferentes de uma z-pilha e em pontos diferentes do tempo da invasão (por exemplo, 0 h, 24 h, 48 h e 72 h).
8. Analise as imagens contando o número de células cancerosas invasoras. As células invasoras são aquelas que deixaram o esferóide e entraram na área invasiva. A área invasiva é definida como a área do anel entre os perímetros externos e internos administrados pela célula invadida mais afastada e pela borda esferóide do esferóide no início dos experimentos de invasão, respectivamente, conforme descrito na Figura 2 suplementar .

Resultados

Os resultados deste delineamento experimental são publicados em Martins cavaco et al.¹³, o que é recomendado para posterior leitura das conclusões extraídas desses experimentos.

A Figura 1, uma imagem representativa de um esferóide imunofluorescente, mostra a imunocoloração da subunidade de integrina α3 de fibroblastos imortalizados normais e de CAFS imortalizados (

Discussão

Desenvolver um modelo in vitro adequado para estudar a diferenciação da CAF é uma tarefa desafiadora. Após o emprego de diferentes abordagens, concluímos que um modelo esferóide 3D é o modelo mais prático, fisiológico e clinicamente relevante, no qual a interação entre células de carcinoma pancreática com CAFs imortalizados pode ser estudada. Este modelo impediu a diferenciação espontânea dos fibroblasto, devido aos estressores artefatual tais como a rigidez do plástico da cultura da pilha, pelo menos em...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)	SIGMA-ALDRICH	D9542-10
6F12 anti-Laminin β3 subunit Mouse (monoclonal)			Homemade
A3IIF5 Anti-α3 integrin subunit Mouse (monoclonal)			Kindly provided by Prof. M. Hemler, Dana Faber-Cancer Institute, Boston
Acetone	SIGMA-ALDRICH	32201
Albumin Fraction V - BSA	AppliChem	A1391
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) anti-Mouse	Invitrogen	A11029
Alexa fluor 488 Goat (polyclonal) Rabbit	Invitrogen	A11034
Anti-laminin γ2 subunit Mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc-28330
Anti-NG2 Rabbit (polyclonal) Millipore, AB5320	Millipore	AB5320
Anti-α-SMA-Cy3 Mouse (monoclonal)	SIGMA-ALDRICH	C6198
AsPC-1 cell line	ATCC		Kindly given by prof. Jorg Haier's Lab
Bench centrifuge	Fisher Scientific	50-589-620	Sprout
BM2 anti-laminin α3 subunit Mouse (monoclonal)			Kindly provided by Prof. Patricia Rousselle, CNRS, Lyon
Calcium Chloride (CaCl2)	Fluka	21074
Centrifuge	Thermo Scientific		Multifuge 1S-R
Centrifuge tubes 50 mL	Corning	430290
Collagenase B	Roche	11088831001
Collagen-I, rat tail	Gibco	A10483-01
Confocal microscope	Zeiss		LSM 700 and 800
DMEM (High glucose 4.5 g/L)	Lonza	BE12-604F
Dnase I	Roche	10104159001
Flow Cytometer	BD Biosciences		FACSCaliburTM
Gelifying matrix	ThermoFisher Scientific	A1413202	Matrigel, Geltrex
Goat IgG, isotype	DAKO	X 0907
Horse Serum	SIGMA-ALDRICH	12449-C
Human Primary Pancreatic Fibroblasts	PELOBiotech	PB-H-6201
Incubator	Heraeus	B6060
Laminin-332	Biolamina	LN332
MEM	SIGMA-ALDRICH	M4655
Microplate, 96 wells, U-bottom	Greiner Bio-One	650101
Microscope Slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Mouse IgG, isotype	SIGMA-ALDRICH	I8765
Multi axle rotating mixer	CAT	RM5 80V
PANC-I	ATCC		Kindly given by Prof. Jorg Haier's Lab
Paraformaldehyde	Riedel-de Haën	16005
Penicillin/streptomycin	Gibco	15140-122
QuantiTect Reverse Transcription Kit	Qiagen	205310
Rat IgG, isotype	Invitrogen	10700
Reaction tubes, 1.5 mL	Greiner Bio-One	616201
Real-time PCR cycler	Qiagen		Rotor-Gene Q
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Rotor Gene SYBR Green PCR Kit	Qiagen	204074
RPMI	Lonza	BE12-702F	Add glucose to 4.5 g (0.2 um filter) and 1% sodium pyruvate
TritonX-100	SIGMA-ALDRICH	X100RS
Vórtex	Scientific Industries		Vortex-Genie 2
μ-Slide Angiogenesis, uncoated	Ibidi	81501