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Resumo

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neurorregenerativa de glia ensheathing glia (OEG), após lesão neural. Baseia-se em uma cocultura de neurônios gânglios de retina adulto axotomizados (RGN) em monocamadas OEG e estudo subsequente de regeneração axonal, analisando marcadores axonal e somatodendritic RGN.

Resumo

As células de glia ensheathing olfativas (OEG) são localizadas desde a mucosa olfativa até e para a camada nervosa olfativa (ONL) da lâmpada olfativa. Ao longo da vida adulta, eles são fundamentais para o crescimento axonal de neurônios olfativos recém-gerados, da lamina propria ao ONL. Devido às suas propriedades pró-regenerativas, essas células têm sido usadas para promover a regeneração axonal em modelos de lesão medular ou nervo óptico.

Apresentamos um modelo in vitro para avaliar e medir a capacidade neurorregenerativa do OEG após lesão neural. Neste modelo, o OEG humano reversivelmente imortalizado (ihOEG) é cultivado como uma monocamada, as retinas são extraídas de ratos adultos e neurônios de gânglios retinais (RGN) são coculturados na monocamada OEG. Após 96 h, marcadores axonais e somatodendritic em RGNs são analisados por imunofluorescência e o número de RGNs com axônio e o comprimento/neurônio axonal médio são quantificados.

Este protocolo tem a vantagem sobre outros ensaios in vitro que dependem de neurônios embrionários ou pós-natais, que avaliam propriedades neuroregenerativas OEG no tecido adulto. Além disso, não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenera do ihOEG, mas pode ser estendido para diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

Introdução

Os neurônios do sistema nervoso central adulto (SNC) têm capacidade regenerativa limitada após lesão ou doença. Uma estratégia comum para promover a regeneração do SNC é o transplante, no local da lesão, de tipos celulares que induzem o crescimento axonal, como células-tronco, células schwann, astrócitos ou células ensheathing glia (OEG)1,2,3,4,5.

OEG deriva da crista neural6 e se localiza na mucosa olfativa e na lâmpada olfativa. No adulto, neurônios sensoriais olfativos morrem regularmente como resultado da exposição ambiental e são substituídos por neurônios recém-diferenciados. O OEG circunda e guia esses novos axônios olfativos para entrar na lâmpada olfativa e estabelecer novas sinapses com seus alvos no CNS7. Devido a esses atributos fisiológicos, o OEG tem sido utilizado em modelos de lesão de SNC, como lesão medular ou nervo óptico e suas propriedades neurorregenerativas e neuroprotetoras se tornamcomprovadas 8,9,10,11. Vários fatores foram identificados como responsáveis pelas características pró-regenerativas dessas células, incluindo a produção ou secreção de proteases de matriz extracelular ou secreção dos fatores de crescimento neurotrófico e axonal12,13,14.

Dadas as limitações técnicas para expandir as células primárias de OEG, estabelecemos e caracterizamos linhas clonais de OEG humano igênitas reversíveis (ihOEG), que fornecem um fornecimento ilimitado de OEG homogêneo. Estas células ihOEG derivam de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas em autópsias. Eles foram imortalizados pela transdução da subunidade catalítica telomerase (TERT) e do oncogene Bmi-1 e modificados com o vírus SV40 grande antígeno T15,16,17,18. Duas dessas linhas celulares ihOEG são Ts14, que mantém a capacidade regenerativa das culturas originais e Ts12, uma linha regenerativa baixa que é usada como baixo controle de regeneração nesses experimentos18.

Para avaliar a capacidade de OEG para promover a regeneração axonal após lesão neural, vários modelos in vitro foram implementados. Nesses modelos, o OEG é aplicado a culturas de diferentes origens neuronais e formação de neurita e alongamento — em resposta à cocultura gliana — são avaliados. Exemplos dessas fontes neuronais são neurônios corticais neonatais de ratos19, feridas de arranhão realizadas em neurônios embrionários de ratos de tecido cortical20, explanações de retina de rato21,neurônios hipotalâmicos ou hipocampais22,23, neurônios gânglios de raiz dorsal de rato pós-natal24, neurônios do trato corticospinal do camundongo pós-natal25, neurônios NT2 humanos26, ou neurônios corticais cerebrais pós-natal em culturas de cicatriz de astrócito reativas27.

Nesses modelos, no entanto, o ensaio de regeneração conta com neurônios embrionários ou pós-natais, que têm uma plasticidade intrínseca que está ausente em neurônios adultos feridos. Para superar essa desvantagem, apresentamos um modelo de regeneração axonal adulta em coculturas de linhas de OEG com neurônios gânglios de retina adulta (RGNs), baseado no originalmente desenvolvido por Wigley et al.28,29,30,31 e modificados e usados pelo nosso grupo12,13,14,15,16,17,18,32,33. Resumidamente, o tecido retiniano é extraído de ratos adultos e digerido com papain. A suspensão das células de retina é então banhada em deslizamentos tratados com polilise ou em monocamadas Ts14 e Ts12. As culturas são mantidas por 96 h antes de serem fixadas e, em seguida, a imunofluorescência para proteínas axona (MAP1B e NF-H)34 e somatodendritic (MAP2A e B)35 marcadores são realizados. A regeneração axonal é quantificada como uma porcentagem de neurônios com axônio, em relação à população total de RGNs e o índice de regeneração axonal é calculado como o comprimento axonal médio por neurônio. Este protocolo não é apenas útil para avaliar o potencial neuroregenerativo do IhOEG, mas pode ser estendido a diferentes fontes de OEG ou outras células gliais.

Protocolo

NOTA: A experimentação animal foi aprovada pelos comitês nacionais e institucionais de bioética.

1. ihOEG (Ts12 e Ts14) cultura

NOTA: Este procedimento é feito em condições estéreis em um armário de biossegurança da cultura tecidual.

  1. Prepare o meio de cultura OEG ME10 de 50 mL conforme previsto na Tabela 1.
  2. Prepare 5 mL de DMEM/F12-FBS, conforme fornecido na Tabela 1, em tubo cônico de 15 mL.
  3. Aqueça ambas as mídias a 37 °C em um banho de água limpa, por 15 minutos.
  4. Descongele os frascos de células Ts12 e Ts14 a 37 °C em um banho de água limpa.
  5. Resuspend e adicione células ao meio de cultura DMEM/F12-FBS preparado na etapa 2.
  6. Centrífuga por 5 min a 200 x g.
  7. Aspire o supernatante.
  8. Adicione 500 μL de me10 médio e resuspense a pelota.
  9. Prepare um prato de cultura celular p60 com 3 mL de ME10 e adicione a suspensão celular, dropwise.
  10. Mova-se para distribuir as células uniformemente através da placa.
  11. Células de cultura a 37 °C em 5% DE CO2.
    NOTA: Depois de atingir a confluência, pelo menos outra passagem deve ser feita para otimizar as células para a cocultura. 90% de confluência é necessária antes de semeá-las nas tampas para cocultura. Um p-60 confluente tem um número celular médio de 7 x 105 para Ts14 e 2,5 x 106 para linhas celulares Ts12. As linhas de celular Ts12 e Ts14 devem ser passagem a cada 2-3 dias.

2. Preparação do ihOEG (Ts12 e Ts14) para o ensaio

NOTA: Esta etapa deve ser feita 24 horas antes da dissecção e cocultura da RGN.

  1. Trate as tampas de 12 mm Ø com 10 μg/mL de poli-l-lisina (PLL) por 1 h.
    NOTA: Os deslizamentos podem ser deixados durante a noite na solução PLL.
  2. Lave as tampas com 1x de soro fisiológico tampão de fosfato (PBS), três vezes.
  3. Despete células Ts12 e Ts14 ihOEG do prato de cultura celular p60.
    1. Adicione 4 mL de meio de cultura DMEM/F12-FBS(Tabela 1) a um tubo cônico de 15 mL. Aqueça a 37 °C em um banho de água limpa.
    2. Remova o meio das placas e lave as células com 1 mL de 1x PBS-EDTA, uma vez.
    3. Adicione 1 mL de trypsin-EDTA às células OEG e incubar por 3-5 min a 37 °C, 5% CO2.
    4. Colete células com uma pipeta p1000 e transfira-as para o meio preparado na etapa 3.1.
    5. Centrífuga por 5 min a 200 x g.
    6. Aspire o supernatante.
    7. Adicione 1 mL de média ME10 e resuspense a pelota.
    8. Conte o número da célula em um hemócito.
  4. Semente 80.000 células Ts14 ou 100.000 células Ts12/bem nas tampas em placas de 24 poços em 500 μL de me10 médio.
  5. Células de cultura a 37 °C em 5% de CO2, por 24 h.

3. Dissecção do tecido retiniano

NOTA: Ratos Wistar machos de 2 meses de idade são usados como fonte RGN. Duas retinas (um rato) para 20 poços de um prato de célula de 24 poços. Material cirúrgico autoclave antes do uso. O kit de dissociação papain é comprado comercialmente(Tabela de Materiais). Siga as instruções do provedor para a reconstituição. Reconstituir D,L-2-amino-5-ácido fosfosfosfonovalerico (APV) em estoque de 5 mM e preparar as alíquotas.

  1. No dia do ensaio, prepare a seguinte mídia.
    1. Prepare um prato de cultura celular p60 com 5 mL de EBSS frio (frasco 1 do kit de dissociação papain).
    2. Prepare um prato de cultura celular p60 com frasco reconstituído 2 (papain) do kit de dissociação papain mais 50 μL de APV.  Em seguida, adicione 250 μL de frasco desprointitulado 3 (DNase mais 5 μL de APV).
    3. Em uma mistura de tubo estéril de 2,7 mL de frasco 1 com 300 μL de frasco 4 (inibidor de protease albumina-ovomucoid). Adicione 150 μL de frasco 3 (DNase) mais 30 μL de APV.
    4. Prepare 20 mL de neurobasal-B27 médio (NB-B27) conforme previsto na Tabela 1.
  2. Sacrifique um rato por asfixia com CO2.
  3. Remova a cabeça por decapitação com guilhotina; colocá-lo em uma placa de Petri de 100 mm e pulverizar a cabeça com etanol 70% antes de colocá-lo em um capô de fluxo laminar.
  4. Corte os bigodes do rato com uma tesoura para que não interfiram com a manipulação dos olhos.
  5. Segure o nervo óptico com fórceps para puxar o globo ocular o suficiente para ser capaz de fazer uma incisão através do olho com um bisturi.
  6. Remova a lente e o humor vítreo e puxe a retina (tecido laranja), enquanto as camadas restantes do olho ficam dentro (incluindo a camada epitelial do pigmento).
  7. Coloque a retina no prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.1.
  8. Transfira a retina para o prato de cultura celular p60 preparado na etapa 3.1.2 e corte-a com o bisturi em pequenos pedaços de tamanho aproximado < 1 mm.
  9. Transfira para um tubo de plástico de 15 mL.
  10. Incubar o tecido por 30 minutos, em uma incubadora umidificada a 37 °C abaixo de 5% de CO2,com agitação a cada 10 minutos.
  11. Dissociar aglomerados de células por pipetting para cima e para baixo com uma pipeta Pasteur de vidro.
  12. Centrifugar a suspensão celular a 200 x g por 5 min.
  13. Descarte o supernaente e inativar o papain, resuspenque a pelota celular na solução preparada na etapa 3.1.3. (1,5 mL para 2 olhos).
  14. Encolé-lo cuidadosamente em 5 mL de frasco reconstituído 4.
  15. Centrifugar a 200 x g por 5 min.
  16. Enquanto centrifuga, remova completamente o meio ME-10 da placa de célula de poço OEG 24 (previamente preparado na etapa 2) e substitua-o por 500 μL de meio NB-B27 por poço.
  17. Descarte o supernasce e resuspenque as células em 2 mL de meio NB-B27.
  18. Placa 100 μL de suspensão celular de retina, por poço da placa m24, em deslizamentos de monocamadas tratados com PLL ou OEG.
  19. Mantenha as culturas a 37 °C com 5% de CO2 para 96 h no meio NB-B27.

4. Imunostaining

  1. Após 96 h, fixar as células por 10 min adicionando o mesmo volume de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS ao meio de cultura (600 μL) (concentração final pfa 2%).
  2. Remova a mídia e o PFA da placa de 24-multiwell e adicione mais uma vez 500 μL de 4% de paraformaldeído (PFA) em 1x PBS. Incubar por 10 minutos.
  3. Descarte o fixador e lave 3 vezes com 1x PBS por 5 minutos.
  4. Bloco com 0,1% Triton X-100/1% FBS em PBS (PBS-TS) por 30-40 min.
  5. Prepare os anticorpos primários no tampão PBS-TS da seguinte forma: Anticorpo monoclonal SMI31 (contra proteínas MAP1B e NF-H) (1:500). 514 (reconhece proteínas MAP2A e B) antiserum policlonal de coelho (1:400).
  6. Adicione anticorpos primários às coculturas e incubar durante a noite a 4 °C.
  7. No dia seguinte, descarte os anticorpos e lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 minutos.
  8. Prepare os anticorpos secundários no buffer PBS-TS da seguinte forma: Para SMI-31, anti-mouse Alexa Fluor 488 (1:500). Para 514, anti-coelho Alexa-594 (1:500).
  9. Incubar células com os anticorpos secundários fluorescentes correspondentes por 1h, em RT, no escuro.
  10. Lave as tampas com 1x PBS, 3 vezes, por 5 min, no escuro.
  11. Por fim, monte as tampas com meio de montagem(Tabela de Materiais) e mantenha a 4 °C.
    NOTA: Sempre que necessário, pode ser realizada a coloração de núcleos fluorescentes com DAPI (4,6-diamidino-2-fenilôndole). Antes de montar, incubar as células por 10 minutos no escuro com DAPI (10 μg/mL em 1x PBS). Lave as tampas 3 vezes com 1x PBS e, finalmente, monte as tampas com o meio de montagem.

5. Quantificação da regeneração axonal

NOTA: As amostras são quantificadas sob o objetivo de 40x de um microscópio de epifluorescência. Um mínimo de 30 fotos devem ser tiradas em campos aleatórios, com pelo menos 200 neurônios, a serem quantificadas para cada tratamento. Cada experimento deve ser repetido um mínimo de três vezes.

  1. Quantifique a porcentagem de neurônios com axônio (neurite positivo SMI31) em relação à população total de RGNs (identificada com map2A/B 514 imunostaining positivo do corpo neuronal e dendritos).
  2. Quantifique o índice de regeneração axonal ou o comprimento axonal médio (μm/neurônio). Este parâmetro é definido como a soma dos comprimentos (em μm) de todos os axônios identificados, divididos pelo número total de neurônios contados, apresentando um axônio ou não. O comprimento axonal é determinado usando o neuronj plugin do software de imagem ImageJ (NIH-USA).
  3. Calcule a média, o desvio padrão e a significância estatística usando o software apropriado.

Resultados

Neste protocolo, apresentamos um modelo in vitro para avaliar a capacidade neuroregenerativa de OEG após lesão neuronal. Como mostrado na Figura 1, a fonte OEG é uma linha de células clonal oeg humana imortalizada reversível -Ts14 e Ts12-, que deriva de culturas primárias, preparadas a partir de lâmpadas olfativas obtidas nas autópsias15,17,18. O tecido retiniano é extraído de ratos adulto...

Discussão

O transplante de OEG em locais de lesão do CNS é considerado uma terapia promissora para lesão do CNS devido às suas propriedades pró-neuroregenerativas constitutivas7,8,9. No entanto, dependendo da fonte de tecido — mucosa olfativa (OM-OEG) versus lâmpada olfativa (OB-OEG)— ou a idade do doador, existe uma variação considerável nessa capacidade26,31,

Divulgações

Os autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo projeto SAF2017-82736-C2-1-R do Ministerio de Ciencia e Innovación para o MTM-F e pela Fundación Universidad Francisco de Vitória ao JS.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
antibody 514Reference 34Rabbit polyclonal antiserum, which recognizes MAP2A and B.
antibody SMI-31BioLegend801601Monoclonal antibody against MAP1B and NF-H proteins
anti-mouse Alexa Fluor 488 antibodyThermoFisherA-21202
anti-rabbit Alexa Fluor 594 antibodyThermoFisherA-21207
B-27 SupplementGibco17504044
D,L-2-amino-5-phosphonovaleric acidSigma283967NMDA receptor inhibitor
DAPISigmaD9542Nuclei fluorescent stain
DMEM-F12Gibco11320033Cell culture medium
FBSGibco11573397Fetal bovine serum
FBS-HycloneFisher Scientific16291082Fetal bovine serum
FluoromountSouthern Biotech0100-01Mounting medium
ImageJNational Institutes of Health (NIH-USA)Image software
L-GlutamineLonzaBE17-605F
Neurobasal MediumGibco21103049Neuronal cells culture medium
Papain Dissociation SystemWorthington Biochemical CorporationLK003150For use in neural cell isolation
PBSHome made
PBS-EDTALonzaH3BE02-017F
Penicillin/Streptomycin/Amphotericin BLonza17-745EBacteriostatic and bactericidal
Pituitary extractGibco13028014Bovine pituitary extract
Poly -L- lysine (PLL)SigmaA-003-M

Referências

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