In Vivo Infecção com Leishmania amazonensis avaliará virulence parasita em camundongos

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo compilado para avaliar a infecção cutânea de camundongos com Leishmania amazonensis. Este é um método confiável para estudar a virulência parasite, permitindo uma visão sistêmica da resposta do hospedeiro vertebrado à infecção.

Resumo

Leishmania spp. são parasitas protozoários que causam leishmanioses, doenças que apresentam um amplo espectro de manifestações clínicas, desde lesões cutâneas até viscerais. Atualmente, estima-se que 12 milhões de pessoas estejam infectadas pela Leishmania em todo o mundo e mais de 1 bilhão de pessoas vivem em risco de infecção. A leishmania amazonensis é endêmica na América Central e do Sul e geralmente leva à forma cutânea da doença, que pode ser diretamente visualizada em um modelo animal. Portanto, as cepas de L. amazonensis são bons modelos para estudos de leishmaniose cutânea, pois também são facilmente cultivados in vitro. Camundongos C57BL/6 imitam a progressão da doença orientada por L. amazonensisobservada em humanos e são consideradas um dos melhores modelode cepas de camundongos para leishmaniose cutânea. No hospedeiro vertebrado, esses parasitas habitam macrófagos apesar dos mecanismos de defesa dessas células. Diversos estudos utilizam ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar a infectividade do parasita em diferentes condições. No entanto, a abordagem in vitro limita-se a um sistema celular isolado que desconsidera a resposta do organismo. Aqui, compilamos um método de infecção por murina in vivo que fornece uma visão geral fisiológica sistêmica da interação hospedeiro-parasita. O protocolo detalhado para a infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis compreende diferenciação parasite em amastigotes infecciosos, inoculação cutânea do pé de camundongos, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Propomos esse método bem estabelecido como o método mais adequado para estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à leishmaniose cutânea.

Introdução

Os leishmanioses são doenças infecciosas parasitárias predominantes mundialmente representando desafios importantes nos países em desenvolvimento e são reconhecidas como uma das doenças tropicais negligenciadas mais importantes pela Organização Mundial da Saúde^1,2. Os leishmanioses são caracterizados por manifestações cutâneas, mucosas e/ou viscerais. Leishmaniose cutânea geralmente é causada por L. amazonensis, L. mexicana, L. braziliensis, L. guyanensis, L. major, L. tropica e L. aethiopica³. Esta forma da doença é muitas vezes auto-curativa em humanos devido à indução da resposta imune celular protetora. No entanto, a resposta imune celular pode falhar, e a doença pode progredir para a leishmaniose cutânea disseminada^4,5. Não há vacina disponível devido à diversidade entre espécies de Leishmania e hospedam origens genéticas^6,7. As opções de tratamento também são limitadas, pois a maioria dos medicamentos disponíveis atualmente são caros, tóxicos e/ou podem exigir tratamento de longo prazo^8,9. Além disso, houve relatos de resistência medicamentosa contra os tratamentos disponíveis^10,11.

O agente causal da leishmaniose é o parasita protozoário Leishmania. O parasita apresenta duas formas morfológicas distintas em seu ciclo de vida: promastigotes, a forma flagelada encontrada em moscas de areia; e amastigotes, a forma intracelular encontrada nos vacuoles parasitophorosos dos macrófagos hospedeiros de mamíferos^12,13. A capacidade dos amastigotes de invadir, sobreviver e replicar apesar dos mecanismos de defesa dos macrófagos do hospedeiro vertebrado estão sujeitas a muitos estudos^14,15,16,17. Consequentemente, vários grupos de pesquisa têm descrito ensaios de infecção por macrófagos in vitro para avaliar o impacto de fatores ambientais específicos, bem como genes parasitas e hospedeiros na infectividade do parasita. Este ensaio apresenta várias vantagens, como a capacidade de adaptar estudos a um formato de alto desempenho, período de tempo relativamente menor para obter resultados, e número reduzido de animais de laboratório sacrificados¹⁸. No entanto, os achados dos ensaios in vitro são limitados porque nem sempre se replicam nos estudos vivo^14,19,20,21. Em ensaios vivos fornecem uma visão geral fisiológica sistêmica da interação host-parasita, que não pode ser totalmente imitada por ensaios in vitro. Por exemplo, estudos imunológicos podem ser realizados através de ensaios imunohistoquímicos de seções de tecido de pisque coletados ou até mesmo de linfonodos popliteis para análise das células imunes recuperadas²².

Os animais são frequentemente usados como modelo para doenças humanas em pesquisas biológicas e biomédicas para entender melhor os mecanismos fisiológicos subjacentes das doenças²³. No caso da leishmaniose, a rota, local ou dose de inoculação influenciam o desfecho da doença^24,25,26,27. Além disso, a suscetibilidade e a resistência à infecção em humanos e camundongos são altamente reguladas pelos antecedentes genéticos do hospedeiro e parasita^{4,5,22,28,29,30,31}. Os camundongos BALB/c são altamente suscetíveis à infecção cutânea de L. amazonensis, mostrando uma rápida progressão da doença com a disseminação dos parasitas para os linfonodos, baço e fígado³². Como a doença pode progredir para metástases cutâneas, a infecção pode ser fatal. Em contraste, os camundongos C57BL/6 geralmente desenvolvem lesões crônicas com cargas de parasitas persistentes em ensaios de infecção por L. amazonensis ³³. Assim, a infecção por L. amazonensis com essa espécie de camundongos em particular tem sido considerada um excelente modelo para estudar formas crônicas de leishmaniose cutânea em humanos, pois imita melhor a progressão da doença do que o modelo de infecção por camundongos BALB/C^5,34.

Por isso, propomos que a murina na infecção vivo seja um método útil para estudos fisiológicos de virilidade leishmania aplicáveis à doença humana, permitindo uma visão sistêmica da interação hospedeiro-parasita. Revisitando ensaios bem estabelecidos^22,apresentamos aqui um protocolo compilado passo a passo da infecção in vivo de camundongos C57BL/6 com L. amazonensis que compreende a diferenciação parasita em amastigotes axenic, ambulatora cutânea cutânea cutânea, desenvolvimento de lesões e determinação de carga parasite. Este protocolo pode ser adaptado a outras cepas de camundongos e espécies de Leishmania que causam leishmanioses cutâneas. Em conclusão, o método aqui apresentado é crucial para identificar novas metas e vacinasanti-Leishmania, bem como em estudos fisiológicos das respostas imunes e metabólicas do hospedeiro à infecção por Leishmania.

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Protocolo

Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto de Biociência da Universidade de São Paulo (CEUA 342/2019), e foram conduzidos de acordo com as recomendações e as políticas de Cuidado e Uso de Animais Laboratoriais do Estado de São Paulo (Lei Estadual 11.977, lei Estadual 11.977, de 25/08/2005) e do governo brasileiro (Lei Federal 11.794, de 08/10/2008). Todas as etapas descritas nas seções 1-5 devem ser realizadas de forma asséptica dentro de armários de fluxo laminar. Os equipamentos de proteção individual devem ser utilizados durante o manuseio de parasitas leishmania vivos.

1. Diferenciação In Vitro de L. amazonensis Promastigotes em Amastigotes Axenic^{15,20,35,36,37,38}

NOTA: L. amazonensis (MHOM/BR/1973/M2269) (La) parasita foi usado neste ensaio. Dependendo do propósito do estudo, a forma de parasita infecciosa pode ser obtida seja pela purificação da forma metacíclica utilizando um gradiente de densidade, como descrito anteriormente¹⁴, ou por diferenciação de promastigotes em amastigotes axenic, de acordo com o seguinte protocolo.

1. Grow La promastigotes em um frasco de cultura celular de 25 cm² contendo 10 mL de médio para promastigotes (pro-médio) (pH = 7,0).
2. Incubar a 25 °C por 3 dias.
   NOTA: Use culturas promastigotas que foram periciadas in vitro menos de 10x para evitar a perda de virulência e alterações aneuploidy de parasitas^{39,40,41,42,43,44}.
3. Pipette 5 mL de cultura promastigote fase de crescimento logarítmico em um novo frasco de 25 cm^2.
4. Adicione 5 mL de média para amastigotes axenic (ama-médio) (pH = 5,2).
5. Incubar a 34 °C por 3-4 dias.
6. Divida a cultura diluindo com ama-médio a uma proporção de 1:3 em um novo frasco de 25 cm^2.
7. Incubar a 34 °C por 3-5 dias.
   NOTA: Incubar os amastigotes axenic por até 5 dias, pois representa o fim do amadurecimento³⁷.

2. Infecção por Pé c57BL/6 com L. amazonensis

NOTA: Camundongos C57BL/6 femininos (6 a 8 semanas) foram obtidos e mantidos no Centro Animal do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo. Os animais receberam comida e água ad libitum.

1. Conte a cultura dos amastigotes axenic transferindo uma alíquota da suspensão do parasita diluída na PBS para uma câmara de Neubauer (ou seja, hemocímetro). Conte os parasitas não flagrados, que representam formas de amastigotes.
   NOTA: Alternativamente, o Trypan azul (1:1) pode ser usado para contar o número de amastigotes viáveis (ou seja, aqueles que não estão manchados com azul Trypan).
2. Diluir os amastigotes axenic em PBS de acordo com a dose inólquia desejada e o número de inóculos pretendidos (1 x 10⁶ amastigotes axenic em 50 μL de PBS é recomendado).
3. Carregue uma seringa de tubécula com uma agulha de 27 G com a suspensão preparada do parasita.
4. Anestesiar um mouse C57BL/6 usando 3-5% isoflurane, conforme recomendado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Johns Hopkins⁴⁵. Avalie a profundidade anestéstica testando a resposta do mouse a uma pitada de dedo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo do dodo do dedo.
5. Inocular 50 μL da suspensão de parasitas homogeneizada (1 x 10⁶ amastigotes axenic ou a dose inólmétrica desejada) no tecido subplantar do footpad traseiro esquerdo, utilizando a seringa de tubéculina previamente carregada (passo 2.3).

3. Desenvolvimento de Lesões de Pé de Rato

1. Meça a progressão da lesão uma vez por semana medindo a espessura das pastilhas esquerda (infectada) e direita (não infectada) usando uma pinça.
2. Calcule a diferença da espessura entre os peões traseiros esquerdo e direito semanalmente para avaliar a progressão da lesão.
3. Traçar as diferenças calculadas sobre o eixo Y e o tempo de infecção no eixo X e calcular o significado estatístico.
   NOTA: De acordo com as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais, os animais devem ser sacrificados antes que a lesão infectada se torne ulcerada, pois úlceras cutâneas podem levar à infecção secundária. Como mostrado na Figura Complementar 1,leva aproximadamente 10 semanas para as lesões apresentarem sinais de ulceração com a dose de parasita (10⁶ amastigotes axenic) e cepa hospedeira (C57BL/6) utilizadaneste protocolo. Os camundongos devem ser sacrificados para extração de lesões antes que os sinais de ulceração sejam observados.

4. Extração de Lesão de Pé de Camundongos e Diluição limitante do parasita

1. Prepare uma placa de 96 poços (fundo plano) para o ensaio de diluição limitante^46,47 adicionando 180 μL de pró-médio a todos os poços.
   NOTA: Use quatro faixas de placa (metade da placa) para cada animal, representando ensaios quadruplicates (ou seja, animal 1 = faixas A-D; animal 2 = faixas E-H).
2. Adicione 1 mL de pró-médio em um tubo moedor de tecido de vidro por lesão e pesar o tubo.
   NOTA: O tubo deve ser mantido estéril, por isso use uma tampa estéril e pese o tubo com a tampa fechada, se pesar fora do armário de fluxo laminar.
3. Sacrifique o animal em uma câmara de CO_2, seguindo as recomendações dos Comitês de Cuidados e Uso de Animais. Desinfete o animal pulverizando com 70% de etanol.
4. Excir o pé do animal para extrair o footpad infectado e pulverizar 70% de etanol no footpad para desinfecção. Certifique-se de esterilização de tesouras e fórceps mantendo-as encharcadas em 70% de etanol.
5. Coloque o footpad infectado em uma placa de Petri estéril e disseque usando fórceps estéreis e um bisturi para coletar todos os tecidos moles. Descarte os ossos.
   NOTA: Recomenda-se uniformidade na etapa de dissecção para evitar a recuperação do tecido tendencioso.
6. Transfira os tecidos coletados para o tubo moedor de tecido de vidro com pró-médio e, em seguida, pese o tubo novamente para determinar o peso da lesão.
   NOTA: Evite colocar os fórceps e bisturi diretamente no meio, pois pequenos volumes podem ser removidos, resultando em um peso tecido subestimado. O peso da lesão é calculado subtraindo o peso do tubo contendo pró-médio com o tecido coletado do peso do tubo contendo apenas pró-médio.
7. Homogeneize o tecido de 10x usando o moedor para interrupção completa do tecido.
8. Deixe a mistura sedimentar por 10 min, depois cole 20 μL do supernatante.
9. Carregue 20 μL do supernatant na^1ª coluna da^1ª pista da placa de poço 96 preparada na etapa 4.1. Repita isso para as próximas três pistas para ter quadruplicatos para cada animal (ou seja, para animal 1 adicionar 20 μL a cada poço e rotular A1, B1, C1 e D1).
10. Homogeneize cada poço na^1ª coluna 10x usando uma pipeta multicanal. Em seguida, transfira 20 μL das amostras diluídas da^1ª coluna para a^coluna 2.
    NOTA: É importante homogeneizar cada poço de 10x de uma coluna para outra.
11. Repita a etapa 4.10 para todas as colunas restantes até a última coluna⁽¹²⁾e descarte os 20 μL finais de amostra diluída.
    NOTA: Altere as dicas após cada diluição para evitar contaminação cruzada.
12. Selar as placas com um filme e incubar a 25 °C por 7 dias em uma câmara úmida.

5. Determinação de carga de parasitas de lesão

1. Analise as placas após 7 dias de incubação usando um microscópio invertido para determinar o último poço contendo parasitas para cada pista.
   NOTA: Também é possível ter uma indicação do crescimento dos parasitas, ou densidade celular, por análise visual das mudanças de cor e turbidez do meio.
2. Calcule a carga de tecido parasita para cada pista dividindo o fator de diluição por peso de lesão.
   NOTA: Em uma pista específica, se os parasitas estiverem presentes apenas nas colunas 1-5 (ou seja, os poços A1-A5 são positivos para o crescimento do parasita), isso significa que a coluna 5 continha apenas 1 parasita, a coluna 4 continha 10 parasitas, e assim por diante, em múltiplos de dez. A coluna 1 conteria 10⁴ parasitas, o que representa o número de parasitas nos 20 μL iniciais de supernatant (a amostra não diluída na etapa 4.7). Como este 20 μL foi diluído com 180 μL de pró-médio, o tubo inicial continha 5 x 10⁵ parasitas: (1 x 10⁴) / (0,02 mL) = 5 x 10⁵ parasitas/1 mL. Em seguida, a carga de parasitas nessa lesão pode ser calculada dividindo a concentração inicial do parasita pelo peso da lesão: (5 x 10⁵) / peso da lesão (ver passo 4.6).
3. Traçar a média do resultado quadruplicado para cada animal com uma escala Y log.

6. Análise Estatística

1. Represente os dados como um desvio padrão ± médio usando pelo menos cinco animais por grupo experimental como replica.
2. Realizar análiseestatística utilizando teste de duas caudas não emparelhado, considerando um valor p < 0,05 como significativo.

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Resultados

Parasitas protozoários de leishmania existem em duas formas de desenvolvimento durante seu ciclo de vida em hospedeiros invertebrados e vertebrados: promastigotes, as formas proliferativas encontradas no lúmen da sandfly fêmea; e amastigotes, as formas proliferativas encontradas nos vacúrios parasitophorosos das células hospedeiras dos mamíferos. Os promastigotes têm um corpo alongado de aproximadamente 1,5 μm de largura e 20 μm de comprimento, com um flagellum tipicamen...

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Discussão

O ensaio de infecção in vivo descrito neste protocolo permite que qualquer pesquisador avalie na leishmaniose cutânea vivo considerando a interação hospedeiro-parasita em um cenário sistêmico. Esses ensaios têm sido utilizados por muitos grupos^{22,24,27,29,31,32,34,}

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner bio-ne	655180	A flat-bottom plate for limiting dilution assay
adenine	Sigma	A8626	Supplement added to M199 cell culture media
caliper	Mitutoyo	700-118-20	A caliper to measure the thickness of footpad
cell culture flask	Corning	353014	A 25 cm2 volume cell culture flask to cultivate Leishmania parasite
centrifuge	Eppendorf	5804R	An equipament used for separating samples based on its density
CO2 incubator 34 °C	Thermo Scientific	3110	An incubator for amastigotes differentiation
ethanol	Merck	K50237083820	A disinfectant for general items
fetal bovine serum	Gibco	12657-029	Supplement added to M199 cell culture media
glass tissue grinder tube	Thomas Scientific	3431 E04	A tube to collect and disrupt infected footpad tissue
glucose	Synth	G1008.01.AH	Supplement added to M199 cell culture media
GraphPad Prism Software	GraphPad		A software used to plot the data and calculate statistical significance
hemin	Sigma	H-2250	Supplement added to M199 cell culture media
HEPES	Promega	H5303	Supplement added to M199 cell culture media
incubator 25 °C	Fanem	347CD	An incubator for promastigotes cultivation
inverted microscope	Nikon	TMS	An equipament used to visual analyze the promastigote and amastigote cultures
isoflurane			An inhalant anesthetics for mice (3-5%)
laminar flow cabinet	Veco	VLFS-09	A biosafety cabinet used for aseptical work area
M199 cell culture media	Gibco	31100-035	A cell culture media for Leishmania cultivation
microcentrifuge tube	Axygen	MCT150C	A microtube used for sample collection, processing and storage
multichanel pipette	Labsystems	F61978	A multichannel pipette used for limiting dilution assay
NaHCO3	Merck	6329	Supplement added to M199 cell culture media
NaOH	Sigma	S8045	Supplement added to M199 cell culture media
Neubauer chamber	HBG	2266	A hemocytometer to count the parasite suspension
optical microscope	Nikon	E200	An optical equipament used to count parasite
parafilm	Bemis	349	A flexible and resistant plastic to seal the plate
penicillin/streptomycin	Gibco	15140122	Supplement added to M199 cell culture media
Petri dishes	TPP	93100	A sterile dish to dissect the footpad tissue
pipetman kit	Gilson	F167360	A micropipette kit containing four pipettors (P2 P20 P200 P1000)
scale	Quimis	BG2000	An equipament used to weigh collected footpad lesions
scalpel	Solidor	10237580026	A scalpel to cut and collect footpad tissue
serological pipette 10 mL	Nest	327001	A sterile pipette used for transfering mililiter volumes
tips	Axygen		A pipette tip used for transfering microliter volumes
Trypan blue	Gibco	15250-061	A dye used to count viable parasites
trypticase peptone	Merck		Supplement added to M199 cell culture media
tuberculin syringe	BD	305945	A syringe with 27G needle to inoculate the parasite suspension