Eletroencefalograma de vídeo contínuo durante hipoxia-isquemia em camundongos neonatais

Resumo

Este manuscrito descreve um método para gravações contínuas de EEG de vídeo usando eletrodos de profundidade múltiplos em camundongos neonatais submetidos à hipoxia-isquemia.

Resumo

A isquemia de hipóxia é a causa mais comum de convulsões neonatais. Modelos animais são cruciais para a compreensão dos mecanismos e fisiologia subjacentes às convulsões neonatais e à isquemia de hipóxia. Este manuscrito descreve um método de monitoramento contínuo de eletroencefalograma de vídeo (EEG) em camundongos neonatais para detectar convulsões e analisar o fundo do EEG durante a isquemia de hipóxia. O uso de vídeo e EEG em conjunto permite a descrição da semiologia da convulsão e a confirmação de convulsões. Este método também permite a análise de espectrogramas de energia e tendências de padrão de fundo EEG durante o período de tempo experimental. Neste modelo de isquemia de hipóxia, o método permite o registro de EEG antes da lesão para obter uma linha de base normativa e durante a lesão e recuperação. O tempo total de monitoramento é limitado pela incapacidade de separar filhotes da mãe por mais de quatro horas. Embora tenhamos utilizado um modelo de convulsões hipoxica-isquêmicas neste manuscrito, este método para monitoramento de vídeo neonatais poderia ser aplicado a diversos modelos de doenças e convulsões em roedores.

Introdução

A encefalopatia isquêmica hipóxica (HIE) é uma condição que afeta 1,5 em 1000 recém-nascidos anualmente e é a causa mais comum de convulsões ^neonatais1,2. Os bebês que sobrevivem correm risco para várias deficiências neurológicas, como paralisia cerebral, deficiência intelectual e ^{epilepsia3,4,5}.

Os modelos animais desempenham um papel fundamental na compreensão e investigação da fisiopatologia da isquemia de hipóxia e convulsões ^neonatais6,7. Um modelo vannucci modificado é usado para induzir isquemia de hipóxia (OI) no pós-natal dia 10 (p10)^7,8. Filhotes de rato dessa idade traduzem neurologicamente aproximadamente para o termo completo neonato ^humano9.

O monitoramento contínuo da eletroencefalografia por vídeo (EEG) utilizado em conjunto com este modelo de lesão permite maior compreensão e caracterização de convulsões isquêmicas hipoxicas neonatais. Estudos anteriores utilizaram vários métodos para análise de convulsões neonatais em roedores, incluindo gravações de vídeo, gravações limitadas de EEG e gravações de EEG de telemetria10,11,12,13,14,15,16. No manuscrito a seguir, discutimos em profundidade o processo de gravação contínua de EEG de vídeo em filhotes de camundongos durante a hipoxia-isquemia. Esta técnica de monitoramento contínuo de EEG em filhotes de camundongos neonatais pode ser aplicada a uma variedade de modelos de doenças e convulsões.

Protocolo

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Virgínia.

1. Construção de eletrodo/cabo

1. Use um fio de aço inoxidável isolado unipolar (0,005" de diâmetro nu, 0,008" revestido) para fazer um eletrodo conectado com um conector de soquete feminino (conector de recipiente feminino 0,079).
2. Use um cabo feito sob medida para conectar os animais ao amplificador.
   1. Conecte um conector masculino de 4 pinos (conector masculino de 0,079") à unidade de 4 canais ganha impedância correspondente ao amplificador operacional (op-amp). Conecte um resistor de 10K aos fios que se conectam à bateria de 9 V. Um fio de terra não conectado ao op-amp atua como o ponto médio da bateria.
   2. Conecte uma extremidade do cabo (AWG, 0,012" OD) ao op-amp e conecte a outra extremidade do cabo ao amplificador.

2. Cirurgia de implantação de eletrodos

1. Anestesiar o filhote (pós-natal dia 9) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente. Antes do início do procedimento, injete os filhotes com bupivacaína (0,02-0,05 mL, 0,25% de infiltração local subcutânea).
2. Uma vez que o animal esteja imóvel, transfira para um estágio estereotático com um cone de nariz. Use o lado inverso da barra de ouvido, pois ela é macia para manter a cabeça firme. Nesta idade, os filhotes não têm um ouvido totalmente desenvolvido para usar a extremidade pontiaguda da barra de ouvido.
3. Abaixe o fluxo de isoflurane e mantenha-o em 2,5-3%. Fique de olho na respiração constante do filhote durante todo o procedimento cirúrgico. Aperte a cauda para verificar a resposta à dor e, em seguida, proceda à incisão.
4. Esterilize a área de incisão no crânio com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol). Drape a parte do corpo circundante de tal forma que a região de incisão é visível.
5. Abra o couro cabeludo anterior-posterior ligeiramente acima dos olhos e retraia aproximadamente 0,5 cm de pele. Reposicione a cabeça do rato no estágio estereotaxico para que a pele puxe para fora expondo o crânio.
6. Aplique peróxido de hidrogênio no crânio usando um cotonete e raspe o crânio limpo usando uma lâmina de bisturi. O crânio é muito macio; tenha cuidado ao raspar.
7. Aplique uma gota (aproximadamente 50 μL) de adesivo e espalhe-a ao redor da área do crânio exposta usando seu aplicador. Exponha à luz UV por 40 s para definir o adesivo.
8. Meça as coordenadas usando o bregma exposto como referência. Implante eletrodos bilateralmente na região ca1 do hipocampo [-3,5 mm Dorsal-Ventral (DV), ±2 mm Medial-Lateral (ML), -1,75 mm De profundidade (D)] e bilateralmente no córtex parietal [-1,22 mm DV, ±0,5 mm ML, -1 mm D] e um eletrodo de referência no ^cerebelo17. Use uma agulha de 32 G para criar um buraco na região marcada.
9. Limpe o sangue da superfície do crânio. Eletrodos inferiores ligados ao conector do soquete feminino no cérebro com a ajuda do braço estereotaxic e fixação no lugar com acrílico dental. Implante o eletrodo no cérebro. O fone de ouvido do conector do soquete fica em cima do crânio colado por acrílico dentário.
10. Injete cetoprofeno (5 mg/kg) subcutâneamente na região interescapular quando o eletrodo estiver fixo. Coloque os filhotes de volta com a mãe.
    NOTA: Introduza metade da ninhada com o fone de ouvido de uma vez para a mãe em vez de apresentá-los um de cada vez. Isso evitará que a mãe prejudique o fone de ouvido do filhote.

3. Configuração e gravação do EEG (linha de base/pré-lesão)

1. Após 24 horas de recuperação após a implantação do eletrodo, coloque cada animal em uma câmara plexiglas personalizada (37 °C) para gravação de EEG. Esta câmara também servirá como uma câmara de hipóxia.
2. Conecte filhotes na câmara a um sistema de monitoramento por vídeo-EEG através de um cabo flexível (cabo op-amp personalizado).
   NOTA: Com o fone de ouvido no lugar, os ratos são livremente móveis e não apresentam diferenças de comportamento. Uma vez fixados nos fios de eletrodo, os fios devem ser ajustados dentro da corda da câmara, a fim de fornecer a quantidade certa de folga para que o filhote possa se mover livremente por toda a câmara.
3. Digitalize os dados do EEG a 1000 Hz com ganho de 1K usando um amplificador de grama. Revise o sinal EEG (filtro de passagem de banda entre 3-70 Hz) mais tarde usando software (por exemplo, LabChart Pro).
4. Regisso EEG pré-lesão por 30 minutos antes de desconectar animais para procedimento de ligadura da artéria carótida.

4. Ligamento da artéria carótida esquerda

1. Anestesiar o filhote (pós-natal dia 10) com isoflurane de 4-5% em um capô de fluxo descendente e colocá-los em configuração especialmente organizada em uma almofada de banho de água. Posicione o supino animal e proteja os membros dianteiros com fita adesiva.
   1. Reduza o fluxo de isoflurane para 2-3%. Belisque a cauda para obter resposta à dor e monitore a respiração durante todo o procedimento.
2. Esterilizar a área de incisão (entre a mandíbula e a clavícula) no lado esquerdo do pescoço com betadina e álcool (3 ciclos de iodo alternado e 70% de etanol).
3. Faça uma incisão de aproximadamente 1 cm de comprimento no lado esquerdo do pescoço usando microscisores. Usando um microscópio dissecando, retraia cuidadosamente o tecido subcutâneo e a pele para expor a artéria carótida. Tome cuidado para identificar o nervo vago (correndo lateralmente para a artéria) e delicadamente separá-lo e retraí-lo da artéria.
4. Rosqueie uma sutura de seda estéril de 5 cm de comprimento sob a artéria usando microforceps. Amarre uma sutura dupla ao redor da artéria para ocluir o fluxo.
5. Corte o excesso de sutura e feche a artéria exposta puxando para trás o tecido subcutâneo e a pele. Use o vínculo veterinário para selar a incisão.
6. Coloque o animal de volta no monitoramento contínuo do EEG em uma câmara em temperatura ambiente, que é colocada em um colchão aquecido. Faça verificações de temperatura infravermelha do núcleo do filhote para evitar abrir a câmara. Deixe o animal se recuperar por 1h antes da hipóxia.

5. EEG e hipóxia

1. Monitore continuamente o _FiO2 (fração de oxigênio inspirado) dentro da câmara através de um monitor de oxigênio.
2. Lave a câmara com 60 L/min de 100% _N2 e 0,415 L/min para 100% _O2. Uma vez que a saturação de oxigênio na câmara atinja 12%, diminua o fluxo de N2 para 10 L/min, mantendo o fluxo de _O2 inalterado. Com pequenos ajustes, mantenha o _FiO2 em 8% por 45 min.
3. Após 45 min de exposição à hipóxia, retorne _fio2 a 21%.
4. Que os filhotes se recuperem na câmara e monitorem no EEG por 2h pós-hipóxia.
5. Após o término do período de gravação, desconecte os ratos da gravação do EEG e retorne à mãe.

6. Análise de EEG

1. Analise o arquivo EEG com vídeo no LabChart Pro. Um pesquisador cego marca o EEG para convulsões e padrões de ^fundo17. As convulsões são definidas como um evento eletrográfico que dura mais de 10 segundos com descargas de ondas acentuadas rítmica de alta frequência (≥3x de base) com clara ^evolução17.
2. Tenha uma segunda revisão de pesquisador cego marcado eventos aleatoriamente para concordância.
3. Revise o vídeo associado para cada evento eletrográfico marcado e analise de acordo com o escore de convulsão comportamental do roedor ^neonatal16. Resumidamente, essa pontuação varia de 0-6 (imobilidade ao comportamento tônico-clonic grave). Para caracterizar ainda mais a semiologia convulsiva, analise o comportamento de lateralidade (movimentos multifoca/bilaterais versus focal/unilateral versus misto).
4. Crie um espectrograma de energia. Use um Fast Fourier Transform com uma janela de dados Cosine-Bell com um tamanho de 1024 pontos de dados. Crie um eixo x liso no espectrograma com a ajuda de uma sobreposição de janela de 87,5%. Expresse a potência como ^μV218.

Resultados

Semiologia convulsiva

A exposição à hipóxia neonatal resulta em convulsões generalizadas e focais em camundongos (Figura 1A-C). Gravações de EEG de vídeo permitem que achados eletrográficos sejam correlacionados ao comportamento em vídeo. Esses comportamentos foram pontuados utilizando-se um escore de apreensão comportamental de roedores neonatais (BSS)¹⁶. Além da BSS, categorizamos eventos com base em ...

Discussão

Apresentamos um modelo para monitoramento contínuo de vídeo-EEG em camundongos neonatais durante convulsões hipoximic-isquêmicas. A análise de vídeo em conjunto com o EEG permite a caracterização da semiologia convulsiva. A análise do EEG permite a extração de espectrogramas de energia e análise de amplitude de fundo.

A colocação correta e cuidadosa de eletrodos é crucial neste protocolo, pois lesões durante a colocação de eletrodos ou colocação imprecisa podem afetar signi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
SURGERY
Ball Point Applicator	Metrex Research	8300-F	i-bond applicator
Cranioplast (Powder/Resin)	Coltene	H00383	Perm Reline/Power
I-Bond	Kulzer GmbH, Germany
LOOK Silk Suture	Surgical Specialities Corporation	SP115	LOOK SP115 Black Braided Silk Non absorbable surgical suture
RS-5168 Botvin Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5168	Forcep for surgery/ligation
RS-5138 Graefe Forceps	Roboz Surgical Instrument	RS5138	Forcep for surgery/ligation
UV light for I-Bond	Blast Lite By First Media	BL778	UV ligth for I-bond
Vannas Microdissecting Scissor	Roboz Surgical Instrument	RS5618	Scissor for ligation
Vet Bond	3M Vetbond	1469SB	Vet Glue
HYPOXIA
Hypoxidial	Starr Life Science
Oxygen sensor	Medical Products		MiniOxI- oxygen analyzer/sensor for hypoxia rig
EEG RECORDING
Female receptacle connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	832-10-024-10-001000	Ordered from Digikey
Grass Amplifier	Natus Neurology Incorporated		Grass Product
LabChart Pro	ADI Instruments		Software to run the system
Male Socket Connector 0.079"	Mill-Max Manufacturing Corp	833-43-024-20-001000	Ordered from Digikey
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2274CD	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Operational Amplifier	Texas Instruments, Dallas, TX, USA	TLC2272ACDR	TLC2274 Quad Low-Noise Rail-to Rail Operational Amplifier
Stainless Steel wire	A-M Systems	791400	0.005" Bare/0.008" Coated 100 ft
Ultra-Flexible Wire	McMaster-Carr	9564T1	36 Gauze wire of various color