Medindo interações transcelulares através da agregação de proteínas em um sistema celular heterologous

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para medir rapidamente e semiquantitativamente as interações ligantes-receptores em trans em um sistema celular heterologous usando microscopia de fluorescência.

Resumo

As interações proteicas nas interfaces celulares ditam uma infinidade de desfechos biológicos que vão desde o desenvolvimento de tecidos e progressão do câncer até a formação e manutenção da sinapse. Muitas dessas interações fundamentais ocorrem em trans e são tipicamente induzidas por interações heterofílicas ou homofílicas entre células expressando pares de ligação ancorados na membrana. Elucidar como mutações relevantes para doenças interrompem essas interações proteicas fundamentais pode fornecer uma visão de uma miríade de campos de biologia celular. Muitos ensaios de interação proteína-proteína não normalmente desambiguam entre interações cis e trans, o que potencialmente leva a uma superestimação da extensão da ligação que está ocorrendo in vivo e envolve purificação intensiva de proteínas e/ou equipamentos de monitoramento especializados. Aqui, apresentamos um protocolo simples otimizado que permite a observação e quantificação de apenas interações trans sem a necessidade de purificações de proteínas longas ou equipamentos especializados. O ensaio de agregação celular HEK envolve a mistura de duas populações independentes de células HEK, cada uma expressando ligantes cognatos ligados à membrana. Após um curto período de incubação, as amostras são imagens e os agregados resultantes são quantificados.

Introdução

Interações sinápticas facilitadas por moléculas de adesão sináptica são fundamentais para o desenvolvimento, organização, especificação, manutenção e função das sinapses e da geração de redes neurais. A identificação dessas moléculas de adesão celular transsináptica está aumentando rapidamente; assim, é fundamentalmente importante identificar parceiros vinculantes e entender como essas novas moléculas de adesão interagem entre si. Além disso, o sequenciamento do genoma identificou mutações em muitas dessas moléculas de adesão que estão comumente ligadas a uma infinidade de distúrbios neurodesenvolvimentos, neuropsiquiátricos e de dependência¹. Mutações em genes que codificam moléculas de adesão celular sináptica podem alterar prejudicialmente interações trans e podem contribuir para alterações fiofoficológicas na formação e ou manutenção da sinapse.

Existem ensaios múltiplos para avaliar quantitativamente interações proteína-proteína, como calrómetria isotérmica, dicromaísmo circular, ressonância de plasmon superficial² e, embora quantitativa na natureza, eles têm várias limitações. Primeiro, eles requerem proteína recombinante, às vezes exigindo passos longos e tediosos de purificação. Em segundo lugar, exigem equipamentos especializados sofisticados e conhecimentos técnicos. Em terceiro lugar, eles podem superestimar a extensão da ligação, pois permitem interações cis e trans entre proteínas que são naturalmente amarradas a uma membrana in vivo. Aqui propomos um ensaio simples e relativamente rápido que testa exclusivamente interações trans.

Para contornar muitas das complicações associadas a ensaios proteicos purificados, otimizamos um ensaio de interação proteica baseado em células que recapitula interações trans em um sistema celular heterologos reduzido. Este ensaio tem sido usado anteriormente de várias formas para estudar interações transcelulares. Nesta abordagem, moléculas de adesão celular candidatas são transfectadas em células HEK293T. Em condições fisiológicas, as células HEK293T não apresentam auto-agregação, tornando-as modelos exemplares para este ensaio. No entanto, quando populações individuais de células HEK expressando receptor e ligante são combinadas, a ligação do receptor e do ligante força a agregação de células HEK a ocorrer. Esta agregação é mediada exclusivamente por interações trans e geralmente é observável em dezenas de minutos. Não são necessárias etapas de purificação de proteínas neste método, e a eficiência do método baseia-se no paradigma de que populações de células HEK expressando moléculas de adesão cogna estão sendo combinadas e, em seguida, imagens apenas dezenas de minutos depois. Além disso, este método é relativamente barato, pois nem anticorpos nem equipamentos caros são necessários. O único equipamento necessário para a aquisição de dados é um microscópio fluorescente padrão. Uma vantagem adicional para este ensaio baseado em células é a capacidade de rastrear rapidamente o efeito de mutações de pontos relevantes da doença nas interações trans. Isso pode ser realizado transfecando células HEK com cDNAs das variantes mutantes da proteína de interesse.

Neste protocolo, apresentamos um exemplo no qual investigamos se uma mutação missense em Neurexin3α (Neurexin3α^A687T), identificada em um paciente diagnosticado com profunda deficiência intelectual e epilepsia, altera interações em trans com proteína trans trans reito transmembrana 2 (LRRTM2). Neurexin3α é um membro da família evolutivamente conservada de moléculas de adesão celular pré-sináptica e, embora o trabalho recente tenha identificado múltiplos papéis na sinapse^3,4,5,6,7, nossa compreensão sináptica desta molécula e todos os membros da família neurexina permanecem incompletos. LRRTM2 é uma proteína de adesão celular pós-sináptica excitatória que participa da formação e manutenção da sinapse^8,9,10. É importante ressaltar que o LRRTM2 interage exclusivamente com isoformas de neurexina que não possuem o local da emenda 4 exon alternativo (SS4-), mas não com isoformes de neurexina contendo o local da emenda 4 exon alternativo (SS4+). A mutação missense humana (A687T) identificada em Neurexin3α está localizada em uma região extracelular não estudada que é evolutivamente conservada e é conservada entre todas as neurexinas alfa⁷. Como a interação entre essas duas moléculas foi estabelecida^8,9,11, colocamos a questão: a capacidade de ligação de Neurexin3α SS4- para LRRTM2 é alterada por uma mutação de ponto A687T? Este ensaio revelou que a mutação de ponto A687T aumentou inesperadamente a agregação de Neurexin3α para LRRTM2 sugerindo que a região extracelular em que a mutação de ponto está localizada, desempenha um papel na mediação de interações transsinápticas.

Protocolo

1. Cultura celular e transfecção

1. Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Modificação do Meio da Águia) de Dulbecco com glicose de 4,5 g/L, l-glutamina & piruato de sódio e 10% FBS. Filtro estéril.
2. Ligantes e receptores adequados para agregação de pré-determinantes e receptores para ensaio de agregação.
   NOTA: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram utilizados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α no pcDNA3.1¹². Neurexin3α F/R: TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCCTACTC/
   GAGCGGCCGCCCCGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Prepare células HEK293T.
   1. Cresça células HEK293T para confluência em um frasco T-75.
   2. Uma vez confluente, use 2 mL de trippsina e coloque em incubadora de 37 °C por 2 min. Adicione 6 mL de mídia HEK ao frasco para resuspend células e transfira todos os 8 mL para um tubo cônico de 15 mL.
   3. Pelota a 500 x g por 5 min e resuspend na mídia de células HEK para um total de 8 mL.
   4. Conte células e adicione 735.000 células em cada poço de uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final para 2 mL para cada poço usando mídia de célula HEK.
   5. Coloque na incubadora de 37 °C e permita que as células cresçam durante a noite ou até atingirem 50-60% de confluência.
4. Células HEK293T transfectas utilizando o método fosfato de cálcio¹³.
   1. Transfetar bem-1 com 3 μg da proteína de interesse e co-transfeto com 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- e 1 μg de mCherry).
   2. Transfect well-2 como na etapa 1.4.1. mas com a proteína mutante de interesse (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfect well-3 com 3 μg do ligante de interesse e co-transfeito com 1 μg de outra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg de GFP).
   4. Transfect well-4 e well-5 para servir como controles negativos: bem-4 com 1 μg de GFP e bem-5 com 1 μg de mCherry.
   5. Prepare outra placa (como na etapa 1.4.1-1.4.4) se exigir condições ou controles adicionais (Neurexin3α^WT/A687T SS4+).
      NOTA: A eficiência da transfecção é analisada 24 h após a transfecção sob um microscópio de epifluorescência e quantificada como o número de células expressando a proteína fluorescente com a qual foram transfecidas. Uma abordagem mais simplificada incluiria a transfecção de células HEK com uma codificação vetorial bicistrônica para uma proteína fluorescente e o ligante de interesse e é altamente recomendado acima da co-transfecção. No caso deste estudo, as neurexinas alfa são ~4,3 kb e a baixa intensidade de fluorescência foi observada usando um sistema bicistronic que necessita de co-transfecção.
5. 48 horas após a transfecção, colhe células para agregação.
   1. Lave cada poço duas vezes com PBS.
   2. Adicione 1 mL de 10 mM EDTA em PBS em cada poço para dissociar suavemente as interações célula-célula e incubar a placa a 37 °C por 5 minutos.
      NOTA: A trippsina não é recomendada para a etapa 1.5.2 devido ao potencial decote proteolítico de moléculas de adesão em estudo. Além disso, após a adição de EDTA, o protocolo pode não ser interrompido até a conclusão, pois as células serão agora expostas a condições ambientais.
   3. Bata suavemente a placa para desprender as células e colher cada poço em tubos cônicos separados de 15 mL.
   4. Centrífuga tubos cônicos a 500 x g e temperatura ambiente por 5 min.
6. Enquanto as células estão pelotando, prepare 6 tubos de incubação rotulando a parte superior de cada tubo de microcentrifuuagem com cada condição.
   NOTA: Cada permutação das condições de GFP e mCherry deve ser usada para abranger todas as condições experimentais e controles adequados. Por exemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP/Neurexin3α^WT SS4-- mCherry, 4. GFP/Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexin3α^WT SS4-— mCherry/LRRTM2 — GFP, 6. Neurexin3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2-GFP. Faça tubos adicionais para acomodar outras condições e controles.
7. Remova as células supernascidas e resuspend em 500 μL de mídia HEK com 10 mM CaCl₂ e 10 mM MgCl₂ aquecidos a 37 °C.
   NOTA: A adição de CaCl₂ e MgCl₂ permite que moléculas de adesão restabeleçam a vinculação e só é necessária se os parceiros de interação transcelular em questão exigirem cáções divalentes para adesão.
8. Conte as células em cada tubo cônico de 15 mL usando um hemocitômetro e alíquota de 200.000 células de cada condição em tubo apropriado a partir da etapa 1.6.1 para uma mistura de 1:1 em um volume total de 500 μL.
   NOTA: Deve levar apenas 5 minutos por condição para contar e parcelar valores.
9. Incubar tubos à temperatura ambiente em um rotador de tubo lento.

2. Aquisição de imagens

1. Otimize parâmetros de aquisição de microscópio para amostras específicas. Neste exemplo, as imagens foram tiradas em um microscópio de campo largo. Use um objetivo de ar 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) para obter um campo grande o suficiente para análise.
2. Avalie a agregação da linha de base imediatamente após misturar as duas condições das células HEK na etapa 1.8. Estas são agora as imagens do "tempo zero".
   1. Pipeta 40 μL de cada mistura de amostra em um slide de microscópio carregado e imagem sob fluorescência nos canais 488 e 561.
   2. Adquira três diferentes campos de visão em um plano focal por gota de amostra.
3. Adquira imagens finais a 60 min como a imagem do "tempo 60".
   1. Para obter a imagem 'time 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição a partir de tubos rotativos e pipeta cada amostra em um slide carregado. Imagem como na etapa 2.2.2.
      NOTA: A agregação celular deve ser verificada a cada 15 minutos até que ocorra a saturação. O tempo de agregação dependerá das proteínas que estão sendo testadas.

3. Análise ImageJ/Fiji

1. Para quantificar a extensão da agregação usando Fiji/ImageJ, salve arquivos de análise.
   1. Salve os arquivos de codificação suplementar fornecidos na pasta de macros imageJ no computador.
   2. Instale a macro de agregação fornecida (Plugins, Macros, Install e selecione o arquivo "AgregaçãoSsay.txt").
2. Determine limiares.
   1. Carregue um arquivo de .tif 'time zero' em imageJ e divida os canais (Imagem | | de cor Canais Divididos).
      NOTA: A imagem 'time zero' é usada para determinar o limiar e o menor tamanho de puncta para todo o experimento.
   2. Mascarar cada canal(Plugins | Macros | AggregationAssay_MakeMask). A janela Make Mask From Image será exibida. Verifique as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params from Histogram e clique em OK.
   3. Determine o limiar da imagem usando a barra de slides, grave o número à direita da barra de slides e clique em OK.
   4. Um Histograma do Tamanho do Cluster aparecerá. Selecione um tamanho de cluster do histograma que se adapte ao experimento, digite este número no Tamanho do Cluster Min: caixa e clique em OK. Clusters abaixo deste tamanho não serão analisados.
3. Analise a análise.
   1. Abra a imagem 'time 60' da condição 1 na imagemJ e divida os canais como na etapa 3.2.1.
   2. Mascarar cada canal (Plugins, Macros, AggregationAssay_MakeMask). Use o mesmo limiar e tamanho determinados na etapa 3.2.3 e na etapa 3.2.4. Desmarque as caixas ao lado de Determine Threshold for Image e Determine Cluster Params do Histograma e digite manualmente o tamanho e os limiares nos campos apropriados e clique em OK.
   3. Calcular o índice de agregação (Plugins | Macros | AggregationAssay_CalculateOverlap). Selecione os canais mascarados a serem comparados e o diretório no qual os arquivos resultantes serão salvos.
   4. Repita as etapas 3.3.1-3.3.3 para cada imagem 'time 60' em cada condição.
      NOTA: O índice de agregação é definido como a área de sobreposição total dividida pela soma das duas áreas de canal menos a área de sobreposição multiplicada por 100 (Índice de agregação = área de sobreposição/[área do canal 1 + área do canal 2 – área de sobreposição] x 100). Esta normalização é uma operação 'OR' entre os dois canais mascarados representando os pixels totais em qualquer máscara.

Resultados

A mutação A687T aumenta a ligação Neurexin3α SS4 ao LRRTM2⁷
Para investigar como as interações intercelulares de duas proteínas sinápticas conhecidas são afetadas pela introdução de uma mutação pontual encontrada em um paciente com deficiência intelectual e epilepsia, utilizamos o ensaio de agregação celular HEK acima(Figura 1). As células foram transfeinadas de acordo com a seção 1 e preparadas para imagens de acordo com as seções 1 e 2 d...

Discussão

Dissecar as interações proteína-proteína que ocorrem em trans durante a adesão celular pode levar a uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes aos processos celulares básicos, incluindo a formação, função e manutenção de sinapses durante a maturação e remodelação. As implicações das interações célula-célula se expandem além da neurobiologia e têm papéis mais amplos na transdução de sinais, migração celular e desenvolvimento de tecidos¹⁴. Aberraçõe...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL disposable microtubes with snap caps	VWR	89000-028	Incubation of mixed population of HEK cells
1000 mL Rapid—Flow Filter Unit, 0.2 um aPES membrane	Thermo Fisher	567-0020	Sterilization of HEK media
15 mL SpectraTube centrifuge tubes	Ward’s Science	470224-998	Harvesting HEK cells
6 well sterile tissue culture plates	VWR	100062-892	culturing HEK cells
Calcium Chloride	Sigma	223506-500G	Calcium phosphate transfection, HEK cell resuspension
Centrifuge- Sorvall Legend RT	Kendro Laboratory Products	75004377	Harvesting HEK cells
CO2 cell incubator	Thermo Scientific	HERACELL 150i	Incubation of HEK cells during growth
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) with 4.5 g/L glucose, L-glutamine & sodium pyruvate	Corning	10-013-CV	HEK cell maintenance
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passaging/harvesting HEK cell
Ethylenediaminetetraacetic acid	Sigma	ED-500G	Harvesting HEK cells
Falcon Vented culture flasks, 75cm2 growth area	Corning	9381M26	Culturing HEK cells
Fetal Bovine Serum	Sigma	17L184	HEK cell maintenance
HEK293T cells	ATCC		Model system
ImageJ	NIH	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Image analysis
Magnesium Chloride hexahydrate	Sigma	M9272-500G	HEK cell resuspension
Sodium phosphate dibasic anhydrous	Fisher BioReagents	BP332-500	Calcium phosphate transfection
Trypsin 0.25% (1X) Solution	GE Healthcare Life Sciences	SH30042.01	Passaging HEK cells
Tube rotator			Incubation of mixed population of HEK cells
UltraClear Microscope slides. White Frosted, Positive Charged	Denville Scientific Inc.	M1021	Image acquisition
Wide-field microscope	Zeiss	Axio Vert 200M	Image acquisition