Demonstração de Complexos Heterologos formados por Proteínas de Membrana Tipo III de Golgi-Residente usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida

Resumo

O protocolo aqui apresentado destina-se a demonstrar a ocorrência de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi com n- e/ou C-termini expostos citoplasma em células de mamíferos vivos usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida.

Resumo

O objetivo deste protocolo é explorar a aplicabilidade da variante mais recente da complementação da luciferase dividida para demonstrar complexos heterologos formados por transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs). Essas proteínas multitransmembrana residentes em ER e Golgi carregam os açúcares nucleotídeos citoplasmicamente sintetizados através de membranas organelas para fornecer enzimas que mediam a glicosiloção com seus substratos. Os NSTs existem como dimers e/ou oligômeros superiores. Interações heterólogas entre diferentes NSTs também foram relatadas. Para verificar se a técnica é adequada para estudar o fenômeno da heteromerização do NST, testamos-a contra uma combinação dos dois NSTs residentes em Golgi que foram previamente mostrados para associar por vários outros meios. O ensaio de complementação da luciferase parece ser particularmente adequado para estudar interações entre proteínas de membrana residente em Golgi, pois não requer altos níveis de expressão, que muitas vezes desencadeiam a deslocalização da proteína e aumentam o risco de falsos positivos.

Introdução

Este manuscrito descreve um protocolo passo-a-passo para verificar a presença de interações heterólogas entre proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi em células humanas transitóriamente transfectadas usando a variante mais recente do ensaio de complementação da luciferase dividida. O procedimento foi mais extensivamente testado contra transportadores de açúcar nucleotídeos (NSTs), mas também conseguimos resultados positivos para outras proteínas de membrana tipo III residentes em Golgi cujas proteínas de membrana N e/ou C-termini estão enfrentando o citoplasma.

Nosso grupo de pesquisa explora o papel dos NSTs na glicosilação de m....

Protocolo

1. Geração de plasmídeos de expressão

1. Examine a topologia da membrana das proteínas de interesse usando uma ferramenta de previsão de topologia.
2. Projete a estratégia de clonagem para que os fragmentos maiores e menores enfrentem o citoplasma uma vez que as proteínas de fusão tenham sido inseridas nas membranas golgi. Se, como no caso aqui apresentado, tanto n- quanto C-termini das proteínas de interesse são citoplasmicamente orientados, marque as proteínas de oito maneiras possíveis (ver Figura 1B). Se n ou C-terminus de uma ou ambas as proteínas de interesse forem luminally orientadas, exclua-a da marcação.
3. ....

Resultados

Para obter os dados mais confiáveis nesta abordagem, todas as combinações possíveis devem ser testadas (ver Figura 1). Em paralelo, devem ser incluídos controles positivos e negativos. O controle positivo deve consistir nas duas proteínas que são conhecidas por interagir, das quais uma é fundida com o fragmento maior e a outra é fundida com o fragmento menor. O controle negativo, idealmente, deve consistir nas duas proteínas de membrana tipo III não interagindo marcadas da mesma f.......

Discussão

Aqui fornecemos um protocolo detalhado que permite a demonstração de complexos heterologos formados entre proteínas de membrana tipo III residente em Golgi, como NSTs, utilizando o ensaio de complementação da luciferase split. A abordagem proposta para análise e interpretação de dados envolve relacionar a luminescência obtida para a combinação proteica de interesse à luminescência obtida para a combinação de controle correspondente, que é composta por uma das proteínas de interesse fundidas com o fragmen.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% trypsin-EDTA solution
Adherent mammalian cell line
BioCoat Poly-D-Lysine 96-well White/Clear Flat Bottom TC-treated Microplate, with Lid	Corning	356651
Cell culture centrifuge
Cell culture supplements (heat-inactivated fetal bovine serum, L-glutamine, penicillin, streptamycin)
CO2 incubator
Expression plasmids encoding protein(s) of interest not tagged with NanoBiT fragments
FuGENE HD Transfection Reagent	Promega	E2311
GloMax Discover Microplate Reader (or a different luminescence microplate reader)	Promega	GM3000
Growth medium dedicated to the cell line used
Materials and reagents for standard molecular cloning (bacteria, thermostable polymerase, restriction enzymes, DNA ligase, materials and reagents for nucleic acid purification)
NanoBiT MCS Starter System	Promega	N2014	This kit contains vectors enabling tagging of the proteins of interest with NanoBiT fragments at different orientations as well as the control plasmid encoding HaloTag protein fused with SmBiT and a positive control plasmid pair.
Nano-Glo Live Cell Assay System	Promega	N2011	This kit contains furimazine, which is a substrate enabling detection of the NanoLuc activity in living cells, and a dedicated dilution buffer.
Opti-MEM I Reduced Serum Medium, no phenol red	Gibco	11058021
Oribital shaker
Software for data analysis (e.g. GraphPad Prism)
Thermocycler