Desreferência antibiótica usando a plataforma de resistência a antibióticos

Resumo

Nós descrevemos uma plataforma que utilize uma biblioteca de Escherichia coli resistente antibiótico isogênicos para o desreplicação dos antibióticos. A identidade de um antibiótico produzido por bactérias ou fungos pode ser deduzada pelo crescimento de E. coli expressando seu respectivo gene de resistência. Esta plataforma é economicamente eficaz e tempo-eficiente.

Resumo

Um dos principais desafios na busca de novos antibióticos a partir de extratos de produtos naturais é a re-descoberta de compostos comuns. Para abordar esse desafio, a dereplicação, que é o processo de identificação de compostos conhecidos, é realizada em amostras de interesse. Os métodos de desreferência, como a separação analítica seguida por espectrometria de massas, são demorados e com uso intensivo de recursos. Para melhorar o processo de dereplicação, desenvolvemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP). O ARP é uma biblioteca de aproximadamente 100 genes da resistência antibiótica que foram clonados individualmente em Escherichia coli. Esta coleção de estirpe tem muitas aplicações, incluindo um método rentável e facile para a dereplicação de antibióticos. O processo envolve a fermentação de micróbios de produção de antibióticos na superfície de placas de Petri retangulares contendo meio sólido, permitindo assim a secreção e difusão de metabólitos secundários através do meio. Após um período de fermentação de 6 dias, a biomassa microbiana é removida e uma fina sobreposição de agar é adicionada à placa de Petri para criar uma superfície lisa e permitir o crescimento das cepas do indicador e. coli . Nossa coleção de cepas de ARP é fixada na superfície do prato de Petri contendo antibióticos. A placa é incubada em seguida durante a noite para permitir o crescimento de E. coli na superfície da sobreposição. Apenas cepas que contenham resistência a um antibiótico específico (ou classe) crescem nesta superfície, possibilitando a rápida identificação do composto produzido. Este método tem sido usado com sucesso para a identificação de produtores de antibióticos conhecidos e como um meio para identificar aqueles que produzem novos compostos.

Introdução

Desde a descoberta da penicilina em 1928, os produtos naturais derivados de microrganismos ambientais provaram ser uma fonte rica de compostos antimicrobianos¹. Aproximadamente 80% dos antibióticos do produto natural são derivados de bactérias do gênero Streptomyces e outros Actinomycetes, enquanto os 20% restantes são produzidos por espécies fúngicas¹. Alguns dos andaimes antibióticos mais comuns utilizados na clínica, como os β-lactams, tetraciclinas, rifamicinas e aminoglicosídeos, foram originalmente isolados de micróbios². No entanto, devido ao surgimento de bactérias multirresistentes (MDR), nosso atual painel de antibióticos tornou-se menos eficaz no tratamento^3,4. Estes incluem os patógenos "ESKAPE" (i.e., enterococos resistentes à vancomicina e Staphylococcus aureusresistentes a β-lactâmicos, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter baumanniie Enterobacter SP.), que são um subconjunto de bactérias consideradas associadas ao maior risco por um número de grandes autoridades de saúde pública, como a Organização Mundial da saúde^3,4,5. O surgimento e a disseminação global desses patógenos do MDR resultam em uma necessidade constante de novos antibióticos^3,4,5. Lamentavelmente, as duas últimas décadas demonstraram que a descoberta de novos antibióticos a partir de fontes microbianas é cada vez mais difícil⁶. As abordagens atuais para a descoberta de drogas incluem a triagem de alto débito de compostos bioativos, incluindo bibliotecas de extração de produtos naturais, permitindo que milhares de extratos sejam testados em um determinado momento². No entanto, uma vez detectada a atividade antimicrobiana, o próximo passo é analisar o conteúdo do extrato bruto para identificar o componente ativo e eliminar aqueles que contenham compostos conhecidos ou redundantes^7,8. Este processo, referido como dereplication, é vital para prevenir e/ou reduzir significativamente o tempo gasto na redescoberta de antibióticos conhecidos^7,9. Embora um passo necessário na descoberta de medicamentos de produto natural, a desreferência é notoriamente trabalhosa e intensiva de recursos¹⁰.

Desde que Beutler et al. primeiro cunhou o termo "dereplicação", esforços extensivos têm sido feitos para desenvolver estratégias inovadoras para a rápida identificação de antibióticos conhecidos^11,12. Hoje, as ferramentas mais comuns utilizadas para a dereplicação incluem sistemas cromatográficos^{analíticos, como}cromatografia líquida de alta eficiência, espectrometria de massas e métodos de detecção baseados em ressonância magnética nuclear^11,13. Infelizmente, cada um desses métodos requer o uso de equipamentos analíticos caros e interpretação de dados sofisticados.

Na tentativa de desenvolver um método de desreferência que pode ser realizado rapidamente sem equipamento especializado, estabelecemos a plataforma de resistência a antibióticos (ARP)¹⁰. O ARP pode ser usado para a descoberta de adjuvantes antibióticos, o perfilamento de novos compostos antibióticos contra mecanismos de resistência conhecidos, e a desreferência de antibióticos conhecidos em extratos derivados de actinobactérias e outros micróbios. Aqui, nós nos concentramos em sua aplicação na dereplicação de antibióticos. O ARP utiliza uma biblioteca de cepas isogênicas de Escherichia coli expressando genes de resistência individuais que são eficazes contra os antibióticos mais comumente redescobertos^14,15. Quando a biblioteca de e. coli é cultivada na presença de um organismo produtor de metabolito secundário, a identidade do composto pode ser deduzada pelo crescimento de cepas de e. coli que expressam seu gene de resistência associado¹⁰. Quando o ARP foi relatado pela primeira vez, a biblioteca consistiu em > 40 genes conferindo resistência a 16 classes de antibióticos. O modelo de dereplicação original foi projetado para abranger um subconjunto de genes de resistência por classe antibiótica para fornecer informações sobre subclasse antibiótica durante o processo de desreferência. Hoje, o ARP é compreendido de > 90 genes que conferem a resistência a 18 classes antibióticas. Usando nossa extensa coleção de genes de resistência, um modelo de dereplicação secundária foi desenvolvido e é conhecido como a plataforma mínima de resistência a antibióticos (MARP). Este modelo foi criado para eliminar a redundância genética e simplesmente fornecer informações sobre a classe geral de antibióticos que um metabolito dereplicated está relacionado. Adicionalmente, o modelo de MARP possui o tipo selvagem e uma tensão deficiente hyperpermeable/efflux de e. coli BW25113 (e. coli BW25113 δBAMBδTolc), comparado à encarnação original do ARP, que somente utiliza a estirpe hiperpermeável. Este aspecto único cria fenótipos adicionais durante a dereplicação, indicando uma capacidade de compostos para atravessar a membrana externa de bactérias Gram-negativas. Aqui, nós descrevemos um protocolo robusto a ser seguido quando dereplicating com o ARP e/ou o MARP, realça as etapas as mais críticas a ser seguidas, e discute os vários resultados possíveis.

Protocolo

1. preparação de E. coli biblioteca de estoques de glicerol (a partir de agar Slants)

1. Raia as cepas de ARP/MARP e. coli de inclinações de agar de caldo de lisogenia (lb) em placas de Petri contendo Agar lb e o marcador selecionável apropriado (tabela 1).
2. Prepare culturas para cada uma das cepas de E. coli inoculando 3 ml de lb contendo o marcador selecionável apropriado com uma única colônia. Cresça durante a noite em 37 ° c com aeração (250 rpm).
3. Combine 800 μL da cultura e 200 μL do glicerol estéril de 80% em um CryoVial de 1,8 mL. Misturar invertendo os tubos 3 − 4 vezes e conservar a-80 ° c.

2. preparação congelada da placa da biblioteca de estoque de ARP/MARP

1. Raia as cepas de ARP/MARP dos estoques de glicerol preparados na seção 1 para um novo conjunto de placas de Petri contendo Agar LB e o marcador selecionável apropriado. Cresça durante a noite em 37 ° c.
2. Usando a técnica asséptica, pipeta 500 μL do caldo ajustado cátion de Mueller Hinton (MHB) de um reservatório estéril em cada poço de uma placa de poço profundo estéril de 96.
3. Com as placas preparadas na etapa 2,1, use uma vara do aplicador para inocular a placa do poço profundo 96 de acordo com o mapa de ARP/MARP (Figura suplementar 1 e suplementar Figura 2). Assegure-se de que o marcador selecionável apropriado esteja adicionado a cada poço. Coloque uma membrana de vedação respirável sobre a superfície da placa de poço profundo e incubar durante a noite a 37 ° c (250 rpm).
4. Assegure-se de que não existam poços contaminados referindo-se ao mapa ARP/MARP. Repita se estiver contaminado. Usando um pipettor multicanal, transfira 100 μL de cada poço da placa de poço profundo para uma placa de fundo redonda estéril 96-bem. Repita esta etapa para criar várias placas de biblioteca de estoque congeladas.
   Nota: É o melhor preparar pelo menos 5 placas da biblioteca em um momento de manter-se das etapas de repetição 2.1 − 2.4 no caso da contaminação congelada da placa da biblioteca de estoque.
5. Termine de fazer as placas de biblioteca de estoque congeladas ARP/MARP introduzindo 100 μL de glicerol 50% estéril em cada poço e misture suavemente com pipetagem para cima e para baixo.
6. Cubra as placas com selos de alumínio estéreis e assegure-se de que cada poço esteja selado individualmente.
7. Número de placas e dedicar apenas uma placa congelada biblioteca de estoque para inocular novos modelos em um determinado momento. Mantenha o restante como back-ups em caso de contaminação congelada da placa da biblioteca de estoque.
8. Coloque a tampa da placa na parte superior do selo de alumínio e armazene a-80 ° c.

3. cultura de semente e preparação da placa do Dereplication

1. Usando uma vara do aplicador, inocular 3 ml do meio antibiótico de Streptomyces (Sam) (ou o outro meio apropriado para o organismo que está sendo testado) em um tubo de teste que contem um grânulo de vidro estéril (para quebrar-acima o micélio) com a tensão produzindo que deve ser desreferência. Para Streptomyces, raspe delicadamente esporos da superfície de uma colônia.
2. Usando o mesmo Stick aplicador de madeira, raia um controle de esterilidade em uma placa de Petri contendo Agar Bennett.
3. Incubar a cultura de sementes a 30 ° c com aeração por 6 dias (250 rpm) e incubar a placa de controle esterilidade a 30 ° c por 6 dias.
   Nota: Consulte a tabela 2 para Sam e as receitas de mídia de Bennett. As instruções acima são apropriadas para a maioria de Actinomycetes. Alterar a mídia de crescimento, conforme necessário para outras bactérias e fungos.
4. Prepare placas de dereplicação aspirando 23 mL de agar quente de Bennett em uma pipeta sorológica e dispense 20 mL uniformemente através da superfície de uma placa de Petri retangular (tabela de materiais), deixando o restante do meio na pipeta para evitar formação de bolhas de ar.
   Nota: Assegure-se de que a superfície que está sendo usada para derramar placas esteja nivelada e execute esta etapa antes que o agar esfrie demasiado; uma superfície plana é imperativo para a fixação da biblioteca nas próximas etapas.
5. Gire suavemente a placa até que o meio cubra todas as áreas da placa e não o perturbe até que o agar tenha definido completamente.
6. Prepare folhas de membrana de nitrocelulose (tabela de materiais) usando uma tampa de placa de Petri retangular como um modelo de rastreamento para que as folhas caiam na superfície da chapa de dereplicação. Cortar as folhas e autoclave-los em uma bolsa estéril.
   Nota: Esta membrana permite que os organismos esporulate em sua superfície, enquanto metabólitos secundários podem ser excretados no meio abaixo. Uma vez crescido, a membrana é removida para fornecer uma superfície limpa para a dereplicação. O ajuste mais próximo que o papel da membrana tem na superfície do agar de Bennett, o limpador o resultado do desreplicação.
7. Verifique a placa de controle da esterilidade para assegurar-se de que nenhum contaminador esteja atual após 6 dias da incubação. Se livre de contaminação, retire a tampa do prato de Petri retangular e Pipete 200 μL de cultura de semente na superfície do agar de Bennett.
8. Espalhe uniformemente a cultura através da superfície da placa inteira usando um cotonete de algodão estéril.
9. Coloc a membrana da nitrocelulose preparada na etapa 3,6 sobre a parte superior da cultura na superfície do prato de Petri. Comece alinhando a borda inferior da membrana à borda inferior da placa de Petri e aplique lentamente a membrana da borda inferior à borda superior da chapa.
10. Use um cotonete de algodão estéril para suavizar quaisquer bolhas de ar que possam ter formado entre a interface membrana-Agar, assegurando que a membrana esteja nivelada com o agar.
11. Coloque a tampa de volta na placa de Petri retangular e colocá-lo de cabeça para baixo em um saco de plástico selado. Incubar a 30 ° c durante 6 dias.

4. dereplication placa MHB Overlay e ARP/MARP biblioteca placa de preparação

1. Após 6 dias, retire a placa de dereplicação da incubadora de 30 ° c. Usando pinças estéreis (esterilizados ou pulverizados completamente com 70% de etanol), Retire cuidadosamente a membrana de nitrocelulose da superfície do agar de Bennett.
   Nota: Esta etapa removerá os esporos hidrofóbicos e os micélios cultivados na superfície da membrana para fornecer uma superfície limpa para a desreferência, facilitando a etapa 4,2.
2. Como descrito para a etapa 3,4, assegure-se de que a superfície de trabalho esteja nivelada e use uma pipeta sorológicos para aspirar 23 ml do agar MHB ajustado catito morno. Crie uma sobreposição distribuindo 20 mL uniformemente pela superfície da placa de desreferência, deixando o restante do meio na pipeta para evitar a formação de bolhas de ar.
3. Gire delicadamente a placa até que o meio cubra todas as áreas e não o perturbe até que o agar esteja ajustado completamente. Uma vez que esfriou e solidified, retorne a placa do desreplicação ao saco de plástico selado e armazene-a de cabeça em 4 ° c durante a noite.
   Nota: Esta etapa permite a difusão de metabólitos secundários do meio fermentado de Bennett na sobreposição de agar MHB. Se a membrana de nitrocelulose não foi preparada corretamente, haverá crescimento de esporos em torno das bordas da placa, que têm propriedades hidrofóbicas que repelem o agar MHB. Não despeje a sobreposição em cima desses esporos porque pode resultar em contaminação da sobreposição.
4. No mesmo dia em que a sobreposição é derramada, inocular um modelo de ARP/MARP fresco introduzindo 100 μL de MHB ajustada de cátion em cada poço de uma placa de 96 poços.
   Nota: Para reduzir a possibilidade de espalhar a contaminação durante o desreplicação, use uma única placa da biblioteca ARP/MARP para anular somente placas do desreplicação 2 − 3. Portanto, inocular bastante 96-bem ARP/MARP placas com base no número de cepas que serão dereplicated.
5. Pegue a placa de biblioteca ARP/MARP de estoque congelado do congelador-80 ° c. Retire o selo de alumínio antes que a condensação comece a se formar em sua parte inferior, diminuindo assim a chance de contaminar poços vizinhos na placa da biblioteca.
6. Usando estéril 96-bem fixando ferramentas (ou outras formas de equipamento de inoculação), cuidadosamente fixar a partir do estoque congelado ARP/MARP placa da biblioteca e inocular o fresco MHB-contendo 96-bem placas. Para minimizar a contaminação durante o desreplicação, prepare tantas como placas da biblioteca de ARP ou de MARP necessárias para cancelar somente placas do desreplicação 2 − 3 por a placa da biblioteca. Esterilizar as ferramentas de fixação entre a inocular cada placa.
7. Coloque um novo selo de alumínio estéril no modelo congelado uma vez completo e devolva-o ao congelador-80 ° c. Coloc as placas 96-well inoculadas dentro de um saco de plástico selado e incubar em 37 ° c com aeração (250 rpm) para 18 h.
   Nota: As placas congeladas novas da biblioteca de estoque podem ser preparadas desta etapa depois de assegurar-se de que nenhuma contaminação esteja atual. Adicione o glicerol à placa antes de armazenar a-80 ° c conforme descrito na etapa 2,5.

5. dereplicating usando o ARP/MARP

1. Remova o modelo ARP/MARP da incubadora e assegure-se de que nenhum contaminador esteja atual. Sempre dereplicate usando um modelo que é preparado recentemente e não diretamente do estoque congelado.
2. Retire as placas de desreferência a partir de 4 ° c e deixe equilibrar a temperatura ambiente. Se houver condensação, abra as tampas e deixe secar em um ambiente estéril.
3. Usando ferramentas de fixação estéreis (ou outro equipamento de inoculação), fixar da placa da biblioteca ARP/MARP na superfície da sobreposição de agar MHB das placas de desreferência. Tenha cuidado para não furar o agar. Esterilizar as ferramentas de fixação entre a inoculação de cada placa de desreferência.
4. Depois de fixar o modelo na superfície das placas de desreferência, permita que o modelo de inoculação seque por 3 − 5 min. Coloque as placas de desreferência inoculadas de cabeça para baixo em um saco plástico selado e incubar durante a noite a 37 ° c.
5. Analise os resultados do desreplicação no dia seguinte comparando o crescimento na placa de desreferência aos poços que correspondem ao mapa ARP/MARP (tabela 3 e tabela 4).

Resultados

Os seguintes resultados foram obtidos quando uma coleta de cepas produtoras de antibióticos de interesse foi desreferência utilizando o ARP e/ou MARP.

Um diagrama do fluxo de trabalho de dereplicação ARP/MARP é representado na Figura 1, e os mapas da placa de biblioteca são mostrados na figura 1 suplementar e na Figura 2 suplementar. A Figura 2 demonstra um resultado de dereplicação positiva e...

Discussão

O protocolo descrito acima pode ser aplicado à descoberta de novos compostos antimicrobianos e adjuvantes que podem ser usados em conjunto com os antibióticos existentes para resgatar sua atividade. A plataforma aproveita a especificidade elevada da carcaça de mecanismos da resistência e de seus antibióticos cognato, aos compostos do dereplicate dentro dos extratos naturais crus do produto. Embora o tempo necessário para que as placas de desreferência sejam preparadas seja longa (~ 2 semanas), o processo de derepl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Bio Shop	AGR003.5
AlumaSeal CS Films for cold storage	Sigma-Aldrich	Z722642-50EA
Ampicillin Sodium Salt	Bio Shop	AMP201.100
BBL Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted)	Becton Dickinson	212322
BBL Phytone Peptone (Soytone)	Becton Dickinson	211906
Calcium Carbonate	Bio Shop	CAR303.500
Casamino acid	Bio Basic	3060
Cotton-Tipped Applicators	Fisher Scientific	23-400-101
CryoPure Tube 1.8 mL mix.colour	Sarstedt	72.379.992
D-glucose	Bio Shop	GLU501.5
Disposable Culture Tube, 16 mm x 100 mm	Fisher Scientific	14-961-29
Ethyl Alcohol Anhydrous	Commercial Alcohols	P016EAAN
Glass Beads, Solid	Fisher Scientific	11-312C
Glycerol	Bio Shop	GLY001.4
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Instant sealing sterilization pouch	Fisher Scientific	01-812-54
Iron (II) Sulfate Heptahydrate	Sigma-Aldrich	F7002-250G
Kanamycin Sulfate	Bio Shop	KAN201.50
LB Broth Lennox	Bio Shop	LBL405.500
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Fisher Scientific	M63-500
MF-Millipore Membrane Filter, 0.45 µm pore size	Millipore-Sigma	HAWP00010	10 FT roll, hydrophillic, white, plain
Microtest Plate 96 well, round base	Sarstedt	82.1582.001
New Brunswick Innova 44	Eppendorf	M1282-0000
Nunc OmniTray Single-Well Plate	Thermo Fisher Scientific	264728	with lid, sterile, non treated
Petri dish 92 mm x 16 mm with cams	Sarstedt	82.1473.001
Pinning tools	ETH Zurich	-	Custom order
Potassium Chloride	Fisher Scientific	P217-500
Potato starch	Bulk Barn	279
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358-10
Sodium Nitrate	Fisher Scientific	S343-500
Wood Applicators	Dukal Corporation	9000
Yeast Extract	Fisher Scientific	BP1422-2