Fluxo de trabalho de proteômica quantitativa sem rótulo para interações de patógenos de host-pathogen orientadas para a descoberta

Resumo

Aqui, apresentamos um protocolo para traçar o perfil entre hospedeiro e patógeno durante a infecção por proteômica baseada em espectrometria de massa. Este protocolo usa quantificação livre de rótulos para medir mudanças na abundância de proteínas tanto do hospedeiro (por exemplo, macrófagos) quanto de patógenos (por exemplo, Cryptococcus neoformans) em um único experimento.

Resumo

As realizações tecnológicas da proteômica quantitativa baseada em espectrometria de massa (MS) abrem muitas vias desconhecidas para analisar o proteome global de um organismo em condições variadas. Esta poderosa estratégia aplicada às interações de patógenos microbianos com o hospedeiro desejado caracteriza de forma abrangente ambas as perspectivas para a infecção. Aqui, o fluxo de trabalho descreve a quantificação sem rótulos (LFQ) do infectome de Cryptococcus neoformans, um patógeno intracelular facultativo fúngico que é o agente causador da doença mortal criptococcose, na presença de células macrófagos imortalizadas. O protocolo detalha as técnicas adequadas de preparação de proteínas para células patógenas e mamíferos dentro de um único experimento, resultando em submissão adequada de peptídeos para análise de cromatografia líquida (LC)-MS/MS. A natureza genérica de alto rendimento do LFQ permite uma ampla gama dinâmica de identificação e quantificação de proteínas, bem como transferência para qualquer configuração de infecção por hospedeiro-patógeno, mantendo extrema sensibilidade. O método é otimizado para catalogar perfis extensos e imparcial de abundância de proteínas de um patógeno em condições de imitação de infecções. Especificamente, o método aqui demonstrado fornece informações essenciais sobre a patogênese C. neoformans, como a produção de proteínas necessárias para a virulência e identifica proteínas críticas de hospedeiro que respondem à invasão microbiana.

Introdução

A prevalência de infecções fúngicas invasivas está aumentando muito e está correlacionada com taxas inaceitáveis de mortalidade elevadas, mais comumente relatadas em indivíduos com predisposições imunodeficientes¹. Cryptococcus neoformans é um notória patógeno fúngico oportunista capaz de sobrevivência intracelular dentro de células macrófagos hospedeiras. Intervenção antifúngica inadequada resulta em disseminação fúngica e manifestações de risco de vida de meningite criptocócica e meningoencefalite^2,3. O aumento global do status imunocomprometido exigiu um aumento paralelo no ....

Protocolo

Uma linha imortalizada de macrófagos derivados de camundongos BALB/c foram usados para o seguinte protocolo aprovado pelo Protocolo de Utilização animal da Universidade de Guelph 4193. Notavelmente, outras cepas de camundongos ou outras fontes de células imortalizadas podem ser aplicadas ao protocolo delineado com testes suficientes para otimizar os parâmetros detalhados. O protocolo a seguir navegará pelas etapas que começam com um frasco congelado de células macrófagos. As células são armazenadas em 10% FBS (soro bovino fetal), 1% L-glutamina e 5% pen/estreptomicina (penicilina-estreptomicina) à mistura DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) e 20% DMSO (sulfóxido d....

Resultados

O protocolo descrito acima permite a identificação e quantificação de proteínas derivadas tanto do patógeno fúngico, C. neoformans, quanto do hospedeiro, células macrófagos, em um único experimento. Seguindo a cocultura, as células são coletadas e processadas juntas e bioinformáticas separadas com base em perfis de peptídeos específicos para cada espécie. Esta é uma abordagem poderosa para definir a interação da relação hospedeiro-patógeno durante a infecção. O número de proteínas ident.......

Discussão

As etapas críticas do protocolo incluem a preparação de células macrófagos e a coleta de amostras de co-cultura para processamento de proteínas com interrupção mínima das células. É importante realizar etapas de lavagem, inoculação e remoção de células macrófagos aderentes suavemente e cuidadosamente para evitar a lise desnecessária das células antes da coleta. Estabelecer o MOI correto para o experimento também é fundamental, pois a inoculação com um MOI excessivamente alto pode causar morte rápi.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mM Tris-HCl, pH 8.5	Fisher Scientific	BP152-1	Maintain at 4°C
60 x 15 mm Dish, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
6-well cell culture plate	ThermoFisher Scientific	140675
Acetonitrile, MS grade	Pierce	TS-51101
Acetic Acid	Sigma Aldrich	1099510001
Acetone	Sigma Aldrich	34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Prepare a stock 50 mM ABC solution, stable at room temperature for up to one month.
Bel-Art™ HiFlow Vacuum Aspirator Collection System	Fisher Scientific	13-717-300	Not essential, serological pipettes can be used to remove media.
C18 resin	3M Empore	3M2215
Cell Scrapers	VWR	10062-906	Not essential, other methods to release macrophage cells can be used.
Centrifugal vaccuum concentrator	Eppendorf	07-748-15
Complete Filtration Unit	VWR	10040-436
Conical falcon tubes (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Countess II Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Not essential, haemocytometer can be used as an alternative.
CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay	Promega	G1780
Dithiothreitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Prepare bulk stock solution of 1 M DTT, flash frozen and stored at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	10566016
Fetal Bovine Serum (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Heat inactivate by incubating at 60°C for 30 minutes. Prepare 50 ml aliquots and flash freeze. Thaw prior to media preparation
Haemocytometer	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
High-performance liquid chromatography system	ThermoFisher Scientific	LC140	Gradient length is based on sample complexity, recommended 120 min gradient for infectome samples.
High-resolution mass spectrometer	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacetamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Prepare 0.55 M bulk stock solution, flash frozen, store at -20°C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
LoBind Microcentrifuge tubes	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant is a public platform that offers tutorials, such as the MaxQuant Summer School, outlining the computational analysis steps of large MS data sets
Microcentrifuge	Eppendorf	13864457
Penicillin : Streptomycin 10k/10k	VWR	CA12001-692	Can be aliquot and frozen for storage. Thaw prior to media preparation.
Peptide separation columns	ThermoFisher Scientific	ES803
Perseus Software	http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline	VWR	CA12001-676	Puchase not required. PBS can also be prepared but sterile filteration must be performed before use.
Pierce BCA Protein Assay	ThermoFisher Scientific	23225
Pipette, Disposable Serological (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11E
Pipette, Disposable Serological (25 mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
Probe sonciator	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Protease inhibitor cocktail tablet	Roche	4693159001
Sodium dodecyl sulfate	ThermoFisher Scientific	28364	20% (w/v)
Spectrophotometer (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE tipping centrifuge	Sonation	STC-V2
Thermal Shaker	VWR	NO89232-908
Trifluoroacetic acid	ThermoFisher Scientific	85183
Trypsin/Lys-C protease mix, MS grade	Pierce	A40007	Maintain at -20 °C.
Ultrasonic bath	Bransonic	A89375-450	Stored in cold room (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Prepare 40 mM HEPES/8 M Urea in bulk stock solution, flash frozen, store at -20 °C until use. Discard after each use (do not freeze-thaw repeatedly).
Yeast-extract peptone dextrose broth	BD Difco	BM20