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Neste Artigo

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  • Agradecimentos
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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

Este protocolo fornece um método eficiente de digestão de colagenase para isolamento de adipócitos viáveis e células da fração vascular estromal-SVF da gordura visceral humana em um único processo, incluindo metodologia para obtenção de RNA de alta qualidade a partir de adipócitos e fenotipificação de macrófagos SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para análise por citometria de fluxo.

Resumo

O tecido adiposo visceral (TAV) é um órgão metabólico ativo composto principalmente por adipócitos maduros e células da fração vascular estromal (FRS), que liberam diferentes moléculas bioativas que controlam processos metabólicos, hormonais e imunológicos; Atualmente, não está claro como esses processos são regulados dentro do tecido adiposo. Portanto, o desenvolvimento de métodos que avaliem a contribuição de cada população celular para a fisiopatologia do tecido adiposo é crucial. Este protocolo descreve as etapas de isolamento e fornece as diretrizes de solução de problemas necessárias para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e SVF de biópsias de TAV humano em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase. Além disso, o protocolo também é otimizado para identificar subgrupos de macrófagos e realizar isolamento de RNA de adipócitos maduros para estudos de expressão gênica, o que permite a realização de estudos dissecando a interação entre essas populações celulares. Resumidamente, as biópsias de IVA são lavadas, picadas mecanicamente e digeridas para gerar uma suspensão de célula única. Após a centrifugação, adipócitos maduros são isolados por flutuação do pellet de SVF. O protocolo de extração de RNA garante um alto rendimento de RNA total (incluindo miRNAs) de adipócitos para ensaios de expressão a jusante. Simultaneamente, as células SVF são usadas para caracterizar subtipos de macrófagos (fenótipo pró e anti-inflamatório) por meio da análise por citometria de fluxo.

Introdução

O tecido adiposo branco é composto não apenas por células adiposas ou adipócitos, mas também por uma fração de células não adiposas conhecida como fração vascular estromal (FVS), que contém uma população celular heterogênea constituída por macrófagos, outras células imunes como células T reguladoras (Tregs), eosinófilos, pré-adipócitos e fibroblastos, circundados por tecido vascular e conjuntivo 1,2. O tecido adiposo (TA) é hoje considerado um órgão que regula processos fisiológicos relacionados ao metabolismo e à inflamação por meio de adipocinas, citocinas e microRNAs produzidos e liberados por diferentes células no tecido, com efeitos autócrinos, parácrinos e endócrinos 3,4. Em humanos, o tecido adiposo branco compreende o tecido adiposo subcutâneo (TAS) e o tecido adiposo visceral (TAV), com importantes diferenças anatômicas, moleculares, celulares e fisiológicas entre eles 2,5. O TSA representa até 80% do TA humano, enquanto o TAA localiza-se dentro da cavidade abdominal, principalmente no mesentério e omento, sendo metabolicamente maisativo6. Além disso, o TAV é um órgão endócrino que secreta mediadores com impacto substancial no peso corporal, sensibilidade à insulina, metabolismo lipídico e inflamação. Consequentemente, o acúmulo de TAV leva à obesidade abdominal e a doenças relacionadas à obesidade, como diabetes tipo 2, síndrome metabólica, hipertensão e risco de doença cardiovascular, representando um melhor preditor de mortalidade associada à obesidade 6,7,8,9.

Em condições homeostáticas, adipócitos, macrófagos e outras células imunes cooperam para manter o metabolismo do LV através da secreção de mediadores anti-inflamatórios10. No entanto, a expansão excessiva do TAV promove o recrutamento de células T ativadas, células NK e macrófagos. De fato, no LV magro, a proporção de macrófagos é de 5%, enquanto na obesidade essa relação sobe até 50%, com polarização dos macrófagos do fenótipo anti-inflamatório para o pró-inflamatório, gerando um ambiente inflamatório crônico10,11.

Como consequência da pandemia de obesidade, um número surpreendente de relatos tem surgido abordando diferentes tópicos de pesquisa em TAV, incluindo biologia de adipócitos, epigenética, inflamação, propriedades endócrinas, áreas emergentes como vesículas extracelulares, entre outros 8,10,12,13. No entanto, embora o ambiente de LV seja definido pelo crosstalk entre adipócitos e macrófagos residentes ou chegantes, a maioria dos estudos tem focado em apenas uma população celular, e há poucas informações sobre a interação dessas células no TAV e suas consequências fisiopatológicas11,14. Além disso, estudos valiosos abordando a interação adipócito-macrófago no TA foram realizados utilizando linhagens celulares, sem as condições de priming in vivo 11,14,15. Uma estratégia adequada para dissecar a interação ou a contribuição particular dessas células no TAV requer o isolamento de ambos os tipos celulares da mesma biópsia de gordura para realizar ensaios in vitro que espelhem o mais semelhante possível as propriedades in vivo que regulam o metabolismo do TAV.

Embora os métodos de dissociação não enzimática baseados em forças mecânicas para quebrar o TA garantam mínima manipulação, esses métodos não podem ser utilizados se o objetivo for estudar as células da FVS, pois apresentam menor eficiência na recuperação celular e baixa viabilidade celular em comparação aos métodos enzimáticos, sendo necessário maior volume de tecido16,17. A digestão enzimática com colagenase é um método suave que permite a digestão adequada do colágeno e das proteínas da matriz extracelular de tecidos fibrosos, como o WAT18, e é frequentemente utilizada quando a tripsina é ineficaz ou lesiva19. O protocolo fornece diretrizes fundamentais de solução de problemas para o isolamento eficiente de adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias humanas de IVA em um único processo, usando uma técnica de digestão enzimática de colagenase, fornecendo informações para garantir altos rendimentos (quantidade, pureza e integridade) de RNA total de adipócitos maduros, incluindo microRNAs, para aplicações de expressão a jusante. Simultaneamente, o protocolo é otimizado para identificar subtipos de macrófagos de células SVF através da coloração de múltiplos marcadores ligados à membrana para posterior análise por citometria de fluxo20.

Protocolo

Este protocolo foi aprovado pelo CEP do Instituto Nacional de Perinatologia (212250-3210-21002-06-15). A participação foi voluntária e todas as mulheres inscritas assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

1. Coleção de tecido adiposo visceral

  1. Obter biópsias de IVA através de omentectomia parcial durante cesariana de mulheres adultas saudáveis com gravidez única a termo sem trabalho de parto.
  2. Após o fechamento uterino e hemostasia, proceder à identificação do omento maior e estendê-lo em compressa úmida. O AT exposto é IVA.
  3. Localize o maior vaso sanguíneo e trace uma linha imaginária de 7 x 5 cm até a base do omento maior.
  4. Identifique uma zona avascular e use pinças Kelly para perfurar o lado externo do VAT.
  5. Use pinça de Ochsner para pinçar o lado proximal e distal na zona onde o IVA foi perfurado e use tesoura de Metzenbaum para cortar o tecido.
  6. Amarre o omento maior com seda preta número 1.
  7. Retirar a pinça de Ochsner e avaliar a hemostasia.
  8. Coloque a biópsia em um recipiente estéril e transporte-a para o laboratório imediatamente.

2. Digestão enzimática do tecido adiposo visceral e isolamento de adipócitos maduros e células da fração vascular estromais

  1. Pesar a biópsia de IVA e enxaguar com 1x PBS pH 7,4.
  2. Corte 4 g de IVA e use uma tesoura para picar o tecido em pequenos pedaços em uma bandeja de dissecção.
  3. Transfira o IVA picado para um tubo centrífugo estéril de 50 mL, adicione 20 mL de PBS e agite suavemente para remover o excesso de glóbulos vermelhos.
  4. Descarte o PBS e repita o procedimento duas vezes.
  5. Transfira o IVA para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL e adicione 25 mL de solução de digestão (colagenase tipo II a 0,25%, glicose a 5 mM, albumina a 1,5% em PBS).
  6. Incubar a 37 °C durante 60 min num agitador orbital a 125 rpm.
  7. Filtrar o tecido digerido através de três camadas de gaze para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL.
  8. Centrifugar a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  9. Duas fases são obtidas, uma fase superior que corresponde aos adipócitos maduros, enquanto as células SFV permanecem na pelota. Transfira suavemente os adipócitos maduros para um novo tubo centrífugo estéril de 50 mL usando uma pipeta de transferência.
  10. Adicionar 20 ml de PBS frio, agitar suavemente e centrifugar a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C.
  11. Descarte o PBS e repita o procedimento duas vezes.
  12. Use uma pipeta de transferência para transferir suavemente os adipócitos maduros para um tubo de microcentrífuga livre de DNase-RNase de 1,5 mL.
  13. Centrifugar a 200 x g durante 1 min a 4 °C e remover o excesso de PBS utilizando uma micropipeta P200. Repita esta etapa, se necessário.
  14. Transfira suavemente 300 μL de suspensão de adipócitos maduros para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL sem DNase-RNase. Armazenar adipócitos maduros a -80 °C até a extração de RNA.
    NOTA: Os adipócitos não formam uma pelota.
  15. Uma vez separados os adipócitos (passo 2.9), aspirar a maior parte da solução de digestão com uma pipeta de transferência, mantendo o pellet de SVF no fundo do tubo.
  16. Transfira o pellet com células SVF para um novo tubo centrífugo de 50 mL usando uma pipeta de transferência.
  17. Lave suavemente o pellet celular, ressuspendendo em 20 mL de PBS 1x frio por pipetagem para cima e para baixo.
  18. Centrifugar a 800 x g durante 5 min a 4 °C e eliminar rapidamente o sobrenadante por decantação.
  19. Execute uma segunda lavagem repetindo as etapas 2.17 e 2.18.
  20. Adicionar 5 mL de tampão de lise de hemácias equilibrado à temperatura ambiente (TR) ao pastlet de SVF e suspender por pipetagem repetida. Não vórtice.
  21. Incubar por 5 min em TR e centrifugar por 5 min a 800 x g. Remova cuidadosamente o sobrenadante usando uma pipeta de transferência e descarte corretamente.
  22. Para neutralizar o tampão de lise, adicione 10 mL de PBS 1x frio e misture suavemente até que o pellet celular se desapareça.
  23. Centrifugar a 800 x g por 5 min para obter o pellet SVF e descartar PBS. Um pellet branco deve ser visível na parte inferior do tubo.
  24. Ressuspender as células em 5 mL de PBS 1x em TR por pipetagem repetida e filtrada através de três camadas de gaze em um novo tubo cônico de 50 mL. Posteriormente, estas células serão utilizadas para caracterização da subpopulação de macrófagos por citometria de fluxo.

3. Extração de RNA de adipócitos maduros

  1. Prepare uma área limpa, usando spray de descontaminação de RNase para evitar a degradação do RNA. Use um conjunto de pipetas reservadas para procedimentos de RNA. Todos os tubos e pontas empregados devem ser livres de RNase.
  2. Descongelar a suspensão de adipócitos maduros (secção 2.14) a 4 °C se tiver sido armazenada a -80 °C.
    NOTA: Evite vários ciclos de congelamento-descongelamento.
  3. Lise as células adicionando 1.000 μL de reagente à base de ácido-guanidínio-fenol e misture completamente com uma micropipeta P1000 para homogeneizar.
  4. Incubar por 5 min em RT para aumentar a dissociação de complexos de nucleoproteínas.
  5. Centrifugar lisado celular por 5 min a 12.000 x g em TR. Serão obtidas três fases: uma fase superior (amarela) correspondente aos lipídios dos adipócitos, uma fase média (rosa) correspondente aos ácidos nucléicos e uma pelota (debris celulares).
  6. Retire cuidadosamente a camada lipídica, utilizando uma micropipeta P200.
  7. Transferir a fase intermediária para um novo tubo de 2 mL, evitando que o resquício lipídico e a pastilha perturbem (aproximadamente 700 μL).

4. Purificação do RNA total, incluindo microRNAs

NOTA: Um método de purificação de RNA total baseado em coluna é usado para obter RNA total de alta qualidade.

  1. Adicionar um volume igual de etanol (95%–100%) à amostra da secção 3.7, aproximadamente 700 μL, e misturar invertendo manualmente o tubo durante 10 s.
  2. Transferir 700 μL da mistura para uma coluna inserida num tubo de recolha, centrifugar e eliminar o fluxo.
  3. Recarregue a coluna e repita a etapa 4.2.
  4. Transfira a coluna para um novo tubo de coleta.
  5. Adicionar 400 μL de tampão de pré-lavagem à coluna e à centrífuga. Descarte o fluxo e repita esta etapa.
  6. Adicionar 700 μL de tampão de lavagem à coluna e centrifugar durante 2 min.
  7. Transfira a coluna cuidadosamente para um tubo livre de nucleases.
  8. Adicionar 50 μL de água livre de nucleases diretamente à matriz da coluna e eluir o RNA por centrifugação. Preparar alíquotas de 10 μL utilizando tubos de microfuga de 200 μL.
  9. Coloque imediatamente alíquotas no gelo e use uma delas para determinar a concentração e pureza do RNA.
  10. Preparar uma alíquota de 5 μL de RNA total ajustada para 100 ng/μL para medir a integridade do RNA e a concentração de microRNA.
  11. Conservar a -80 °C até à utilização.

5. Determinação da concentração, pureza e integridade do RNA dos adipócitos maduros; ensaio de quantificação de microRNA

NOTA: As determinações da concentração e pureza do RNA são realizadas usando um espectrofotômetro UV-Vis; A integridade do RNA e a quantificação do miRNA são realizadas usando um analisador de controle de qualidade de RNA.

  1. Lave o leitor de amostras com água de grau molecular e limpe.
  2. Carregue 2 μL de água de eluição (em branco), altere a configuração para RNA e clique no botão Em branco .
  3. Carregue 2 μL de amostra e clique no botão Medir .
  4. Após a conclusão da leitura, registre as relações A260/A280 e A260/A230, bem como a quantidade de RNA (ng/μL) (Figura 1A).
    NOTA: RNA com OD260/OD280 e OD260/OD230 razão em torno de 2,0 é considerado puro.
  5. Meça o número de integridade do RNA (NIR) usando um kit de integridade do RNA seguindo as instruções do fabricante (Figura 1B).
    NOTA: UM RIN =10 corresponde ao RNA intacto, enquanto um RIN ≤ 3,0 indica um RNA fortemente degradado. Para microarrays de expressão ou RT-qPCR, utilizar RNA com RIN ≥ 6.0.
  6. Use um pequeno kit de RNA para determinar a concentração e a porcentagem de microRNAs, seguindo as instruções do fabricante (Figura 1C).
    NOTA: Para evitar a superestimação de pequenos e micro RNAs, use amostras de RNA com RIN ≥ 6.0.

6. Contagem e viabilidade de células da fração vascular estromal

  1. Diluir 10 μL da suspensão de células SVF (secção 2.24) em 90 μL de Solução de Azul de Tripano a 0,4% (diluição final 1:10) e aplicar 10 μL num hemocitómetro padrão.
  2. Conte cuidadosamente as células viáveis, excluindo as células mortas, em quatro quadrados no canto da câmara de contagem.
  3. Determinar a concentração celular presente na suspensão original: Concentração celular = Contagem total de células/4 x fator de diluição (10) x 10.000 = Células/mL
  4. Para calcular o rendimento celular (células por grama de tecido) obtido, multiplique a concentração celular pelo volume total da amostra original (em mL) e divida pelo peso do tecido digerido (em gramas).
  5. Avaliar a viabilidade celular quanto à porcentagem de células vivas da seguinte forma: % Viabilidade = (Número de células viáveis / Número total de células) x 100.

7. Caracterização de subpopulações de macrófagos a partir da fração vascular estromal

  1. Transferir um total de 1 x 106 células SVF/mL para um tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo de 5 mL para citometria de fluxo e células de pellet por centrifugação a 800 x g por 5 min a 4 °C.
  2. Vórtice cuidadosamente para soltar a pastilha e ressuspender as células em 100 μL de 1x PBS na RT.
  3. Adicionar concentração ótima pré-titulada de cada anticorpo monoclonal conjugado ao fluorocromo específico para um antígeno de superfície celular; misturar suavemente e incubar por 15 min no escuro em RT.
  4. Adicionar um excesso de PBS frio 1x (≈ 1 mL) e centrifugar o SVF a 400 x g por 5 min a 4 °C.
  5. Descarte sobrenadantes rapidamente por decantação. Tenha cuidado para não perturbar o pellet.
  6. Adicionar 500 μL de solução lisante 1x e incubar 15 min em RT, protegendo os tubos da luz direta.
  7. Retire a solução após centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C e conservar a 2–8 °C no escuro até à aquisição dos dados.
  8. Vórtice as células completamente em baixa velocidade para reduzir a agregação antes de adquirir.
  9. Ressuspender o pastel de SVF em 5 mL de líquido de bainha na RT e, subsequentemente, filtrar através de três camadas de gaze em um novo tubo de ensaio de polipropileno de fundo redondo de 5 mL antes da análise por citometria de fluxo, para reduzir o entupimento das linhas de classificação celular.
  10. Vórtice cada tubo brevemente antes da análise.
  11. Adquira dados das amostras de interesse. Para análise de fluxo, conte um mínimo de 10.000 eventos.
    NOTA: Se estiver usando um citômetro de fluxo de classificação celular, separe os macrófagos para aplicação em estudos subsequentes.

8. Estratégia de gating

  1. Plote a altura ou largura em relação à área para Forward Scatter (FSC) para determinar a população singlete (Figura 2A).
  2. Selecione as células plotando a área para Side Scatter (SSC) contra FSC, descartando os detritos celulares (Figura 2B).
  3. A partir de células selecionadas, identificar as populações que expressam CD45 como células hematopoéticas (Figura 2C) e células CD45/CD14 duplamente positivas como macrófagos (Figura 2D).
  4. A partir de macrófagos CD45+/CD14+, detectar células HLA-DR negativas e positivas (Figura 2E).
    NOTA: Inclua os controles de compensação para o painel de anticorpos e ajuste a sobreposição espectral em um citômetro de fluxo multicolorido adequado para o painel. A análise por citometria de fluxo foi realizada utilizando-se um citômetro equipado com três lasers (laser violeta 405nm, laser azul 488nm e laser vermelho 640nm) e detectores para os fluorocromos indicados.

Resultados

Este protocolo descreve um método enzimático utilizando digestão de colagenase seguida de centrifugação diferencial para isolar, em um único processo, adipócitos maduros viáveis e células SVF de biópsias de TAV obtidas de gestantes saudáveis após omentectomia parcial. Neste caso, utilizamos os adipócitos para extração de RNA e a FVA para fenotipagem de macrófagos.

O protocolo de extração de RNA permitiu a obtenção de RNA com pureza adequada, alta integridade e microRNAs de ...

Discussão

O IVA desempenha um papel crucial na regulação metabólica e inflamação. O crescente interesse no papel dos adipócitos e das células imunes na inflamação crônica associada à obesidade levou ao desenvolvimento de diferentes técnicas para separar a FVS das células adiposas presentes na TA. No entanto, a maioria das técnicas não permite obter esses dois diferentes conjuntos de células viáveis para aplicações a jusante a partir de uma mesma biópsia de TAV em um único procedimento, o que poderia ser crucia...

Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse a declarar.

Agradecimentos

Este estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Perinatologia (números do processo: 3300-11402-01-575-17 e 212250-3210-21002-06-15) e CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (processo número 2015-3-2-61661).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
1.5 mL microcentrifuge tubesAxygenMCT-150-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
10 mL serological pipettesCorningCLS4101-50EAIndividually plastic wrapped
10 µL universal pipet tipAxygenT-300-L-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
10 µL universal pipet tipAxygenT-300-R-SRNase, DNase free and nonpyrogenic
1000 µL universal pipet tipAxygenT-1000-B-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
2.0 mL microcentrifuge tubeAxygenMCT-200-CRNase, DNase free and nonpyrogenic
200 µL universal pipet tipAxygenT-200-Y-RRNase, DNase free and nonpyrogenic
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2939BA-
2101 Bioanalyzer PCAgilentG2953CA2100 Expert Software pre-installed in PC
5 ml Round Bottom Polystyrene Test TubeCorning352003 Snap cap, sterile
50 mL centrifuge tubesCorningCLS430828-100EAPolipropilene, conical bottom and sterile
Acid-guanidinium-phenol based reagentZymo ResearchR2050-1-200TRI Reagent or similar
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-
Agilent Small RNA KitAgilent5067-1548-
APC/Cy7 anti-human CD14 AntibodyBioLegend3256200.4 mg/106 cells, present on monocytes/macrophages, clone HCD14
Baker--250 ml, non sterile
Bovine serum albuminSigma-AldrichA3912-100GHeat shock fraction, pH 5.2, ≥96%
Chip priming stationAgilent5065-9951-
Collagenase type IIGibco17101-015Powder
D-(+)-GlucoseSigma-AldrichG8270-100GPowder
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR2051Supplied with 50 mL TRI reagen
Dissecting forceps--Steel, serrated jaws and round ends
Dissection tray--Stainless steel
Ethyl alcoholSigma-AldrichE7023-500ML200 proof, for molecular biology
FACS Flow Sheath FluidBD Biosciences342003-
FACS Lysing SolutionBD Biosciences349202-
FACSAria III Flow Cytometer/Cell SorterBD Biosciences648282-
FASCDiva SoftwareBD Biosciences642868Software v6.0 pre-installed
HemacytometerSigmaZ359629-1EA-
Manual cell counter---
Mayo dissecting scisors--Stainless steel
Microcentrifuge--Adjustable temperature
Nanodrop spectrophotometerThermo ScientificND2000LAPTOP-
Orbital shaker--Adjustable temperature and speed
P10 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420401 to 10 μL
P1000 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 to 1000 μL
P2 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette46420100.2 to 2 μL
P200 variable volume micropipette Thermo Scientific-Finnpipette464208020 to 200 μL
PCR tube storage rackAxygenR96PCRFSP-
PE/Cy5 anti-human HLA-DR AntibodyBioLegend3076080.0625 mg/106 cells, present on macrophages, clone L243
PE/Cy7 anti-human CD45 AntibodyBioLegend3040160.1 mg/106 cells, present on leukocytes, clone H130
Phosphate buffered salineSigma-AldrichP3813-10PAKPowder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions
Pipette controller---
Red Blood Cells Lysis BufferRoche11 814 389 001For preferential lysis of red blood cells from human whole blood
Refrigerated centrifuge--Whit adapter for 50 mL conical tubes
Sterile Specimen container---
Transfer pipetteThermo Scientific-Samco204-1SSterile
Trypan BlueGibco15250-0610.4% Solution
Tube racks--For different tube sizes
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-

Referências

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