Analisando tumor e distribuição de tecidos de anticorpo terapêutico específico de antígeno alvo

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para estudar a localização in vivo de anticorpos em modelos de xenoenxerto de tumores de camundongos.

Resumo

Anticorpos monoclonais são drogas multifuncionais de alta afinidade que trabalham por mecanismos independentes variáveis para eliminar células cancerígenas. Ao longo das últimas décadas, o campo de conjugados anticorpos, anticorpos bisespecíficos, receptores de antígeno quimérico (CAR) e imunoterapia contra o câncer emergiu como a área mais promissora de investigações básicas e terapêuticas. Com numerosos testes em humanos bem-sucedidos visando receptores de ponto de verificação imunológicos e células CAR-T em leucemia e melanoma em um ritmo inovador, são tempos altamente emocionantes para terapêuticas oncológicas derivadas de variações da engenharia de anticorpos. Lamentavelmente, um número significativamente grande de anticorpos e terapêutica baseada em CAR também se mostrou decepcionante em testes em humanos de cânceres sólidos devido à limitada disponibilidade de células de efeito imunológico no leito tumoral. É importante ressaltar que a distribuição inespecífica de anticorpos terapêuticos em tecidos diferentes dos tumores também contribui para a falta de eficácia clínica, toxicidade associada e falha clínica. Como a tradução fiel de estudos pré-clínicos em trilhas clínicas humanas são altamente confiadas na eficácia e estudos de segurança do xenoenxerto de tumores de camundongos, aqui destacamos um método para testar o tumor e a distribuição geral de tecidos de anticorpos terapêuticos. Isso é conseguido rotulando o anticorpo purificado proteína-A com corante fluorescente infravermelho próximo seguido de imagem viva de camundongos portadores de tumores.

Introdução

A FDA aprovou o primeiro anticorpo monoclonal direcionado ao CD3 (OKT3, Muromonab) em 1986^1,2. Desde então, nos próximos vinte anos, houve uma rápida explosão no campo da engenharia de anticorpos devido ao sucesso esmagador de anticorpos contra inibidores de ponto de verificação imunológico³. Além da ativação indireta do sistema imunológico, os anticorpos estão sendo destinados a sinalizar diretamente as células cancerígenas para engajar precisamente as células efeitológicas, desencadear a citotoxicidade através do agonista do receptor da morte, bloquear a sinalização de sobrevivência das células tumorais, obstruir a angiogênese (crescimento dos vasos sanguíneos), restringir os reguladores imunológicos, fornecer radioisótopos, drogas de quimioterapia e siRNA como agentes conjugados². Além disso, estudar os fragmentos variáveis de cadeia única (scFv) de vários anticorpos na superfície das células T derivadas do paciente e células NK (CAR-T e CAR-NK) é uma área de rápido crescimento das investigações clínicas para terapias baseadas em células⁴.

A afinidade ultra-alta de drogas à base de anticorpos que fornecem seletividade para células tumorais expressas de antígeno torna-o um agente atraente. Da mesma forma, a entrega direcionada e a retenção tumoral de um anticorpo terapêutico (ou uma droga química) é a chave para equilibrar a eficácia sobre a toxicidade. Portanto, um grande número de estratégias baseadas em engenharia de proteínas que incluem, mas não se limitam a anticorpos bisespecíficos⁵ e tri-específicos⁶ estão sendo explorados para melhorar significativamente a retenção otimizada de tumores de intravenosamente (IV) injetável terapêutica^5,7. Aqui, descrevemos um método simples baseado em fluorescência para abordar a distribuição de tumores e tecidos de anticorpos anticâncicos potencialmente eficazes.

Como os tecidos animais possuem auto-fluorescência quando excitados em espectro visível, os anticorpos foram inicialmente rotulados com corante infravermelho próximo (por exemplo, IRDye 800CW). Para provas de investigações conceituais, fizemos uso do receptor de folato alfa-1 (FOLR1) visando anticorpos chamados farletuzumab e seu derivado chamado ativador de citotoxicidade de âncora bispecífica (BaCa)⁷ anticorpo que co-visa FOLR1 e receptor de morte-5 (DR5)⁸ em um anticorpo recombinante. FOLR1 é um receptor-alvo superexpresso bem definido em células cancerígenas ovarianas e TNBC, xenoenxertos tumorais e tumores de pacientes⁹. Notavelmente, existem múltiplos esforços para explorar clinicamente folr1 usando abordagens baseadas em anticorpos para engajar células de efeito imunológico e conjugados de anticorpos (ADC) para cânceres de ovário e mama^10,11.

Neste artigo de métodos, clonamos, expressamos e purificamos o anti-FOLR1 clínico (farletuzumab) juntamente com outros anticorpos de controle usando o sistema de expressão CHO. O isótipo IgG1 e um anticorpo clínico anti-idiotype mucin-16 chamado abagovomab¹² foram usados como controles negativos. Após a purificação da proteína A, os anticorpos indicados foram rotulados com IRDye 800CW e foram administrados na veia traseira de camundongos nus, com xenoenxertos de tumor ovariano ou FOLR1 humanos transfectados com facadas expressando xenoenxertos de câncer de cólon murino. A localização de anticorpos foi rastreada por imagens ao vivo usando espectro de imagem in vivo em vários pontos de tempo diferentes⁷. Este método não requer qualquer modificação genética ou injeção do substrato para permitir a emissão de luz e é significativamente mais rápido, econômico e eficiente. O protocolo geral de clonagem, expressão, purificação e rotulagem descrito abaixo pode ser aplicado a qualquer anticorpo clínico e não clínico se as sequências de cadeia pesada e leve estiverem disponíveis.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo o manejo de animais e os estudos de xenoenxertos tumorais foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) aqui na Universidade da Virgínia e de acordo com as normas regulamentares pertinentes

1. Expressão e purificação de anticorpos

1. Manutenção de células CHO
   1. Cultivar células CHO em FreeStyle CHO Media complementada com suplemento de 1x glutamina disponível comercialmente a 37 °C tremendo a 130 rpm com 5% de CO₂ usando frascos de Erlenmeyer longos, vidro ou descartáveis.
      NOTA: É altamente recomendável usar um frasco perplexo com tampa ventilada para maior agitação e para melhorar a transferência de gás durante a condição de agitação. O rendimento de anticorpos significativamente reduzido foi obtido com frascos regulares (não perplexos) devido à agitação limitada da cultura de suspensão.
   2. Mantenha o número de celular entre 1-5 x 10⁶ células/mL com viabilidade celular >95%. Se o número de células aumentar acima de 5 x 10⁶ células/mL, divida as células. Nunca permite que as células CHO alcancem abaixo de 0,2 x 10⁶ células/mL.
2. Transfecção de células CHO
   1. Cultivar células CHO em 200 mL de mídia (2 x 10⁶ células/mL) em frascos de longos Erlenmeyer perplexos.
      NOTA: Culturas de suspensão cultivadas em frascos perplexos sempre produziram maiores rendimentos proteicos versus quando cultivadas em frascos não perplexos.
   2. Em um tubo de 15 mL, pegue 5 mL de mídia CHO FreeStyle e adicione 50 μg de DNA de clone VH e 75 μg de DNA clone VL. Vórtice para misturar bem.
   3. Incubar a mistura de DNA à temperatura ambiente por 5 minutos.
      NOTA: A incubação mais longa reduz a produção de proteínas.
   4. Adicione 750 μL de 1 mg/mL de polietileneimina (PEI) à solução de DNA e vórtice agressivamente a mistura para 30 s. Incubar em temperatura ambiente por mais 5 minutos.
      NOTA: PEI deve ser feito fresco. O ciclo de degelo múltiplo do PEI reduz significativamente o rendimento global.
   5. Adicione toda a mistura de DNA e PEI nas células enquanto agita manualmente o frasco. Incubar imediatamente os frascos de longo Erlenmeyer perplexos com células a 37 °C tremendo a 130 rpm.
3. Expressão
   NOTA: O anticorpo tem peptídeo de sinal secreto projetado para o final do terminal N, que ajuda anticorpos a serem secretados na mídia.
   1. Cresça as células transfeinadas a 37 °C, com tremor a 130 rpm no dia 1.
   2. No dia 2, adicione 2 mL de 100x de agente anti-aglomerado e 2 mL de solução antibacteriana-anti-micótica de 100x. Mude o frasco para temperatura mais baixa (32-34 °C), com agitação a 130 rpm.
   3. Em cada quinto dia, adicione 10 mL de ração Tryptone N1, e 2 mL de suplemento de glutamina de 100x.
   4. Continue contando as células todos os três dias usando hemótmetro depois de colorindo uma alíquota de células com mancha azul trypan. Certifique-se de que a viabilidade celular fique acima de 80%.
   5. No dia 10 ou 11, colhe o meio para purificação de anticorpos. Gire a cultura a 3000 x g, 4 °C por 40-60 min e depois filtre a mídia clara usando filtros de garrafa de 0,22 μM.
4. Purificação
   NOTA: A purificação de anticorpos é realizada utilizando-se uma coluna Protein-A comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais),utilizando uma bomba peristáltica.
   1. Equilibre a coluna com dois volumes de coluna de tampão de ligação (fosfato de sódio de 20 mM no pH 7.4).
   2. Passe a mídia filtrada contendo anticorpos (obtidos na etapa 1.3.5) através da coluna na taxa de fluxo de 1 mL/min.
   3. Lave a coluna com volume de duas colunas de tampão de ligação.
   4. Elute o anticorpo em frações de 500 μL usando tampão de elução de 5 mL (acetato de sódio de 30 mM em pH 3.4).
   5. Neutralize o pH do anticorpo elucido adicionando 10 μL de tampão de neutralização (acetato de sódio de 3 M a pH 9) por fração.
      NOTA: A fração número 3-6 contém a maior parte do anticorpo. É aconselhável manter todas as frações caso o anticorpo seja elucido em uma fração posterior do que o esperado.
   6. Meça a concentração de anticorpos purificados usando um espectotômetro selecionando o protocolo padrão para IgG. A concentração final do anticorpo é obtida em mg/mL considerando o peso molecular e o coeficiente de absorção.

2. Rotulagem fluorescente

NOTA: Os anticorpos são rotulados com o corante infravermelho que contém um grupo reativo de éster NHS, que acoplam às proteínas e formam um conjugado estável. Esta reação é sensível ao pH e funciona melhor em pH 8.5. Conjugados fluorescentes rotulados com o corante exibem um máximo de absorção de 774 nm, e um máximo de emissão de 789 nm. pH 8.5 é fundamental para uma conjugação eficaz.

1. Dialyze 0,5 mL do anticorpo usando um de diálise (0,1-0,5 mL) em 1 L de tampão de conjugação (tampão fosfato de 50 mM no pH 8.5). Depois de 4h transfira o de diálise para tampão fresco e diálise durante a noite.
2. Configure uma reação conjugal adicionando 0,03 mg de IRDye 800CW por 1 mg de anticorpo em um volume de reação de 500 μL.
   NOTA: IRDye 800CW é dissolvido em DMSO a uma concentração de 10 mg/mL.
3. Realizar reações de rotulagem por 2h a 20 °C.
   NOTA: Aumentar o tempo além de 2h não melhora a rotulagem.
4. Purificar conjugados rotulados por diálise extensiva contra 1x PBS.
5. Estime o grau de rotulagem medindo a absorção do corante a 780 nm e a absorção da proteína a 280 nm. A contribuição de corante para o sinal de 280 nm é de 3%.
6. Calcule a razão corante/proteína usando esta fórmula:
   
   onde 0,03 é fator de correção para a absorção do corante utilizado a 280 nm (igual a 3,0 % de sua absorvância a 780 nm), ε_Corante e proteína ε_são coeficientes de extinção molar para o corante e a proteína (anticorpo) respectivamente.
   NOTA: ε_Corante é 270.000 M^-1 cm^-1 e ε_Proteína é 203.000 M^-1 cm^-1 (para um IgG típico) em 1:1 mistura de PBS: metanol. Proteínas diferentes do IgG podem ter coeficientes de extinção molar muito diferentes. O uso do coeficiente de extinção correto para a proteína de interesse é essencial para a determinação precisa da razão D/P.
7. Calcule a concentração final de proteína usando esta fórmula:
   
   NOTA: Confirme sempre a eficácia de ligação de antígeno de anticorpo rotulado e sem rótulo usando ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ou citometria de fluxo antes de prosseguir para estudos in vivo.

3. Estudos de xenoenxerto de rato

1. Preparação de células tumorais para injeção
   1. Cultivar células OVCAR-3 em RPMI-1640 Medium, suplementada com 10% de FBS e 1x penicilina-estreptomicina.
   2. Um dia antes da injeção, células de subcultura em novos pratos de cultura de 100 mm com 10 mL de meio/prato completo. Use o número celular de 0,5-1 x 10⁶ células/prato.
   3. Incubar culturas a temperatura de 37 °C, 95% umidade e 5% DE CO₂ para 20-24 h.
   4. No dia da injeção, remova o meio de crescimento dos pratos de cultura. Enxágue completamente a camada celular com ca²⁺/Mg²⁺ livre A solução salina tamponada de fosfato (DPBS) de Dulbecco para remover células mortas, detritos celulares e todos os vestígios de soro, que podem interferir na ação de trypsin.
   5. Experimente as células adicionando 1,0-1,5 mL de solução Trypsin-EDTA para cada prato e tente espalhar a solução inclinando o prato ao redor seguido de incubação a 37 °C por 5-10 min.
      NOTA: Observe células sob um microscópio invertido para verificar o estado real de trypsinização. Sob a tentação resulta em menor número de descolamento celular da superfície do prato de cultura, sobre a trippsinização induz o estresse celular. Então, a experimentação adequada é importante.
   6. Adicione 1,0-1,5 mL de meio de crescimento completo a cada prato para parar a ação de trypsin, depois que re-suspender as células por pipetação suavemente.
      NOTA: A tubulação suave é importante para manter a saúde celular.
   7. Colete a suspensão da célula em um tubo cônico de 15 mL e gire a 250 x g por 5 min a temperatura ambiente.
   8. Colete a pelota celular depois de remover o supernasce e lave as células suspendendo a pelota em 1x DPBS.
   9. Gire a suspensão da célula em baixa velocidade 250 x g por 5 min.
   10. Adicione 500 μL de DPBS e suspenda as células por tubulação suave para obter suspensão de célula única.
   11. Conte células usando hemótmetro ou contador automatizado de células.
       NOTA: Para melhor precisão, repita a contagem por três vezes e tome uma média.
   12. Ajuste o volume de tal forma para que a densidade final da célula seja de 1 x 10⁸ células/mL.
2. Injeção subcutânea de células para desenvolver xenergrafos de camundongos
   NOTA: Todos os procedimentos devem ser feitos em um gabinete de segurança BSL2. Athymic Nude Foxn1^nu/Foxn1⁺ ratos têm sido usados no presente estudo.
   1. Leve 50 μL da suspensão celular em um tubo de 1,5 mL e misture com 50 μL de matriz de membrana de porão.
      NOTA: O meio da matriz da membrana do porão tende a formar um estado de gel como o estado à temperatura ambiente, por isso mantenha cuidadosamente as células e a mistura média da matriz no gelo. É aconselhável manter tubos, pontas e seringas na geladeira e, em seguida, transferir gelo antes da injeção animal.
   2. Agitar a mistura para evitar qualquer aglomeração celular. Em seguida, leve este 100 μL da mistura meio de suspensão da célula que contém 5 x 10⁶ células, em uma seringa de 1 cc.
   3. Levante suavemente a pele do animal para separar a pele da camada muscular subjacente e injete lentamente a suspensão celular (100 μL) sob a pele (5 x 10⁶ células), com uma agulha de 26 G. Aguarde alguns segundos antes de tirar a agulha, para que o meio de matriz do porão possa formar o gel semissólido como estrutura junto com células sob a pele, impedindo que a mistura saia do local da injeção.
      NOTA: As células precisam ser testadas antes da injeção para qualquer contaminação que possa prejudicar camundongos imunodeficientes. Enquanto a injeção não coloca a agulha muito profunda na pele, pois isso pode formar o tumor mais profundo do que o esperado.
   4. Mantenha o animal em uma gaiola estéril e observe por cerca de 20 minutos.
   5. Observe os camundongos por 2-3 semanas e permita que o tumor cresça até 500 mm³ tamanho.

4. Localização de anticorpos usando um sistema de imagem in vivo

NOTA: O equipamento de imagem in vivo (ver Tabela de Materiais) usado neste experimento utiliza um conjunto de filtros de alta eficiência e algoritmos espectrais de não misturação para visualização não invasiva e rastreamento da atividade celular e genética dentro de um organismo vivo em tempo real. O sistema fornece capacidade de monitoramento de fluorescência e bioluminescência.

1. Injete 25 μg de anticorpo rotulado de corante através da veia da cauda.
   1. Anestesina tumores com camundongos usando 2% de isoflurane. Verifique a falta de resposta aos reflexos do pedal.
   2. Uma vez que os ratos parem de se mover, dilatar a veia traseira lateral aplicando água de verme.
   3. Injete 25 μg (em 100 μL) de anticorpo rotulado usando 1 cc de seringa de insulina com uma agulha de 26 G.
   4. Da mesma forma, como um controle negativo, rotule e injete o anticorpo isótipo IgG1 não específico que não tenha como alvo as células cancerígenas.
2. Realize imagens ao vivo in vivo após 8, 24, 48 h, etc. de injeções de anticorpos.
   1. No software associado, clique em Inicializar localizado no painel de controle e confirme que a temperatura do palco é de 37 °C.
   2. Ligue o suprimento de oxigênio, todas as bombas do sistema de anestesia, o fornecimento de gás isoflurane para câmara anestésico e ajuste a válvula vaporizadora isoflurane para 2%.
   3. Transfira os ratos para câmara anestésico e espere até que os ratos sejam completamente anestesiados. Aplique a pomada lubrificante dos olhos para evitar a secagem dos olhos.
   4. Vá para o painel Controle,configure a imagem de fluorescência através da opção Assistente de Imagem e selecione a excitação em 773 nm e emissão a 792 nm.
      NOTA: As configurações padrão de exposição automática fornecem uma boa imagem fluorescente. No entanto, as preferências de exposição automática podem ser modificadas de acordo com as necessidades.
   5. Transfira os camundongos anestesiados para a câmara de imagem e monte-o no campo de imagem usando cone de nariz. O estágio de imagem oferece a opção de acomodar 5 ratos por vez.
      NOTA: Tenha os ratos de controle com imagens, juntamente com os ratos de teste, tenham uma quantidade semelhante de exposição e outras configurações durante a análise.
   6. Uma vez que tudo esteja pronto, selecione Adquirir opção no painel de controle para a aquisição de imagem.
   7. Com as configurações de autoexposição, o sistema gera a imagem em um minuto. A imagem gerada é a sobreposição de fluorescência na imagem fotográfica com intensidade de fluorescência óptica exibida em unidades de contagens ou fótons, ou em termos de eficiência.
   8. Após adquirir a imagem, transfira os ratos da câmara de imagem de volta para sua gaiola e observe para sua recuperação por 1 a 2 min.
3. Ajuste ainda mais a imagem com as ferramentas e funções fornecidas dentro do software para análise de imagens. As ferramentas de análise de imagem estão na barra de menu e na paleta de ferramentas.
   1. Em Ajuste de imagem,ajuste o brilho, contraste ou opacidade e selecione a escala de cores.
   2. Use as ferramentas do ROI para especificar uma região de interesse (ROI) em uma imagem óptica e medir a intensidade do sinal dentro do ROI. Se necessário, exporte os dados de sinal quantificados para um software de planilha e plote os dados.
   3. Para estudos de acompanhamento, analise necropsias de camundongos de vários tecidos (por exemplo, fígado, pulmão, coração, rim, baço, cérebro etc.) lado a lado para uma distribuição detalhada não específica de anticorpos fluorescentes rotulados.
      NOTA: Os dados podem ser suportados com ELISA específico do tecido, fazendo uso de antígeno (FOLR1 neste caso) em 96 ensaios.

Resultados

Na metodologia descrita, primeiro clonamos anticorpos voltados para o receptor de folato alfa-1 (FOLR1) chamado farletuzumab, e um anticorpo bispecífico chamado BaCa consistindo de farletuzumabe e lexatumumab, juntamente com anticorpos de controle como abagovomab (sequências fornecidas no Arquivo Suplementar 1). Detalhes dos domínios de variável pesada (VH) e luz variável (VL) em clones de DNA (pVH, pVL) são mostrados na Figura 1A. Para confirmar os clones positivos, r...

Discussão

A entrega específica do tecido seletivo e tumoral de agente terapêutico anticâncer é a chave para medir a eficácia e a segurança de uma determinada terapia-alvo¹³. Aqui descrevemos uma abordagem rápida e eficiente para investigar a distribuição detalhada de tecidos e tumores de anticorpos clínicos, farletuzumabe e um anticorpo BaCa não clínico. A abordagem descrita é aplicável a qualquer anticorpo recém-gerado e pode ser usada juntamente com um anticorpo clinicamente eficaz (com qua...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
FreeStyle CHO media	Gibco Life Technologies	Cat # 12651-014
Anti-Anti (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 15240-062
Anti-Clumping Agent	Gibco Life Technologies	Cat # 01-0057DG
BD Insulin Syringe	BD BioSciences	Cat #329420
Caliper IVIS Spectrum	PerkinElmer	Cat #124262
CHO CD EfficientFeed B	Gibco Life Technologies	Cat #A10240-01
Corning 500 mL DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)	Corning	Cat # 10-13-CV
Corning 500 mL RPMI 1640	Corning	Cat # 10-040-CV
Cy5 conjugated Anti-Human IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	Cat # 709-175-149
GlutaMax-I (100X)	Gibco Life Technologies	Cat # 35050-061
HiPure Plasmid Maxiprep kit	Invitrogen	Cat # K21007
HiTrap MabSelect SuRe Column	GE Healthcare	Cat # 11-0034-93
Infusion	Takara BioScience	STO344
IRDye 800CW NHS Ester	LI-COR	Cat # 929-70020
Isoflurane, USP	Covetrus	Cat # 11695-6777-2
Lubricant Eye Ointment	Refresh Lacri-Lube	Cat #4089
Matrigel	Corning	Cat # 354234
PEI transfection reagent	Thermo Fisher	Cat # BMS1003A
Slide-A-Lyzer Dialysis Cassettes	Thermo Scientific	Cat # 66333
Steritop Vacuum Filters	Millipore Express	Cat #S2GPT02RE
Trypsin-EDTA	Gibco Life Technologies	Cat # 15400-054
Experimental Models: Cell lines
Human: OVCAR-3	American Type Culture Collection	ATCC HTB-161
Human: CHO-K cells	Stable transformed in our lab	ATCC CCL-61
Mouse: 4T1	Kind gift from Dr. Chip Landen, UVA
Mouse: MC38	Kind gift from Dr. Suzanne Ostrand-Rosenberg, UMBC	Authenticated by STR profiling
Mouse: MC38 hFOLR1	Generated in our laboratory (This paper)
Experimental Models: Animal
Mice: athymic Nude Foxn1nu/Foxn1+	Envigo	Multiple Orders
Mice: NOD.Cg Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ	Jackson Laboratory	Multiple Orders