Avaliação dos efeitos metabólicos do jejum intermitente isocalórico 2:1 em camundongos

Resumo

O artigo atual descreve um protocolo detalhado para o jejum intermitente isocalístico 2:1 para proteger e tratar de encontro à obesidade e ao metabolismo danificado da glicose em ratos do selvagem-tipo e do ob/ob.

Resumo

Jejum intermitente (IF), uma intervenção dietética envolvendo restrição energética periódica, tem sido considerado para fornecer inúmeros benefícios e neutralizar anormalidades metabólicas. Até agora, diferentes tipos de modelos de IF com durações variadas de jejum e períodos de alimentação foram documentados. No entanto, interpretar os resultados é um desafio, pois muitos desses modelos envolvem contribuições multifatoriais de estratégias de restrição de tempo e calorias. Por exemplo, o modelo de jejum de dia alternada, muitas vezes usado como um regime de roedores, pode resultar em subalimentação, sugerindo que os benefícios de saúde dessa intervenção são provavelmente mediados por meio de restrições calóricas e ciclos de realimentação em jejum. Recentemente, foi demonstrado com sucesso que 2:1 SE, compreendendo 1 dia de jejum seguido por 2 dias de alimentação, pode fornecer proteção contra a obesidade induzida pela dieta e melhorias metabólicas sem uma redução na ingestão calórica global. Apresentado aqui é um protocolo desta intervenção isocalórica 2:1 SE em camundongos. Também descrito é um protocolo de alimentação de pares (PF) necessário para examinar um modelo de mouse com comportamentos alimentares alterados, como hiperfagia. Usando o regime de 2:1 IF, demonstra-se que o isocaloric SE conduz ao ganho de peso de corpo reduzido, à homeostase melhorada da glicose, e à despesa de energia elevada. Assim, esse regime pode ser útil para investigar os impactos do IF na saúde em várias condições da doença.

Introdução

O estilo de vida moderno está associado a maior tempo de ingestão diária de alimentos e períodos de jejum mais curtos^1. Isso contribui para a atual epidemia global de obesidade, com desvantagens metabólicas observadas em seres humanos. O jejum tem sido praticado ao longo da história humana, e seus diversos benefícios para a saúde incluem vida útil prolongada, danos oxidativos reduzidos e homeostase energética otimizada^2,3. Entre várias formas de praticar jejum, a privação de energia periódica, denominada jejum intermitente (IF), está um método dietético popular que é amplamente praticado pela população em geral devido ao seu regime fácil e simples. Estudos recentes em modelos pré-clínicos e clínicos têm demonstrado que a IF pode fornecer benefícios de saúde comparáveis ao jejum prolongado e restrição calórica, sugerindo que a SE pode ser uma potencial estratégia terapêutica para obesidade e doenças metabólicas^2,3,4,5.

Os regimes de IF variam em termos de duração e frequência de jejum. Jejum de dias alternados (ou seja, 1 dia de alimentação/1 dia de jejum; 1:1 SE) tem sido o regime de IF mais comumente usado em roedores para estudar seus impactos benéficos na saúde sobre obesidade, doenças cardiovasculares, doenças neurodegenerativas, etc.^2,3. No entanto, como mostrado em estudos anteriores^6,7, e ainda mecanicamente confirmado em nossa análise de ingestão de energia^8,1:1 SE resulta em subalimentação (~ 80%) devido à falta de tempo de alimentação suficiente para compensar a perda de energia. Isso deixa claro se os benefícios de saúde conferidos por 1:1 SE são mediados por restrição calórica ou modificação dos padrões alimentares. Portanto, um novo regime de IF foi desenvolvido e é mostrado aqui, composto por um padrão de jejum de 2 dias de alimentação/1 dia (2:1 IF), que fornece aos ratos tempo suficiente para compensar a ingestão de alimentos (~99%) e peso corporal. Estes ratos são comparados então a um grupo do libitum do anúncio (AL). Este regime permite o exame dos efeitos do isocaloric SE na ausência de redução calórica em ratos do selvagem-tipo.

Em contraste, em um modelo de camundongo que exibe comportamento alimentar alterado, alimentação AL pode não ser uma condição de controle adequada para comparar e examinar os efeitos de 2:1 SE. Por exemplo, uma vez que os camundongos ob/ob (um modelo genético comumente usado para obesidade) exibem hiperfagia devido à falta de leptina que regula o apetite e a saciedade, aqueles com exposição 2:1 IF ~20% reduziram a ingestão calórica em comparação com camundongos ob/ob com alimentação AL. Assim, para examinar corretamente e comparar os efeitos do IF em camundongos ob/ob, um grupo de alimentação de pares como um controle adequado precisa ser empregado.

No geral, um protocolo abrangente é fornecido para realizar isocaloric 2:1 IF, incluindo o uso de um controle de alimentação de pares. É ainda demonstrado que isocaloric 2:1 SE protege ratos de alta gordura dieta induzida obesidade e / ou disfunção metabólica em ambos os ratos do tipo selvagem e ob / ob. Este protocolo pode ser usado para examinar os impactos benéficos para a saúde de 2:1 SE em várias condições patológicas, incluindo distúrbios neurológicos, doenças cardiovasculares e câncer.

Protocolo

Todos os métodos e protocolos aqui foram aprovados pelos Comitês de Cuidados Com Animais no Serviço de Cuidados com Animais e Veterinários (ACVS) da Universidade de Ottawa e do Centro de Fenogenômica (TCP) e estão em conformidade com as normas do Conselho Canadense de Cuidados Com Animais. Note-se que todos os procedimentos aqui descritos devem ser realizados aprovação institucional e governamental, bem como por funcionários tecnicamente proficientes. Todos os camundongos foram alojados em gaiolas desabafadas padrão em salas de temperatura e umidade controladas com 12 h/12 h de luz/ ciclos escuros (21-22 °C, 30%-60% de umidade para habitação normal) e livre acesso à água. Camundongos c57BL/6J masculinos e ob/ob foram obtidos no Laboratório Jackson.

1. 2:1 Isocaloric IF Regime

1. Para modelos de camundongos de obesidade magras e dietéticas induzidas pela dieta, prepare uma dieta normal (17% de gordura, ND) ou dieta rica em gordura (45% de gordura, HFD).
   NOTA: 60% HFD pode ser usado para induzir a obesidade induzida pela dieta grave; no entanto, devido à suavidade da pelota alimentar, é relativamente difícil medir com precisão a ingestão diária de alimentos. Um sistema automatizado de medição contínua pode melhorar a versatilidade para vários tipos de dietas.
2. Medir o peso corporal de base e composição corporal de cada rato em 7 semanas de idade usando uma escala e EchoMRI, respectivamente.
   Nota: Consulte a seção 3 para medição da composição corporal.
3. Com base no peso corporal e nos resultados da composição corporal, os camundongos C57BL/6J masculinos de 7 semanas de idade em dois grupos: grupos ad libitum (AL) e jejum intermitente (IF).
4. Coloque dois a três camundongos por gaiola e garantir o livre acesso à água potável.
   Nota: O número de camundongos por gaiola pode afetar o comportamento de ingestão de alimentos. Recomenda-se manter um número igual de camundongos por gaiola em todos os grupos durante o estudo.
5. Fornecer 1 semana de aclimatação ao novo ambiente de gaiola e dieta antes de iniciar o regime de IF.
6. Período de jejum: mova os ratos para uma gaiola limpa com cama fresca às 12:00 PM. Não adicione alimentos para o grupo IF, enquanto fornece uma quantidade pesada de alimentos para o grupo AL.
   Nota: Para cada ciclo de jejum, é importante mudar gaiolas para grupos al e se para garantir que ambos os grupos estão expostos à mesma quantidade de tempo de manuseio.
7. Após 24 h, medir os pesos dos ratos em ambos os grupos e restos de alimentos em gaiolas AL.
   Nota: Certifique-se de incluir o peso das migalhas de alimentos no funil de alimentos e no fundo da gaiola, especialmente quando se usa HFD, como ratos muitas vezes remover pequenas pelotas ou fragmentos de alimentos do funil e mantê-los perto de locais de ninho. A ingestão média de energia por mouse no final de cada ciclo 2:1 (3 dias) é de cerca de 35 kcal, equivalente a ~ 10 g para uma dieta normal (3,3 kcal/g) e ~ 7 g para HFD (4,73 kcal/g).
8. Período de alimentação: fornecer uma quantidade de alimentos às 12:00 pm para ambos os grupos AL e SE.
9. Após 48 h de fornecer o alimento, medir o peso de restos de comida e ratos.
10. Repita os passos 1,6-1,10 para a duração do estudo (porexemplo, 16 semanas).

2. Grupo controle de alimentação dupla (PF)

Nota: Para um experimento if em que o comportamento de alimentação alterado é observado em um modelo de mouse (por exemplo, hiperfagia em camundongos ob/ob), é necessário ter um grupo de alimentação de pares como controle para comparação calórica independente adequada com a IF.

1. Para o grupo controle da PF, escalonar o cronograma de experimentos de tal forma que a mesma quantidade de alimentos consumidos pelo grupo IF é oferecido ao grupo PF(Figura 2).
2. Medir a quantidade de alimentos consumidos pelo grupo IF ao longo de 2 dias de período de realimentação.
3. Divida essa quantidade de alimentos consumidos no grupo IF igualmente em três proporções e forneça-o diariamente ao grupo PF às 12:00 PM.
   Nota: Fornecer uma quantidade igual de alimentos diariamente é fundamental. No caso dos ratos com hiperfagia, se os ratos emparelhados são fornecidos com uma quantidade de alimento menos do que seu consumo voluntário imediatamente, consumirão provavelmente todo o alimento fornecido e se tornarão jejum eficazmente. Isto pode então impedir a comparação apropriada aos ratos IF-tratados e confundir o resultado.
4. Repita os passos 2.1-2.3 para a duração do estudo.

3. Análise da composição corporal

Nota: Uma vez que o IF a longo prazo afeta o peso corporal em camundongos, a composição corporal pode ser medida em ciclos apropriados (por exemplo, a cada 3 ou 4 ciclos) usando um analisador de composição corporal para quantificar a gordura e a massa magra em camundongos vivos e não anestesiados.

1. Ligue o analisador de composição corporal.
   Nota: Antes de iniciar o programa, deixe a máquina por pelo menos 2-3 h para aquecer.
2. Executar um teste de sistema no analisador de composição corporal para testar sua precisão de medição. Se necessário, calibrar o sistema usando óleo de canola e amostras de água.
3. Medir o peso corporal de cada rato.
4. Coloque o rato em um pequeno suporte cilíndrico animal.
5. Insira um delimitador para restringir o movimento físico do mouse durante a medição e coloque o suporte no analisador de composição corporal.
6. Executar o programa de digitalização.
   Nota: São necessários aproximadamente 90 a 120 s para analisar.
7. Após a medição, retire o suporte do equipamento e traga o rato de volta à gaiola.
   Nota: Um protocolo mais detalhado pode ser encontrado em uma publicação anterior⁹.

4. Testes de tolerância à glicose e insulina

1. Para o teste de tolerância à glicose (GTT), medir o peso corporal e a composição corporal de cada rato antes de submeter ao jejum e marcar a cauda com um marcador permanente para uma indexação fácil e rápida.
2. Coloque ratos em novas gaiolas sem comida às 19:00 para jejum noturno.
   Nota: Jejum noturno é o protocolo padrão, mas devido à fisiologia do mouse (por exemplo, aumento da utilização da glicose após jejum prolongado^10,11), jejum mais curto (~ 6 h) pode ser usado como descrito para ITT.
3. Após o jejum 14-16 h (9:00 am na manhã seguinte), medir o peso corporal e composição corporal de cada rato e calcular a quantidade de dosagem de glicose com base no peso corporal.
   Nota: Para evitar a superestimação da intolerância à glicose em camundongos obesos, a massa magra obtida a partir da análise da composição corporal pode ser usada para calcular a dosagem de glicose^12,13.
4. Para cada rato, corte a ponta da cauda (0,5-1,0 mm) usando uma tesoura cirúrgica limpa. Depois de limpar a primeira gota de sangue, tirar uma gota fresca de sangue da cauda e medir o nível de glicose no sangue de jejum de base com os glicosímetroes.
   Nota: O corte adicional da cauda não é necessário para cada medida da glicose de sangue durante GTT ou ITT. A ferida pode ser refrescada por abrading-lo com gaze para tirar uma gota de sangue.
5. Sujeito a camundongos a injeção intraperitoneal (i.p.) de glicose (1 mg/g de peso corporal).
   Nota: Com base no objetivo de um experimento (porexemplo, examinando os efeitos da incretina), a administração oral da glicose pode ser realizada por gavage oral. O protocolo para GTT oral (OGTT) pode ser encontrado em outro estudo^14.
6. Medir a glicose no sangue da cauda em 0, 5, 15, 30, 60 e 120 min injeção pós-glicose.
7. Depois de terminar o GTT, fornecer uma quantidade suficiente de alimentos.
8. Para o teste de tolerância à insulina (ITT), retire os alimentos às 9h.
   Nota: Uma vez que tanto GTT e ITT são experiências indutoras de estresse para ratos que podem elevar os níveis de glicose no sangue e mudar a fisiologia, recomenda-se para realizar ITT depois de fornecer pelo menos 2-3 dias de recuperação após o experimento GTT.
9. Após o jejum por 6 h (15:00), medir a glicose no sangue de base da cauda, como descrito no passo 4.4.
10. Sujeito a injeção de insulina i.p. (0,65 mU/g de peso corporal).
11. Medir a glicose no sangue da cauda em 0, 15, 30, 60, 90 e 120 min injeção pós-insulina.
12. Depois de terminar itt, fornecer uma quantidade suficiente de alimentos.

5. Calorimetria indireta

Nota: O metabolismo energético de camundongos tratados com FI pode ser avaliado através da calómetria indireta ao longo de um único ciclo de IF. Isso medirá o consumo de oxigênio (VO_2),produção de dióxido de carbono (VCO_2),razão de troca respiratória (RER) e calor (kcal/h).

1. Ligue o poder do sistema de calorímetro indireto pelo menos 2 h antes de executar o experimento.
   Nota: Este aquecimento do sistema é importante para uma medição precisa.
2. Prepare gaiolas com cama limpa, encha garrafas de água e adicione a quantidade pré-pesada de comida para os funis de alimentos.
3. Verifique a condição do refrigerante de drierite e limão. Se um indicador de cor do Drierite aparece rosa, o que indica que o drierite absorveu uma alta quantidade de umidade, é necessário substituir ou cubra com drierite fresco.
4. Calibrar o sistema usando um gás com a composição específica (0,5% CO_2,20,5% O_2).
5. Medir o peso corporal e a composição corporal de cada rato, que será usado para normalizar os dados de VO₂ e VCO_2.
6. Coloque suavemente um rato por gaiola.
7. Monte gaiolas metabólicas, coloque-as na câmara de ambiente temperatura controlada e conecte-se a linhas de gás e cabo de sensor de atividade.
8. Após a configuração do perfil do experimento, adicionando parâmetros experimentais apropriados usando o software, executar o programa para medição. O objetivo da medição do primeiro dia é proporcionar um período de aclimatação e medir o metabolismo energético de base.
9. Às 12:00 do dia seguinte, sujeitam ratos a 24 h de jejum, removendo alimentos e migalhas do funil e do fundo da gaiola. Se necessário, substitua com o fundamento limpo.
10. Após 24 h, adicione a quantidade pré-pesada de ração para o funil de alimentos para o período de realimentação.
11. Continue a medir para os próximos 48 h. Verifique regularmente se o sistema está funcionando sem interrupção de hardware ou software.
12. Após ter terminado a medida, termine o programa e traga ratos de volta a suas gaiolas originais. Medir a quantidade de restos de alimentos para examinar a ingestão de alimentos.
13. O protocolo detalhado para a calorimetria indireta pode ser encontrado em um estudo anterior⁹.

Resultados

A Figura 1 mostra as análises alimentares após o jejum de 24 h e a comparação entre 1:1 e 2:1 jejum intermitente. Um período de jejum de 24 h resultou em uma redução de ~ 10% no peso corporal, que foi totalmente recuperada após 2 dias de realimentação (Figura 1A). Um período de jejum de 24 h induzida hiperfagia durante os 2 dias subsequentes de realimentação (Figura 1B). No entanto, a c...

Discussão

Tem sido bem documentado que se fornece efeitos benéficos para a saúde em várias doenças em seres humanos e animais^{8,15,16,17,18,19}. Seus mecanismos subjacentes, como autofagia e microbioma intestinal, foram recentemente elucidados. O protocolo apresentado descreve um regime isocalórico de 2:1 SE em camundongos para inve...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Comprehensive Lab Animal Monitoring System (CLAMS)	Columbus Instruments		Indirect calorimeter
D-(+)-Glucose solution	Sigma-Aldrich	G8769	For GTT
EchoMRI 3-in-1	EchoMRI	EchoMRI 3-in-1	Body composition analysis
Glucometer and strips	Bayer	Contour NEXT	These are for GTT and ITT experiments
High Fat Diet (45% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12451	3.3 Kcal/g
High Fat Diet (60% Kcal% fat)	Research Diets Inc.	#D12452	4.73 Kcal/g
Insulin	El Lilly	Humulin R	For ITT
Mouse Strain: B6.Cg-Lepob/J	The Jackson Laboratory	#000632	Ob/Ob mouse
Mouse Strain: C57BL/6J	The Jackson Laboratory	#000664
Normal chow (17% Kcal% fat)	Harlan	#2918
Scale	Mettler Toledo		Body weight and food intake measurement