Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Resumo

Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.

Resumo

Os recentes avanços nas ciências viral de vetores e nanomateriais abriram caminho para novas abordagens de ponta para investigar ou manipular o sistema nervoso central (SNC). No entanto, uma maior otimização dessas tecnologias se beneficiaria de métodos que permitam a determinação rápida e simplificada da extensão do SNC e da segmentação específica das células sobre a administração de vetores virais ou nanopartículas no corpo. Aqui, apresentamos um protocolo que aproveita as capacidades de alta produtividade e multiplexing da citometria de fluxo para permitir uma quantificação direta de diferentes subtipos celulares isolados do cérebro do rato ou da medula espinhal, ou seja, microglia / macrófagos, linfócitos, astrócitos, oligodendrócitos, neurônios e células endotélias. Aplicamos essa abordagem para destacar diferenças críticas entre dois métodos de homogeneização de tecidos em termos de rendimento celular, viabilidade e composição. Isso poderia instruir o usuário a escolher o melhor método, dependendo do tipo de célula (s) de interesse e da aplicação específica. Este método não é adequado para análise da distribuição anatômica, uma vez que o tecido é homogeneizado para gerar uma suspensão unicelular. No entanto, ele permite trabalhar com células viáveis e pode ser combinado com a classificação celular, abrindo o caminho para várias aplicações que poderiam expandir o repertório de ferramentas nas mãos do neurocientista, que vão desde o estabelecimento de culturas primárias derivadas de populações de células puras, a análises de expressão gênica e ensaios bioquímicos ou funcionais sobre subtipos celulares bem definidos no contexto de doenças neurodegenerativas, sobre o tratamento farmacológico ou terapia gênica.

Introdução

Tecnologias de entrega de genes e medicamentos (como vetores virais e nanopartículas) tornaram-se uma ferramenta poderosa que pode ser aplicada para obter melhores insights sobre vias moleculares específicas alteradas em doenças neurodegenerativas e para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas inovadoras^1,2,3. A otimização dessas ferramentas depende da quantificação de: (1) a extensão da penetração no SNC sobre diferentes rotas de administração e (2) direcionamento de populações celulares específicas. Análises histológicas são geralmente aplicadas para visualizar genes de repórter fluorescente ou nanopartículas marcadas fluorescentemente em diferentes áreas do SNC e em diferentes tipos de células, identificadas pela imunomancha para marcadores celulares específicos^4,5. Mesmo que essa abordagem forneça informações valiosas sobre a biodistribuição das ferramentas administradas de gene ou entrega de drogas, a técnica pode ser demorada e intensa em termos de trabalho, pois requer: (1) fixação de tecidos, criopreservação ou parafina emindamento e corte; (2) coloração para marcadores celulares específicos, por vezes, exigindo recuperação de antígenos; (3) aquisição por microscopia de fluorescência, que geralmente permite a análise de um número limitado de marcadores diferentes dentro do mesmo experimento; (4) processamento de imagem para permitir a quantificação adequada do sinal de interesse.

A citometria do fluxo tornou-se uma técnica amplamente utilizada que aproveita marcadores fluorescentes muito específicos para permitir não apenas uma rápida avaliação quantitativa de diferentes fenótipos celulares em suspensões celulares, com base na expressão de antígenos superficiais ou intracelulares, mas também medições funcionais (por exemplo, taxa de apoptose, proliferação, análise do ciclo celular, etc.). O isolamento físico das células através da triagem de células ativadas fluorescentes também é possível, permitindo novas aplicações a jusante (por exemplo, cultura celular, RNAseq, análises bioquímicas etc.) ^6,7,8.

A homogeneização do tecido é um passo crítico necessário para obter uma suspensão de célula única para permitir avaliações citométricas confiáveis e reprodutíveis de fluxo a jusante. Diferentes métodos têm sido descritos para homogeneização cérebro-tecido adulto, principalmente com o objetivo de isolar as células microglia^9,10,11; eles podem ser classificados globalmente em duas categorias principais: (1) dissociação mecânica, que utiliza força de moagem ou corte através de um homogeneizador Dounce (DH) para rasgar as células de seus nichos e formar uma suspensão celular relativamente homogeneizada única, e (2) digestão enzimática, que depende da incubação de pedaços de tecido picado em 37 °C na presença de enzimas proteolíticas, como trippsina ou papaina, favorecendo a degradação da matriz extracelular para criar uma suspensão de células homogeneizada^s12.

Independentemente de qual método é utilizado, uma etapa de purificação é recomendada após a homogeneização do tecido para remover a mielina através da centrífuga em um gradiente de densidade ou por seleção magnética^9,12,antes de passar para as aplicações a jusante.

Aqui, descrevemos um método de processamento de tecidos baseado na digestão da papana (DP), seguido de purificação em um gradiente de densidade, otimizado para obter suspensões de células heterogêneas viáveis do cérebro do rato ou da medula espinhal de forma sensível ao tempo e adequada para citometria de fluxo. Além disso, descrevemos um painel de citometria de fluxo de 9 cores e a estratégia de gating que adotamos em laboratório para permitir a discriminação simultânea de diferentes populações do SNC, células vivas/mortas ou positividade para repórteres fluorescentes, como proteína fluorescente verde ou corante da rodamina. Ao aplicar esse fluxo de análise citométrica, podemos comparar diferentes métodos de processamento de tecidos, ou seja, PD versus DH, em termos de preservação da viabilidade celular e rendimentos de diferentes tipos de células.

Os detalhes que fornecemos aqui podem instruir a decisão sobre o protocolo de homogeneização e a combinação de anticorpos a usar no painel de citometria de fluxo, com base no tipo específico de interesse celular e nas análises a jusante (por exemplo, sensível à temperatura aplicações, rastreamento de marcadores fluorescentes específicos, cultura in vitro, análises funcionais).

Protocolo

Todos os métodos aqui descritos foram aprovados pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do Dana Farber Cancer Institute (protocolo número 16-024).

1. Preparação de soluções necessárias para o experimento

1. Prepare a solução de sal equilibrado (HBSS) da 1x Hank diluindo 10x HBSS com água estéril. Pré-chill a solução no gelo. Pelo menos 25 mL de solução são necessários para cada amostra.
2. Prepare a solução isotônica percoll (IPS) misturando 10x estéril HBSS 1:10 com gradiente médio de densidade (ou seja, Percoll). Pré-frio no gelo.
   NOTA: Ips pode ser armazenado por até 30 dias a 4 °C.
3. Prepare a solução de bloqueio de citometria de fluxo (FACS) (1% de soro bovino [BSA], 5% de soro bovino fetal [FBS] em soro soro amortecida com fosfato [PBS]). Pré-frio no gelo.

2. Eutanásia animal por perfusão intracardíaca e dissecção de tecido

NOTA: Camundongos C57BL/6J de oito semanas de idade, qualquer sexo, foram usados nos experimentos. A perfusão com a solução pbs é realizada para eliminar a contaminação do sangue dos órgãos, antes de prosseguir com a digestão do tecido.

1. Anestesite o rato usando uma mistura de cetamina/xilázine (90-200 mg/kg de cetamina, 10 mg/kg xilazine). Coloque o mouse em suas costas e fita de cada membro até o suporte. Verifique a profundidade adequada da anestesia, verificando o reflexo de retirada.
2. Faça uma incisão de pele média ao nível da inseto torácica para expor o esterno. Use fórceps para agarrar a ponta do esterno, em seguida, fazer uma incisão de 1 cm em cada lado da caixa torácica. Finalmente cortar o diafragma e abrir o esterno amplamente o suficiente para visualizar o coração.
3. Use fórceps para agarrar suavemente o coração pelo ventrículo direito e levantá-lo para a linha média e ligeiramente fora do peito.
4. Insira uma agulha de borboleta 23 G na ponta do ventrículo esquerdo, em direção à aorta e segure firmemente.
5. Comece a perfusão com 1x PBS. Perfure através da auricle direita usando tesouras para permitir que o perfusate saia da circulação. Defina a taxa de fluxo de PBS em 3 mL/min. Perfuse com pelo menos 15 mL de 1x PBS para garantir que os tecidos sejam claros.
   NOTA: Branqueamento do fígado e vasos sanguíneos mesentéricos são sinais de boa perfusão. Se necessário, o volume de pré-fusão pode ser aumentado até que o fluido que sai do coração esteja livre de sangue, momento em que a linha de descarga pode ser interrompida.
6. Após a perfusão, cortar o cérebro da medula espinhal e remover o cérebro do crânio com tesoura e fórceps. Retire a pele para aumentar a visibilidade e controle durante a dissecação e para evitar o transporte de contaminantes do cabelo. Lave a medula espinhal fora de sua coluna usando uma seringa de 3 mL cheia de PBS.
7. Transfira cada tecido em um poço de uma placa multi-poço de 6 poços pré-preenchido com 2 mL de HBSS gelado 1x e mantenha-se no gelo até a digestão.
8. Divida o cérebro e a medula espinhal em duas metades, ao longo da linha longitudinal.
   NOTA: Metade de cada tecido é homogeneizado (ver seções abaixo) para permitir análises citométricas de fluxo; a outra metade pode ser atribuída a diferentes processamentos para análises alternativas (por exemplo, mergulhada em solução fixativa de paraformaldeído para histologia).

3. Digestão enzimática do cérebro e da medula espinhal

NOTA: Volumes descritos nesta seção são suficientes para a digestão de um cérebro e meia ou medula espinhal.

1. Use um par de tesouras para picar os tecidos em pedaços de 1-2 mm de espessura.
2. Corte a ponta de uma pipeta de 1000 μL com um par de tesouras para torná-la suficientemente grande para permitir a coleta dos pedaços de tecido. Pré-enxaguar a ponta da pipeta com 1x HBSS. Em seguida, use a pipeta para transferir os 2 mL da solução HBSS contendo o tecido picado para um tubo cônico de 15 mL.
   NOTA: Pré-lavagem da ponta da pipeta é importante para evitar a viscosidade dos pedaços de tecido dentro da ponta.
3. Lave o poço com 2 mL adicionais de 1x HBSS gelado e transfira a solução para o tubo cônico correspondente de 15 mL contendo os pedaços de tecido.
4. Centrífuga cada amostra por 5 min a 250 x g a 4 °C.
5. Prepare a mistura enzimática 1 do kit de dissociação do tecido neural (NTDK; Tabela de Materiais) misturando 50 μL de enzima P com 1900 μL de buffer X por amostra. Mistura de enzimas quentes 1 a 37 °C em um banho de água. Incubar a mistura enzimática 1 a 37 °C por pelo menos 10 min antes de usar, a fim de permitir a ativação completa da enzima.
6. Aspirar o supernatant do tubo cônico de 15 mL e adicionar 1,95 mL de mistura de enzimas 1 para cada amostra. Vórtice suavemente para garantir que a pelota seja resuspensa.
7. Incubar as amostras em uma roda ou coqueteleira por 15 min a 37 °C.
8. Enquanto isso, prepare a mistura enzimática 2 do NTDK misturando 10 μL de enzima A com 20 μL de buffer Y por amostra; pré-aqueça a solução a 37 °C em um banho de água.
9. Ao final da incubação com mistura enzimática 1, adicione 30 μL de mistura enzimática 2 a cada amostra.
10. Misture delicadamente as amostras tubulação para cima e para baixo com uma ponta pipette 1000 μL pré-lavado com 1x HBSS.
11. Incubar a amostra em uma roda ou coqueteleira por 15 min a 37 °C.
12. Após a incubação, adicione 10 mL de gelo-frio 1x HBSS para cada tubo para inativar a mistura enzimática 1 e mistura de enzimas 2.
13. Centrífuga cada amostra por 10 min a 320 x g a 4 °C.
14. Descarte o supernatant; adicionar gelo-frio 1x HBSS para cada tubo até um volume final de 7 mL e resuspender suavemente a pelota por vórtice.
15. Continue a seção 5 para remoção de detritos.

4. Homogeneização mecânica do cérebro e da medula espinhal

NOTA: Os volumes descritos nesta seção são suficientes para homogeneização de metade do cérebro ou medula espinhal. O protocolo descrito nesta seção pode ser usado como uma alternativa de método à descrita na seção 3, dependendo da necessidade do usuário, conforme discutido abaixo.

1. Pré-chill a argamassa de vidro do moedor de tecido Dounce(Mesa de Materiais)definido no gelo.
2. Adicione 3 mL de 1x HBSS pré-refrigerados à argamassa.
3. Transfira o tecido (cérebro ou medula espinhal) do poço da placa de 6 poços para a argamassa de vidro certificando-se de que ele é mergulhado em 1x HBSS e fica na parte inferior da argamassa.
4. Esmague suavemente o tecido com 10 traços de pilão A seguidos por 10 traços de pilão B. Transfira a mistura homogeneizada em um novo tubo cônico de 15 mL.
5. Encha o tubo a um volume final de 10 mL usando 1x HBSS e centrífuga pré-refrigeradas por 10 min a 320 x g a 4 °C.
6. Ascute o supernatant e adicione hbss s 1x gelado a cada tubo até um volume final de 7 mL e resuspenda delicadamente a pelota vórtice.
7. Continue a seção 5 para remoção de detritos.

5. Remoção de detritos

NOTA: A remoção de detritos, composto principalmente de tecido não digerido e bainhas de mielina, é um passo crítico para permitir a coloração eficiente do tecido homogeneado para análises citométricas de fluxo subseqüentes.

1. Filtre cada amostra através de um filtro de células de 70 μm para remover qualquer pedaço de tecido não digerido. Esta etapa é particular importante especial ao trabalhar com tecidos da medula espinal desde que estas amostras são mais prováveis conter fragmentos ou meninges não digeridos do nervo que poderiam afetar as etapas subseqüentes.
2. Certifique-se de que o volume final é de 7 mL em cada tubo de amostra. Se não, preencha com gelo frio 1x HBSS até 7 mL.
3. Adicione 3 mL de IPS pré-refrigerado a cada amostra para fazer um volume final de 10 mL de uma solução contendo meio de gradiente de densidade em 30% de concentração final. Delicadamente vórtice as amostras para se certificar de que eles são homogêneos misturados.
4. Amostras de centrífugas para 15 min a 700 x g a 18 °C certificando-se de definir a aceleração da centrífuga para 7 e o freio para 0.
   NOTA: Centrifugação deve levar cerca de 30 min.
5. Retire delicadamente as amostras da centrífuga.
   NOTA: Um disco esbranquiçado composto de detritos e mielina deve ser visível flutuando na superfície da solução. Uma pelota (contendo as células de interesse) deve ser visível na parte inferior do tubo.
6. Cuidadosamente aspirar todo o disco esbranquiçado de detritos e, em seguida, o resto do supernatant certificando-se de não desalojar a pelota. Deixe cerca de 100 μL de solução em cima da pelota de células para evitar o risco de inadvertidamente desalojá-lo.
7. Adicione 1 mL de FACS BL, resuspende a pelota por pipetting para cima e para baixo com uma ponta pipette 1000 μL e amostras de transferência para tubos de 1,5 mL.
8. Centrífuga por 5 min a 450 x g à temperatura ambiente (RT).
9. Assine suavemente o supernatant e resuspenda a pelota em buffer apropriado compatível com análises a jusante (veja a seção 6 para o protocolo usado para avaliação citométrica de fluxo de vários tipos de células).

6. Coloração para avaliação citométrica de fluxo de vários tipos de células

1. Resuspenda a pelota obtida na etapa 5.9 com 350 μL de FACS BL. Adicione o Fc-bloco a cada amostra em uma concentração final de 5 μg/mL.
   NOTA: Pelo menos 100 μL da amostra devem ser usados para uma coloração, para certificar-se de processar células suficientes para permitir análises confiáveis.
2. Incubar a amostra por 10 min a 4 °C antes de prosseguir com a coloração.
3. Prepare uma mistura de anticorpos de acordo com a Tabela 1.
4. Adicione a mistura do anticorpo a cada tubo, vortex para 5 s e incuba as amostras para 15 min em 4 °C na obscuridade.
5. Adicione 1 mL de PBS a cada tubo, vórtice e centrífuga por 5 min a 450 x g na RT.
6. Enquanto isso, prepare a mistura de streptavidin de acordo com a Tabela 1.
7. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota na mistura do streptavidin preparada na etapa 6.6. Para cada amostra, use o mesmo volume que o utilizado para a coloração na etapa 6.4.
8. Vórtice para 5 s e incubar as amostras por 10 min a 4 °C no escuro.
9. Adicione 1 mL de PBS a cada tubo, vórtice e centrífuga por 5 min a 450 x g na RT.
10. Descarte o supernatant e resuspenda a pelota em FACS BL. Use 300 μL de FACS BL para cada 100 μL de amostra manchada.
11. Adicione a solução 7-amino-actinomicina D (7-AAD) para cada amostra. Use 5 μL de 7-AAD para cada 300 μL de amostra preparada na etapa 6.10.
12. Armazenar amostras a 4 °C no escuro até a análise citofluorimétrica. Realize a análise dentro de 16 h da preparação da amostra, para garantir a viabilidade da pilha >60%.

Resultados

Comparamos dois métodos diferentes de homogeneização (DH versus DP) aplicados ao cérebro do camundongo e à medula espinhal, para testar a eficiência na recuperação de diferentes tipos de células viáveis adequados para aplicações a jusante. Para isso, exploramos um painel de citometria de fluxo de 9 cores projetado para caracterizar, na mesma amostra, diferentes tipos de células do SNC, incluindo microglia, linfócitos, neurônios, astrócitos, oligodendrócitos e endotélio.

Os te...

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo para a co-purificação e análise citométrica de fluxo simultâneo de algumas das células CNS mais relevantes do cérebro do rato e da medula espinhal. Tradicionalmente, análises histológicas têm sido aplicadas para descrever a distribuição de nanopartículas ou a eficiência de transdução de vetores virais no SNC^5,13,ou para fornecer insights sobre as alterações morfológicas e moleculares que ocorrem em tipos específic...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10X HBSS (Calcium, Magnesium chloride, and Magnesium Sulfate-free)	Gibco	14185-052
70 mm Cell Strainer	Corning	431751
ACSA/ACSA2 anti-mouse antibody	Miltenyi Biotec	130-117-535	APC conjugated
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-1KG
CD11b rat anti-mouse antibody	Invitrogen	47-0112-82	APC-eFluor 780 conjugated
CD31 rat anti-mouse antibody	BD Bioscience	562939	BV421 conjugated
CD45 rat anti-mouse antibody	Biolegend	103138	Brilliant Violet 510 conjugated
CD90.1/Thy1.1 rat anti-mouse antibody	Biolegend	202518	PE/Cy7 conjugated
CD90.2/Thy1.2 rat anti-mouse antibody	Biolegend	1005325	PE/Cy7 conjugated
Conical Tubes (15 mL)	CellTreat	229411
Conical Tubes (50 mL)	CellTreat	229422
Dounce Tissue Grinder set (Includes Mortar as well as Pestles A and B)	Sigma-Aldrich	D9063-1SET
Fc (CD16/CD32) Block rat anti-mouse antibody	BD Pharmingen	553142
Fetal Bovine Serum	Benchmark	100-106
Neural Tissue Dissociation Kit (P)	Miltenyi Biotec	130-092-628
O4 anti mouse/rat/human antibody	Miltenyi Biotec	130-095-895	Biotin conjugated
Percoll	GE Healthcare	10266569	sold as not sterile reagent
Percoll	Sigma	65455529	sterile reagent (to be used for applications requiring sterility)
Percoll PLUS	Sigma	GE17-5445-01	reagent containing very low traces of endotoxin
Streptavidin	Invitrogen	S3258	Alexa Fluor 680 conjugated