Síntese de nanoaglomerados de ouro emissor próximos para aplicações biológicas

Resumo

Um método confiável e facilmente reprodutível para a preparação de nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes funcionais e quase infravermelhos e sua detecção direta dentro das células HeLa por citometria de fluxo e microscopia de varredura a laser confocal é descrito.

Resumo

Na última década, os nanoaglomerados de ouro fluorescentes (AuNCs) testemunharam uma crescente popularidade em aplicações biológicas e enormes esforços foram dedicados ao seu desenvolvimento. Neste protocolo, um método recentemente desenvolvido e fácil para a preparação de AuNCs emissores de água solúveis, biocompatíveis e coloides estáveis perto do infravermelho foram descritos em detalhes. Esta síntese química de baixa temperatura fornece AuNCs facilmente funcionalizáveis tampados com ácido tlástico e glicol de polietileno modificado por tiol em solução aquosa. A abordagem sintética não requer solventes orgânicos ou troca de ligantes adicionais, nem amplo conhecimento de química sintética para se reproduzir. Os AuNCs resultantes oferecem ácidos carboxílicos de superfície livre, que podem ser funcionalizados com várias moléculas biológicas com um grupo de amina livre sem afetar adversamente as propriedades fotoluminescentes dos AuNCs. Também foi descrito um procedimento rápido e confiável para quantificação citométrica de fluxo e imagens microscópicas confocais da captação de AuNC por células HeLa. Devido à grande mudança de Stokes, a configuração adequada dos filtros na citometria de fluxo e microscopia confocal é necessária para a detecção eficiente da fotoluminescência quase infravermelha dos AuNCs.

Introdução

Na última década, nanoaglomerados de ouro fotoluminescentes (PL AuNCs) emergiram como sondas promissoras tanto¹para pesquisas fundamentais quanto para aplicações práticas^{1,2,,33,4,,55,6,,7,,8,,9,,10}. Suas muitas características desejáveis incluem alta fotosestabilidade, máxima de emissões ajustáveis, longas vidas de emissões, grandes mudanças de Stokes, baixa toxicidade, boa biocompatibilidade, liberação renal e bioconjugação fácil. Os AuNCs pl podem fornecer fotoluminescência do azul à região espectral quase infravermelha (NIR), dependendo do número de átomos dentro do aglomerado¹¹ e da natureza do ligante de superfície¹². NIR (650-900 nm) emissores de AuNCs são particularmente promissores para imagens in vitro e in vivo de longo prazo de células e tecidos, pois oferecem alta relação sinal-ruído devido à sobreposição mínima com autofluorescência intrínseca, dispersão e absorção mais fracas e alta penetração tecidual da luz NIR^13,14.

Nos últimos anos, várias abordagens que se aproveitam das interações covalentes Au-S foram desenvolvidas para preparar AuNCs NIR-PL tampados com uma variedade de ligantes contendo tiol^13,,15,16,17. Para aplicações biomédicas, os AuNCs devem ser funcionalizados com um componente biológico para facilitar interações de ligação. Assim, AuNCs com alta estabilidade coloidal que são facilmente funcionais em solvente aquoso são altamente desejáveis. O objetivo geral do protocolo atual é descrever uma preparação previamente relatada de¹⁸ AuNCs com um grupo de ácido carboxílico funcionalizável na superfície, empregando ácido tiocitico e polietileno glicol (PEG) em um ambiente aquoso em detalhes e sua conjugação com moléculas com uma amina primária seguindo o método de acoplamento ácido-aminado. Devido à facilidade de síntese e alta reprodutibilidade, este protocolo pode ser usado e adaptado por pesquisadores de origens não químicas.

Um dos principais requisitos para aplicações de AuNCs em pesquisas biomédicas é a capacidade de observar e medir AuNCs dentro das células. Entre os métodos disponíveis para monitorar a captação de nanopartículas por células, a citometria de fluxo (FCM) e a microscopia de digitalização a laser confocal (CLSM) oferecem métodos robustos e de alto desempenho que permitem medições rápidas de internalização de nanomateriais fluorescentes em grande número de células¹⁹. Aqui, também foram apresentados métodos FCM e CLSM para medição direta e análise de PL AuNCs dentro das células, sem a necessidade de corantes adicionais.

Protocolo

1. Preparação de AuNCs emissores de infravermelho próximos (1)

1. Adicione 7,8 mg (37,8 μmol) ácido tlárico (TA) e 60 μL de 2 M NaOH a 23,4 mL de água ultrapura (resistividade 18,2 MΩ.cm a 25 °C) e mexa (pelo menos 1.000 rpm) até dissolver completamente (~15-20 min). Para uma dissolução mais rápida de TA, sônica a mistura. Para a síntese, recomenda-se a solução TA recém-preparada.
2. Adicionar 10,2 μL de HAuCl₄·3H₂O (470 mg/mL) de solução aquosa para a solução.
3. Após 15 min, adicione 480 μL de NaBH₄ (1,9 mg/mL) agitação vigorosa (pelo menos 1.000 rpm) e mexa a mistura de reação nas mesmas condições durante a noite.
   NOTA: Prepare a solução NaBH₄ em água ultrapura gelada e adicione à mistura de reação imediatamente após a preparação.
   NOTA: A síntese de AuNCs é facilmente escalável. Até 2 L de AuNCs foi sintetizado em um único lote, sem qualquer alteração nas propriedades ópticas das partículas.
4. (Crítico) No dia seguinte, purifique a solução aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa. Sem este procedimento de purificação, a etapa seguinte não funciona corretamente.
5. Adicione o polietileno glicol exterminado por tiol (MW 2.000; 15,6 mgs; 7,8 μmol) à solução, ajuste o pH para 7-7,5 e mexa a mistura durante a noite para obter 1. Purifique a dispersão aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa.
   NOTA: O ajuste do pH para 7-7.5 é extremamente importante. O pH mais alto pode resultar em uma mudança azul de máxima de emissão.

2. Conjugação de brometo de 3(aminopropílico)tripenylfosfosfonia (TPP) na superfície de 1

1. Misture a solução 1 (24 mL) preparada na etapa anterior e 3-(aminopropílico)brometo de tripenylfosfosfonia (12 mgs, ~30 μmol). Ajuste o pH para 4,5 com 1 M HCl.
   NOTA: 3-(Aminopropyl)triphenylfosfosfonia (TPP) sal de brometo foi preparado conforme descrito na literatura²⁰.
2. Inicie a reação adicionando um excesso de N-(3-dimetil-aminopropyl)-N'-etilcarbodiimide cloridrato (EDC·· HCl) (60 mgs, 312 μmol). O pH da solução aumentará e não deve ser permitido ir além de 6. Monitore o pH da mistura de reação durante a primeira hora. Se o pH aumentar acima de 6, reduza-o para 4,5-6 adicionando 1 M HCl.
3. Mexa a mistura de reação durante a noite à temperatura ambiente.
4. Purifique a dispersão aplicando três ciclos de centrifugação/filtração usando um dispositivo de filtragem de membrana com um corte de peso molecular de 3 kDa para obter 2. Diluir 2 obtidoaqui com água ultrapura para o volume inicial de 24 mL. A concentração de Au na solução é de 200 μg/mL.

3. Cultura celular

1. Células de hela de cultura (coleção de cultura HPA) no Meio de Águia modificado de Dulbecco suplementado com 10% de soro bovino fetal em 5% DE CO₂ a 37 °C.
2. Dividam e passem as células quando atingirem ~80% de confluência. Para minimizar a aquisição de novos mutantes, o número de propagações celulares não deve exceder 30.

4. Internalização da AuNC nas células HeLa

1. Semeie as células em uma placa de 12 poços a uma densidade de 20.000 células/mL (1 mL/poço). O objetivo é alcançar ~50% de confluência após 48 h.
2. A 48 h pós-semeada, aspirar o meio de cultura e adicionar 400 μL de meio de cultura completo (para controles não tratados) ou 500 μg de nanopartículas em 400 μL de meio cultivado completo (para amostras tratadas) a cada poço. Devolva as culturas para uma incubadora de 37 °C.
   NOTA: A adição de grandes volumes de solução AuNC afeta negativamente a viabilidade celular. As soluções AuNC precisam ser concentradas. Assim, 2 obtidos na etapa 2.4 estão concentrados 100 vezes. 40 mL AuNC estava concentrado a 400 μL. Uma alíquota de 25 μL desta solução concentrada foi adicionada à mídia de cultura celular de 400 μL para obter a concentração de AuNC desejada.
3. Após 2h de internalização, desconecte as células por tentativa padrão de acordo com o protocolo do fabricante.
4. Coletar as amostras em tubos de microcentrifuge de polipropileno e centrífugas por 5 min a 350 x g a 4 °C.
5. Prepare o seguinte tampão FCM: solução pré-refrigerada de soro tampão de fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na₂HPO₄, 1,47 mM NaH₂PO₄, pH 7.4) complementado com 2% de albumina de soro bovino a 4 °C.
6. Lave as pelotas com 1 mL de tampão FCM e centrífuga por 5 min a 350 x g a 4 °C.
7. Resuspender a pelota em 500 μL de tampão FCM e armazenar amostras a 4 °C antes da análise.

5. Análise de citometria de fluxo

1. Filtrar todas as amostras usando um tubo de fundo redondo de poliestireno de 5 mL com uma tampa de coador de células.
2. Antes de adquirir dados usando o software do instrumento, especifique a configuração do citómetro.
3. Formatar todos os gráficos de taque e histogramas para 'Aquisições'.
4. Plote um gráfico de dois parâmetros da área de dispersão para frente (FSC-A) e área de dispersão lateral (SSC-A) para mostrar a distribuição das células. Para excluir doublets, crie um gráfico de dois parâmetros de altura FSC (FSC-H) vs. FSC-A. Para monitorar a intensidade relativa de fluorescência na amostra, plote um histograma de parâmetro único para a área do canal fluorescente (FL-A). Use uma escala linear para retratar dados FSC e SSC, e uma escala logarítmica para todos os parâmetros fluorescentes.
5. Adquira amostra não tratada (sem nanopartículas) a uma baixa taxa de fluxo para minimizar eventos coincidentes (se permitido pelo instrumento). Durante a aquisição, ajuste as tensões do tubo fotomultiplicador (PMT) para obter a população não tratada em escala no lote FSC vs SSC. Se necessário, ajuste as tensões pmt para o canal FL para colocar a população não manchada no canto esquerdo do histograma.
6. Selecione a 'guia de portão' específica no software e desenhe um portão apropriado em torno da população desejada. As células dentro do portão se moverão para o próximo posto de controle.
7. Registre 10.000 eventos por amostra.
8. Registre todas as amostras as mesmas configurações do instrumento.
9. Use um programa apropriado para analisar os dados de citometria de fluxo.
   NOTA: Alguns aplicativos podem exigir a configuração personalizada dos filtros. Para troca de filtros sempre siga as recomendações do fabricante no guia do usuário.
   NOTA: O experimento pode ser salvo e recarregado para preservar as configurações do instrumento e a estratégia de gating.
   NOTA: Um gráfico de altura de dispersão lateral (SSC-H) vs. área de dispersão lateral (SSC-A) também pode ser usado para exclusão dupla. Este tipo de gating pode ser mais sensível, pois o detector FSC não costuma ser um PMT.

6. Internalização de 2 em células HeLa para microscopia de varredura a laser confocal (CLSM)

1. Semeie as células em um prato de fundo de vidro de 4 câmaras de 35 mm a uma densidade de 250.000 células/mL (0,5 mL/câmara). Mantenha a câmara em uma incubadora de 37 °C com atmosfera de 5% de CO_2. O objetivo é alcançar ~50% de confluência após 24 h.
2. A 24 h pós-semeada, adicione 100 μg de 2 (ou 10 μL da solução de estoque de 10 mg/mL) a cada câmara de prato contendo 0,5 mL de meio com as células (para amostras tratadas).
3. Devolva o prato para a incubadora. Deixe as células internalizarem os AuNCs por 24 h antes de usá-las para CLSM.
4. Após o período de internalização, descarte o meio e lave as células com meio fresco pré-aquecido por 5 min. Repita o passo de lavagem mais uma vez. Em seguida, encha cada câmara com 800 μL de meio fresco.

7. Imagem CLSM de células Hela vivas rotuladas com 2

1. Para imagens microscópicas, use lente objetiva de óleo 63x (n = 1.518) (NA = 1,4) em microscópio confocal com Plan-Apochromat.
2. Monte o prato no estágio invertido do microscópio com a câmara aquecida a 37 °C e fornecida com atmosfera de 5% de CO₂ umidificada.
3. Para detectar AuNC internalizado, use um conjunto laser de 405 nm a 2% de potência com um divisor de feixe apropriado. Defina o alcance dos comprimentos de onda de detecção entre 650 e 760 nm.
4. Defina a resolução da imagem para 2048 x 2048 pixels. Na configuração de velocidade de aquisição, aponte para um tempo de habitação de pixels em torno de 4 μs. Adquira a imagem com média de 2x (modo de linha, média média do método). Coloque o orifício em 1 unidade airy (para luz de 405 nm). Para maior sensibilidade, use o modo de contagem de fótons.
5. Para iluminação correta na luz transmitida com contraste diferencial de interferência (DIC), use a configuração de Köhler do condensador e a parada de campo. Para aquisição de luz transmitida, utilize um laser de 488 nm a 0,7% de potência sem qualquer detector de fluorescência atribuído. Defina um divisor de feixe apropriado para o comprimento de onda do laser.
6. Adquira duas imagens para cada faixa (fluorescência vermelha e DIC). Rastrear AuNCs por sua fluorescência vermelha; os limites das células são facilmente determinados na luz transmitida com imagens DIC.

Resultados

NIR PL AuNCs foram preparados a partir de Au³⁺ na presença de TA, e então o PEG (MW 2.000) foi vinculado à superfície AuNC para obter 1 após o fluxo de trabalho mostrado na Figura 1. Acoplamento amidiano entre 1 e 3(aminopropílico) brometo de tripenylfosfonia (TPP) fornecido 2. Como esperado, os espectros de absorção (Figura 2a) indicaram que os AuNCs 1 e 2 n?...

Discussão

Os AuNCs emissores de NIR foram sintetizados utilizando-se uma abordagem de baixo para cima na qual a solução precursora de ouro (HAuCl₄) foi tratada com ligantes thiol adequados, seguida de redução de Au³⁺. A redução de íons metálicos em solução aquosa tende a agregar e resulta em nanopartículas grandes em vez de NCs ultrapequenas²¹. Para preparar os AuNCs PL ultrapequenos (≤2 nm), as condições sintéticas foram ajustadas para evitar a formação de grandes pa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride	TCI Chemicals	D1601	https://www.tcichemicals.com/eshop/en/eu/commodity/D1601/;jsessionid=3AD046E5389206AAE33C8AAB5036CDD6?gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYrO69K6Np3tYeSsAouqGndUvzzsy1hStBPuHG-X3cpTIsAqq9z0cDBoC76MQAvD_BwE
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A4161	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a4161?lang=en&region=CZ
Disodium hydrogen phosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	15130-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_281.pdf
DL-Thioctic acid, 98%	Alfa Aesar	L04711	https://www.alfa.com/en/catalog/L04711/
Hydrochloric acid 35%	PENTA s.r.o.	19350-11000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_512.pdf
Hydrogen tetrachloroaurate(III) trihydrate, ACS, 99.99% (metals basis), Au 49.0% min	Alfa Aesar	36400	https://www.alfa.com/en/catalog/036400/
O-(2-Mercaptoethyl)-O′-methylpolyethylene glycol 2000	Sigma-Aldrich	743127	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/743127?lang=en&region=CZ
Potassium chloride	PENTA s.r.o.	16200-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_346.pdf
Sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882	https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/452882?lang=en&region=CZ&gclid=CjwKCAjwiZnnBRBQEiwAcWKfYuoZKvdK_fH24F1gGugG4pamF2FFZLd36YyZmRTdGgkbm5SbyGP0jBoCoo0QAvD_BwE
Sodium chloride	PENTA s.r.o.	16610-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_376.pdf
Sodium dihydrogenphosphate dihydrate	PENTA s.r.o.	12330-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_124.pdf
Sodium hydroxide pellets	PENTA s.r.o.	15740-31000	https://www.pentachemicals.eu/soubory/specifikace/specifikace_307.pdf
XTT (sodium 2, 3-bis (2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-5-[(phenylamino)-carbonyl]-2H-tetrazolium inner salt)	Thermo Fisher Scientific	X12223	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/X12223#/X12223