Detecção de Progressão do Tumor Pulmonar em Camundongos por ultrassom

Resumo

Este protocolo descreve as medidas tomadas para induzir tumores pulmonares KRAS em camundongos, bem como a quantificação de tumores formados por ultrassom. Pequenos tumores são visualizados nos primeiros tempos como linhas B. Em momentos posteriores, as medidas relativas do volume tumoral são alcançadas pela ferramenta de medição no software de ultrassom.

Resumo

Com ~1,6 milhão de vítimas por ano, o câncer de pulmão contribui tremendamente para a carga mundial do câncer. O câncer de pulmão é parcialmente impulsionado por alterações genéticas em oncogenes como o oncogene KRAS, que constitui ~25% dos casos de câncer de pulmão. A dificuldade em mirar terapêuticamente o câncer de pulmão orientado pelo KRAS em parte decorre de ter modelos ruins que podem imitar a progressão da doença em laboratório. Descrevemos um método que permite a quantificação relativa dos tumores pulmonares KRAS primários em um modelo de rato LSL-KRAS G12D cre-induável através de imagens de ultrassom. Este método depende da aquisição do modo de brilho (B) do parenchyma pulmonar. Os tumores que são inicialmente formados neste modelo são visualizados como linhas B e podem ser quantificados contando o número de linhas B presentes nas imagens adquiridas. Estes representariam o número relativo do tumor formado na superfície do pulmão do rato. À medida que os tumores formados se desenvolvem com o tempo, eles são percebidos como fendas profundas dentro do parenchyma pulmonar. Uma vez que a circunferência do tumor formado é bem definida, calcular o volume relativo do tumor é alcançado medindo o comprimento e largura do tumor e aplicando-os na fórmula utilizada para medições de caliper tumoral. A imagem de ultrassom é uma técnica não invasiva, rápida e fácil de usar que é frequentemente usada para quantificações tumorais em camundongos. Embora os artefatos possam aparecer ao obter imagens de ultrassom, mostrou-se que essa técnica de imagem é mais vantajosa para quantificações tumorais em camundongos em comparação com outras técnicas de imagem, como imagens de tomografia computadorizada (TC) e imagem de bioluminescência (BLI). Os pesquisadores podem investigar novos alvos terapêuticos usando essa técnica comparando a iniciação do tumor pulmonar e a progressão entre diferentes grupos de camundongos.

Introdução

Como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, o câncer de pulmão permanece refratário aos tratamentos, principalmente pela falta de modelos pré-clínicos relevantes que possam recapitular a doença no laboratório¹. Cerca de 25% dos casos de câncer de pulmão são devido a mutações no oncogene KRAS². O câncer de pulmão orientado por KRAS está frequentemente associado ao mau prognóstico e baixa resposta à terapia, destacando a importância de estudos adicionais nesta doença².

Otimizamos um método que permite a avaliação relativa do crescimento do tumor pulmonar em tempo real em camundongos imunes induzidos pelo câncer de pulmão do KRAS. Usamos ratos Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) nos quais o oncogene KRAS G12D pode ser expresso pelos vetores cre lentiviral^3,4. Esses vetores são impulsionados pela anidrise carbônica 2, permitindo que a infecção viral ocorra especificamente nas células epiteliais aveolar⁵. Além disso, para acelerar a iniciação e progressão de tumores pulmonares, a construção lentiviral também expressa P53 shRNA de um promotor U6/H1 (a construção lentiviral aqui será referida como Ca2Cre-shp53)⁶. A relevância biológica desse método está no curso natural do desenvolvimento de tumores pulmonares em camundongos em oposição a xenôenxetos de tumores não ortotópicos em camundongos. Um obstáculo usando o método ortotópico é monitorar o crescimento do tumor pulmonar sem sacrificar o camundongo. Para superar essa limitação, otimizamos a ultrassom para permitir a análise da progressão do tumor pulmonar no modo bidimensional (2D) neste modelo de camundongo. A imitência de tumores a 7 semanas após a infecção se reflete como linhas B em imagens de ultrassom, que podem ser contadas, mas não refletirão o número exato de tumores presentes no pulmão. As linhas B são caracterizadas por linhas brancas verticais semelhantes a laser decorrentes da linha pleural na parenchyma^{pulmonar 7,8}. Tumores grandes podem ser visualizados após 18 semanas de infecção. O volume relativo desses tumores é quantificado por medidas 2D feitas no ultrassom.

Este método é ótimo para pesquisadores que investigam o efeito de drogas farmacológicas no crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D. Além disso, a progressão do tumor pulmonar pode ser comparada entre camundongos com diferentes linhagens genéticas, para examinar a importância da presença ou ausência de certos genes/proteínas no desenvolvimento do volume de tumores pulmonares.

Protocolo

Os estudos em animais foram realizados de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade McGill e os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade McGill (protocolo de uso animal nº 2009-5754).

1. Geração de CA2Cre-shp53 Titre Lentiviral

NOTA: O seguinte protocolo é o mesmo descrito em Xia et al.^6,com pequenas modificações.

1. Preparação do lentivírus (para pratos de 15 cm x 10 cm)
   1. No dia 1, as células HEK293T saudáveis (7,5 x 10⁶ células por prato de 10 cm) com 10 mL do meio eagle modificado de Dulbecco) (DMEM), 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% de caneta/estrep. Cultura em uma incubadora de 37 °C, 5% CO_2.
   2. Prepare a mistura para transfecção de cálcio-fosfato (mistura para 15 pratos). Prepare tubo A contendo 225 μg (15 μg/placa) do vetor lentiviral (Ca2Cre-shp53), 75 μg (5 μg/placa) de plasmídeo PsPAX2 (contendo mordaça HIV-1 e genes HIV-1 pol), 75 μg (5 μg/placa) de pMD2.G plasmid (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, plasmídeo pMD2.G (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, plasmídeo pMD2.G (contendo gene VSV-G) para embalagem, embalagem, uma concentração final de 0,15 M de CaCl₂ e encha o tubo com H₂O destilado até 3,75 mL. Prepare o tubo B contendo 3,75 mL de salino tampão de 2x HEPES (HBS; 50 mM HEPES, pH 7.05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mM Na₂HPO₄·2H₂O e 12 mM D-dextrose).
   3. Tubo de vórtice A e adicioná-lo em sentido de gota para tubo B vórtice contínua.
      NOTA: O volume total será de 7,5 mL.
   4. Incubar à temperatura ambiente no escuro por 20-30 min.
   5. Aproximadamente 9 h após o revestimento das células, adicione 500 μL da mistura de transfecção em sentido para o meio celular (7,5 mL/15 pratos: 0,5 mL por prato).
   6. Gire suavemente cada prato para misturar, e incubar todos os pratos a 37 °C, 5% CO₂.
   7. No dia 2, 12-18 h após a transfecção, substitua a mídia por 10 mL de mídia de soro reduzido soro(Tabela de Materiais)sem antibióticos por prato de 10 cm. Coloque os pratos de volta na incubadora 37 °C, 5% CO_2.
   8. No dia 3, colete a mídia contendo lentivírus expressando Ca2Cre-shp53 e filtrar através de filtros de 0,45 μm. Reponha a mídia com novos meios de comunicação de soro reduzidos sem antibióticos.
      NOTA: Os meios arrecadados podem ser mantidos a 4 °C por no mais de 3 dias.
   9. No dia 4, colete, pela segunda vez, a mídia contendo o lentivírus e o filtro através de um filtro de 0,45 μm. Mantenha-se a 4 °C (por no mais de 3 dias).
   10. Combine os supernatantes do vírus das etapas 1.1.8 e 1.1.9. Concentre-os através de unidades de filtro centrífugas (Tabela de Materiais) por centrifuging a 1.372 x g por 30 min a 4 °C. Repita o processo até que todos os meios de comunicação coletados passem pelas colunas.
       NOTA: Após cada centrífuga, 100-200 μL de filtragem concentrada podem ser colhidos.
   11. Colete e misture os filtrados concentrados em um tubo gelado de 15 mL. Misture bem as lentivírus concentradas e, em seguida, aliquot (por exemplo, 100 μL/tubo). Loja a -80 °C.
2. Titulação lentiviral
   NOTA: Fibroblastos embrionários de camundongos imortalizados (MEFs) expressando uma alelo ladeada de proteína fluorescente verde (GFP) são usados neste protocolo para a quantificação do titer viral. No entanto, qualquer linha celular com um loxP-GFP allele deve ser adequada para esta etapa.
   1. Células culturais expressando um loxP-lacrado de GFP com DMEM, 10% FBS e 1% caneta/estreptococo a 37 °C, 5% CO₂.
   2. Placa 2 x 10⁵ células em dois poços de 50 mm de uma placa de 6 poços.
      NOTA: As células de um poço serão usadas para infecção lentiviral, enquanto a do outro será usada como controle negativo.
   3. No dia seguinte, reponha as células com 2 mL de DMEM, 10% FBS e 1% de caneta/estreptococos 2 h antes da infecção lentiviral.
   4. Adicione 20 μL do micivírus CA2Cre-shp53 (o volume pode variar quando necessário) no poço da infecção lentiviral.
   5. Após 3 dias na cultura, determine a frequência das células GFP-positivas induzidas pelo Cre por citometria de fluxo, como mostrado na Figura 1. Lave células com soro lona -pbs tampão de fosfato (PBS), desapegue-se por trippsinização e colete células por centrífuga em 112 x g.
   6. Lave as células duas vezes com PBS. Por fim, suspenda as células em 100 μL de PBS. Determine o percentual de células gfp positivas por um analisador de células (Tabela de Materiais).
   7. Calcule o titer infeccioso/funcional do lentivírus usando a seguinte fórmula:
      
      onde F é a frequência de células GFP-positivas e calculada subtraindo a frequência de células GFP -positivas após a infecção (Fi) a partir da frequência de células gfp-positivas (fundo) antes da infecção (Fc) como mostrado na Figura 1 (F = Fi-Fc), cn é o número de células emplacadas (2 x 10^5),V é o volume do inoculum (mL), e DF é o fator de diluição do vírus.
      NOTA: A concentração infecciosa/funcional = ~2 x 10⁶ TU/mL.

2. Intubação Intratracal de Lentivírus em camundongos LSL-KRAS^G12D

NOTA: O método de intubação intratracal foi utilizado conforme descrito no protocolo publicado por Vandivort et al.⁹. Neste protocolo, camundongos camundongos LSL-KRAS^G12D em fundo C57BL/6 são usados aos 6 e 8 semanas de idade. Um quadro de procedimentos de trabalho caseiro é usado como descrito em Vandivort et al.⁹. A placa está posicionada na frente do experimentador em um espaço de trabalho conveniente (aproximadamente 1 m²).

1. Prepare um espipirômetro removendo o êmbolo de uma seringa de 1 mL e carregando 60 μL de PBS na seringa.
2. Coloque uma ponta de cateter de 22 G na seringa e reserve.
3. Anestesiados os camundongos por injeção intraperitoneal de um coquetel de 1 μL/g de peso corporal do camundongo de cetamina (50 mg/mL)/xiylazine (5 mg/mL)/acepromazina (1 mg/mL). Certifique-se adequada do camundongo por uma baixa taxa respiratória (1 hálito a cada 2 s).
4. Aspirar 20 μL de lentivírus CA2Cre-shp53 em um pipettor e reserve.
5. Posicione o mouse sedado na placa de procedimento de trabalho, fisando seus incisivos superiores no fio da placa.
   NOTA: O dorsum do mouse deve ser plano contra a plataforma.
6. Afina a parte caudal da cavidade torácica à plataforma para garantir o alinhamento do mouse durante o procedimento.
7. Ajuste um iluminador de pescoço de ganso entre 80-100% de intensidade e coloque a luz de 1-2 cm da superfície da pele.
8. De trás da plataforma, tire a língua da cavidade oral do mouse usando fórceps estéreis.
9. Ao proteger a língua, insira um depressor na cavidade oral do rato e solte a língua.
10. Posicione o pescoço de ganso no brônquio de haste principal para iluminar a traqueia.
    NOTA: A traqueia pode ser visível através da ação de respiração, causando flutuação da luz.
11. Quando a traqueia é claramente vista, insira o espirômetro preparado (seringa com PBS e cateter) no caminho traqueal.
12. Retire o depressor e observe o aumento e queda de PBS na seringa a cada respiração.
    NOTA: Este é um indicador de que o cateter está devidamente posicionado na traqueia.
13. Remova a seringa contendo PBS mantendo o cateter dentro da traqueia como a posição anterior.
14. Deposite o lentivírus CA2Cre-shp53 de 20 μL no centro do cateter.
15. Mantendo o cateter no lugar, injete 300 μL de ar no cateter usando uma seringa vazia para garantir a distribuição adequada do lentivírus nos pulmões.
16. Mantenha o cateter no lugar e reinsira o espirômetro no cateter.
    NOTA: A elevação e queda da bolha pbs garantirá que o procedimento seja bem sucedido.
17. Remova o cateter e a fita. Coloque o animal em um lugar quente e seco até que ele seja revivido.

3. Ultrassom de Tumores Pulmonares em Camundongos

NOTA: A ultrassom foi realizada após 7 e 18 semanas de intubação lentiviral utilizando o sistema listado em Tabela de Materiais; no entanto, qualquer modelo pode ser usado para a análise.

1. Um dia antes da imagem, remova a pele da área torácica do rato entubado.
   NOTA: O mouse deve ser sedado durante esta etapa colocando-os em uma câmara de indução de 3% isoflurane e 2L/minuto O₂.
2. No dia da imagem, configure o espaço de trabalho como mostrado na Figura 2. Ligue a bomba de aquecimento para gel de ultrassom e o monitor de temperatura.
3. Configure uma incubadora quente de 33 °C para colocar os ratos em pós-imagem.
4. Coloque o motor tridimensional (3D)(Figura 2F)no sistema ferroviário integrado.
5. Certifique-se de que o motor 3D e o sistema de montagem transdutor estejam firmemente no lugar.
6. Conecte um transdutor preferido (frequência: 40 MHz; Figura 2E e Tabela de Materiais) para medições tumorais perpendiculares para o motor 3D.
7. Inicie um novo estudo sobre o software de ultrassom.
   1. Selecione O Navegador de Estudoe selecione novo na parte inferior da tela.
   2. Selecione Novo Estudo, uma nova janela aparecerá que permite a adição de um Nome de Estudo, além de mais informações sobre o estudo, ou seja, data de estudo, nome de pesquisador, etc.
   3. Preencha as informações em Nome da Série, ou seja, Animal ID, Strain, Peso, Data de Nascimento, etc.
   4. Select Done, o programa mudará para o modo B.
8. Coloque uma lâmpada de aquecimento em uma posição conveniente acima da plataforma animal.
9. Coloque o rato na câmara de indução (3,5% isoflurane).
   NOTA: A anestesia adequada é confirmada pela inconsciência do camundongo e uma taxa respiratória mais lenta de cerca de 1 respiração por 2 segundos.
10. Quando o mouse está sedado, mude a conexão da máquina anestéstica para ser direcionada para a plataforma animal, reduza o isoflurano para 2,5%.
11. Coloque o mouse na plataforma animal em ventral decubitus, com sua cavidade oral direcionada para o tubo de anestésicos.
12. Aplique lubrificante nos olhos do rato.
13. Coloque o mouse em dorsal dedecubíto e afina as mãos e os pés firmemente na plataforma animal.
14. Aplique uma pequena camada de gel de ultrassom no peito do rato.
15. Abaixe a sonda de aquisição usando o botão de controle de altura para tocar na superfície do peito do rato. Posicione a sonda de tal forma que o coração do rato é aproximadamente centrado.
16. Use os microbotões para adquirir imagens de todo o peito, de ambas as extremidades, na orientação transversa idealmente reunindo 500 quadros por mouse (número de quadros pode variar dependendo da escolha pessoal).
17. Uma vez feito a imagem, remova o gel do peito do mouse e coloque o mouse na incubadora quente.

Análise 2D de Imagens de Ultrassom

1. Depois de abrir quadros adquiridos no software de ultrassom, escaneie os quadros para tumores.
2. Para pequenos tumores iniciantes, conte o número de linhas B periodicamente a cada 10 quadros para o comprimento total dos 500 quadros adquiridos.
   Portanto, as linhas B são contadas em um total de 50 imagens, cada imagem é separada por 10 quadros. As linhas B são caracterizadas por linhas retas brancas longitudinal que atravessam totalmente a tela.
3. Para medições 2D de tumores grandes, selecione a ferramenta linear e meça a largura e o comprimento do tumor presentes.
4. Para calcular o volume dos tumores, use a seguinte fórmula:
   
   onde L e W são o comprimento e largura do tumor, respectivamente.

Resultados

Depois de obter um díter infeccioso lentiviral de ~2 x 10⁶ TU/mL (Figura 1),o lentivírus Ca2Cre-shp53 foi injetado intratrachealmente quando os ratos LSL-KRAS G12D atingiram uma idade apropriada (6-8 semanas)⁹. A ultrassonografia foi realizada após 7 semanas de infecção após o início dos tumores (Figura 3B). A imagem foi feita em 7 semanas para incluir os vários tipos de lesões precursoras que ocorrem ...

Discussão

Demonstramos um método que pode avaliar o crescimento do tumor pulmonar no modelo de camundongos LSL-KRAS G12D cre-indutor por ultrassom. Este método pode ser usado para avaliar o efeito dos inibidores farmacológicos no crescimento do tumor pulmonar. Também pode ser usado para comparar o crescimento do tumor pulmonar entre camundongos de diferentes origens genéticas. O uso dessa técnica não requer habilidades computacionais especializadas, no entanto, é importante ser sistemático no número de quadros utilizados...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters	Pall Corporation	PN 4614
100-mm Cell Cultre Plate	CELLSTAR	664 160
6-well Cell Culture Plate	CELLSTAR	657 160
Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units	Merck Millipore Ltd.	UFC910024
BD LSR-Fortessa	BD Biosciences	649225B 3024
CA2Cre-shp53 lentiviral vector			From Dr. I Verma Laboratory
DMEM	Multicell	319-005-CL
FBS	Multicell	80450
LSL-KRASG12D mouse	JAX Mice	8179
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz	FUJIFILM VisualSonics	51070
OptiMEM	gibco	11058-021
Pen/strep	Multicell	450-201-EL
pMD2.G	Addgene	12259
PsPAX2	Addgene	12260
VEVO-3100	FUJIFILM VisualSonics	51072-50