Aplicação de Células-Tronco Embrionárias Haploid Partehenogenéticas do Rato como um substituto do esperma

Resumo

Este artigo tem como objetivo demonstrar o uso de células-tronco embrionárias haploides partehenogenéticas como um substituto para o esperma para a construção de embriões semi-clonados.

Resumo

Em organismos com reprodução sexual, as células germinativas são a fonte de células totipotentes que se desenvolvem em novos indivíduos. Em camundongos, a fertilização de um oócito por um espermatozoide cria um zigoto totipotent. Recentemente, várias publicações relataram que células-tronco embrionárias haploides (haESCs) podem ser um substituto para genomas gameticos e contribuir para embriões, que se desenvolvem em camundongos. Aqui, apresentamos um protocolo para aplicar haESCs partenogenética como um substituto do esperma para construir embriões por injeção intracytoplasmática em oócitos. Este protocolo consiste em etapas para preparar haESCs como substituição de espermatozoides, para injeção de cromossomos haESC em oócitos, e para a cultura de embriões semi-clonados. Os embriões podem produzir camundongos semi-clonados férteis após a transferência de embriões. O uso de haESCs como substituição de esperma facilita a edição de genomas na linha germinal, estudos de desenvolvimento embrionário e investigação de impressão genômica.

Introdução

Nos mamíferos, os gametas são as únicas células que transmitem informações genéticas para a próxima geração. A fusão de um oócito e um espermatozoide forma um zigoto diploide que se desenvolve em um animal adulto. Mutações em genomas gameticos são, assim, herdadas pela prole e impulsionam a variação genética na espécie¹. A introdução de mutações na linha germinal tem sido aplicada para produzir animais geneticamente modificados para diversos estudos biológicos, incluindo a caracterização da função genética e modelagem de doenças. Tanto os oócitos quanto os espermatozoides são células terminais diferenciadas e altamente especializadas que cessaram a proliferação. Portanto, a modificação direta dos gametas é tecnicamente difícil, e abordagens especializadas foram desenvolvidas. Modificações genéticas podem ser introduzidas na germeina do camundongo pela injeção de ESCs geneticamente modificados em blastocistos, onde eles se integram ao embrião em desenvolvimento e colonizam a linha germinal. Além disso, a modificação genética de zigotos usando abordagens de edição de genomas, incluindo o sistema CRISPR/Cas9, tornou-se amplamente adotada².

Recentemente, foi relatada uma abordagem excepcional, que aplica haESCs como substituto de um genoma gametico^3,4,5,6,7,8. HaESCs são linhas de células-tronco derivadas da massa celular interna de blastocistos haploíides partehenogenéticos ou androgenéticos e possuem um único conjunto de cromossomos^4,7,9,10. Foi demonstrado que tanto haESCs partehenogenéticas quanto androgenéticas podem contribuir para o genoma de camundongos semi-clonados após injeção intracytoplasmática em oócitos. Em contraste com outras abordagens, os genomas dos haESCs podem ser diretamente modificados na cultura devido à sua capacidade de auto-renovação. Introduzir modificações genéticas na linha germinal substituindo o esperma por haESCs é um método importante para estudos biológicos. Prevê a possibilidade de cultura separada e manipulação do genoma materno ou paterno, derivado de haESCs partenogenéticas ou androgenéticas, respectivamente. Os HaESCs podem então ser usados como substituição de genoma gametico, o que é especialmente vantajoso para estudos de impressão genômica, expressão específica de alelo e processos específicos dos pais.

Em camundongos, informações genômicas maternas e paternas são necessárias para o desenvolvimento normal de embriões¹¹. Portanto, os filhotes a termo não puderam ser obtidos quando haESCs (phaESCs) do tipo selvagem foram injetados para substituir o genoma do esperma^5,8. Para superar o bloco de desenvolvimento, a impressão genômica do genoma materno das haESCs partehenogenéticas precisa ser corrigida para uma configuração paterna. Isso pode ser conseguido através da manipulação das regiões diferencialmente metiladas (DMRs). Até o momento, foram estudadas supressões direcionadas dos H19-DMR, Gtl2-Dlk1 IG-DMR e Rasgrf1-DMR para reprimir genes expressos maternamente nos phaESCs^3,5,8,12. Estes estudos demonstraram que as exclusões tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR são suficientes para converter uma mãe em uma configuração de impressão paterna que pode substituir os cromossomos do esperma. A injeção intracytoplasmática de phaESCs que transportam as duas exclusões de DMR em oócitos produziu filhotes semi-clonados com uma frequência entre 5,1% e 15,5% dos embriões transferidos de 2 células.

Este protocolo baseia-se na aplicação de phaESCs com exclusões tanto de H19-DMR quanto IG-DMR, que chamamos de phaESCs duplo-knockout (DKO-phaESCs). Fornecemos instruções detalhadas para a modificação da impressão genômica em phaESCs para estabelecer linhas DKO-phaESC, para a injeção de DKO-phaESCs em oócitos como um substituto para um genoma de espermatozoides, para a cultura de embriões semi-clonados para blastocistos, e para a obtenção de camundongos semi-clonados. Este protocolo é uma referência para pesquisadores que requerem manipulação precisa e direta do genoma paterno e geração de embriões e camundongos semi-clonados.

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram realizados sob a licença ZH152/17 de acordo com as normas e regulamentos da Comissão de Ética Cantonal de Zurique e da instalação de animais EPIC no Instituto de Ciências da Saúde Molecular, ETH Zurique.

NOTA: Este protocolo começa com a exclusão dos DMRs H19- e IG-DMRs em phaESCs. Para obter detalhes sobre como estabelecer linhas phaESC, consulte os relatórios publicados^10,13. Uma visão geral e um prazo deste protocolo (etapas 1-14) são fornecidos na Figura 1A; mídia, soluções e buffers estão listados na Tabela 1. O procedimento para estabelecer linhas DKO-phaESC (etapas 1-6) é mostrado na Figura 1B, e a estratégia para a construção de embriões semi-clonados (etapas 7-14) é retratada na Figura 1C.

1. Transfecção de plasmídeos para exclusão de H19-DMR e IG-DMRem phaESCs

1. Prepare os plasmídeos CRISPR/Cas9 para co-expressão de nucleases Cas9 e guie as RNAs para direcionar as exclusões de H19-DMR e IG-DMR. Ligate quatro pares de guia RNA oligos (H19-DMR-gRNA1-F, R; H19-DMR-gRNA2-F, R; IG-DMR-gRNA1-F, R; IG-DMR-gRNA2-F, R listado na Tabela 2) em plasmídeos pX330.
   NOTA: Consulte o protocolo publicado sobre o procedimento detalhado para a elaboração destes 4 plasmídeos CRISPR/Cas9¹⁴. Alternativamente, os plasmídeos disponíveis para cepas gerais de mouses também são acessíveis através de um repositório (Tabela de Materiais).
2. Cubra a superfície de um poço de uma placa de 6 poços com 1 mL de solução de gelatina de 0,2% por incubação a 37 °C por 10 min.
3. Placa 2 × 10⁵ phaESCs de tipo selvagem no poço revestido de gelatina no meio haESC sem antibióticos, e incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ durante 1 dia.
   NOTA: Os antibióticos são omitidos do meio para aumentar a eficiência da lipofecção subsequente. Usamos phaescs de tipo selvagem na passagem 10. Recomendamos o uso de phaESCs de passagem antecipada, mas uma variedade de número de passagem foi usado com sucesso⁸. A correlação entre o número de passagem e a eficiência da obtenção de embriões semi-clonados e camundongos atualmente não é conhecida.
4. PhaESCs transfeito no poço de uma placa de 6 poços (a partir do passo 1.3) com 6 plasmídeos simultaneamente usando reagente de lipofecção: 50 ng piggyBac plasmid carregando um transgene CAG-EGFP, 50 ng piggyBac transposase plasmid, e 600 ng de cada um dos 4 plasmídeos CRISPR/Cas9 (a partir do passo 1.1). Consulte o protocolo do fabricante sobre o procedimento detalhado da transfecção.
   NOTA: Dois plasmídeos piggyBac são usados para integrar um transposon para expressão onipresente de proteína fluorescente verde aprimorada (EGFP) no genoma dos phaESCs. Se a marcação GFP das células não for necessária, esses dois plasmídeos podem ser substituídos por um plasmídeo CRISPR/Cas9 para expressão transitória de proteínas de fluorescência (por exemplo, pX458 plasmid) em vez de um dos plasmídeos pX330. A expressão EGFP transitória pode então ser usada para classificar células transfeinadas.
5. Dois dias após a transfecção, aspire o meio e adicione 800 μL de trippsina.
6. Incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 5 min. Em seguida, adicione 2 mL de tampão de lavagem para saciar a trippsina e pipeta várias vezes para obter uma única suspensão celular.
7. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL.
8. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min, e remova o supernaspe.
9. Resuspende a pelota celular em 400 μL de tampão de manutenção haESC complementado com 15 μg/mL Hoechst 33342.
   NOTA: Para reduzir a toxicidade potencial de Hoechst 33342, 1 μg/mL Hoechst 33342 e 50 μM verapamil foram usados em vez de 15 μg/mL Hoechst 33342¹⁵.
10. Incubar a suspensão da célula a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 15 minutos. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular, e mantenha o tubo a 4 °C até estar pronto para usar na próxima etapa (seção 2).

2. Revestimento unicelular de phaESCs transfectados usando um citômetro de fluxo

1. Um dia antes de classificar os phaESCs transfectados, os fibroblastos embrionários de camundongos irradiados (MEFs) em placas de 96 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 10⁴ células/cm² no meio MEF. Normalmente, 6 placas são preparadas para estabelecer uma linha phaESC com exclusões direcionadas. Incubar as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
   NOTA: Os MEFs irradiados estão disponíveis comercialmente. Usamos MEFs derivados de embriões E12,5 de camundongos DR4. Embora os haESCs possam crescer em placas revestidas de gelatina sem MEFs, recomendamos MEFs para aumentar a viabilidade de haESCs únicos ordenados.
2. No dia da classificação, aspire o meio MEF das placas de 96 poços, e adicione 120 μL de médio haESC fresco por poço. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
3. Configure um classificador de células com um bico de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante. Um laser UV de 355 nm e um laser azul de 488 nm são usados para excitação de fluorescência Hoechst 33342 e EGFP, respectivamente.
   NOTA: Alternativamente, hoechst 33342 pode ser detectado por excitação com 405 nm.
4. Classifique os phaESCs transfectados no tubo de 5 mL (a partir da etapa 1.10) usando um portão para coleta de células haploides na fase G1/S que mostram a expressão EGFP. Deposite uma única célula em cada poço das placas de 96 poços a partir da etapa 2.2.
   NOTA: A detecção de manchas de Hoechst 33342 geralmente distingue 3 picos de células com um teor de DNA de 1n, 2n e 4n, que correspondem a células haploides na fase G1, uma mistura de células haploides na fase G2/M e células diploides na fase G1, e células diploides na fase G2/M, respectivamente. As células haploides na fase G1/S são identificadas como o pico com menor intensidade de fluorescência Hoechst 33342. Um resultado representativo e um portão de classificação são mostrados na Figura 2A.
5. Após o emplacamento, incubar as placas de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.

3. Sub-clonagem de phaESCs transfectados

1. Três dias após o revestimento unicelular, colônias podem ser observadas em vários poços das placas de 96 poços sob um microscópio. Marque os poços em que só crescem colônias únicas.
   NOTA: Em nossa experiência, colônias únicas foram observadas em 20%-40% dos poços das placas de 96 poços.
2. No dia 4, após o revestimento unicelular, substitua metade do meio por um novo meio haESC nos poços por colônias únicas.
3. Um dia antes da passagem (no dia 4 ou 5 após o revestimento de célula única), placa irradiava MEFs em placas revestidas de gelatina de 96 poços a uma densidade de 4 × 10⁴ células/cm² no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
4. Após 5 ou 6 dias de revestimento unicelular, selecione poços das placas de 96 poços contendo colônias únicas com um diâmetro maior que 150 μm.
   NOTA: Aproximadamente 100 poços são preferencialmente selecionados para estabelecer uma linha phaESC com as exclusões de DMR direcionadas.
5. Aspire o meio nos poços selecionados e adicione 30 μL de trippsina. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 5 min. Em seguida, adicione 30 μL de tampão de lavagem a cada poço para saciar a trippsina.
6. Adicione 140 μL de meio haESC em cada poço e pipeta várias vezes para obter células únicas.
7. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 96 poços preparadas na etapa 3.3.
8. Transfira os phaESCs de cada poço a partir da etapa 3.6 para um poço fresco da nova placa de 96 poços a partir da etapa 3.7.
9. Incubar as placas de 96 poços contendo subclonas phaESC a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
10. No dia seguinte, aspire todo o meio de cada poço, e adicione 120 μL de novo meio haESC. Incubar as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
11. Um dia antes de as células se tornarem confluentes para a passagem, plaque os MEFs irradiados em placas de 24 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 10⁴ células/cm² no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
12. Quando os phaESCs se tornarem confluentes para a passagem, aspire o meio e adicione 30 μL de trippsina. Incubar as placas de 96 poços a 37 °C por 5 min.
13. Adicione 90 μL de tampão de lavagem em cada poço para saciar a trippsina. Pipeta várias vezes para obter células únicas.
14. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 24 poços da etapa 3.11, e adicione 600 μL de meio haESC fresco.
15. Transfira 60 μL da suspensão de subclones phaESC de cada poço na etapa 3.13 para um novo poço das placas de 24 poços da etapa 3.14. Mantenha a suspensão restante de cada subclona phaESC para extração de DNA e genotipagem na etapa 4.
16. Incubar as placas de 24 poços com os subclones phaESC a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
17. Um dia antes que as culturas celulares atinjam a densidade para a passagem, plaque os MEFs irradiados em placas de 6 poços revestidos de gelatina a uma densidade de 4 × 10⁴ células/cm² no meio MEF. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
18. Quando os phaESCs se tornarem confluentes o suficiente para a passagem, aspire o meio e adicione 250 μL de trippsina. Incubar as placas de 24 poços a 37 °C por 5 min.
    NOTA: Após o genotipagem na etapa 4.9, apenas as linhas phaESC com exclusões tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR precisam ser passageadas.
19. Adicione 750 μL de tampão de lavagem em cada poço para saciar a trippsina. Pipeta várias vezes para obter uma única suspensão celular. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL.
20. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min, remover o supernasciente e resuspensar a pelota da célula em 2 mL de meio haESC.
21. Aspire o meio MEF dos poços das placas de 6 poços a partir do passo 3.17. Transfira a suspensão phaESC de cada tubo da etapa 3.20 para um novo poço. Mantenha as placas a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
22. Expanda os clones de células repetindo as etapas 3.17 para 3.21 e aumentando o tamanho da placa e os volumes de trippsina, tampão de lavagem e meio haESC. Prepare um frasco T25 para cada linha de MEFs phaESC subspetada para a etapa 5.
    NOTA: Recomendamos o congelamento de uma alíquota de cada linha phaESC subs clonada em 300 μL de meio de congelamento e manter um criostock no armazenamento de nitrogênio líquido antes de prosseguir para o passo 5.

4. Primeiro genotipagem de linhas de phaESC sub clonadas com MEFs

1. Para extrair DNA genômico da suspensão celular restante da etapa 3.15, adicione 200 μL de tampão de lise a cada poço das placas de 96 poços. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Enxágüe cada poço com um adicional de 200 μL de tampão de lise para recuperar todas as células restantes e coletar no mesmo tubo de 1,5 mL.
2. Incubar o tubo de 1,5 mL a 55 °C durante 3 h com mistura.
3. Após a incubação, adicione 460 μL de isopropanol a cada tubo de 1,5 mL e misture suavemente até que um precipitado de DNA se torne visível.
4. Centrifugar os tubos a ≥ 10.000 x g por 5 min e remover o supernasal. Lave as pelotas de DNA com 200 μL de 70% de etanol.
5. Centrifugar os tubos a ≥ 10.000 x g por 5 min e remover o supernasal.
6. Seque os tubos no ar por 10 minutos e depois resuspenque o DNA em 20 μL de água.
7. Realize a reação em cadeia de polimerase (PCR) usando polimerase de DNA termoestável seguindo o protocolo do fabricante.
   NOTA: Os pares de primer para PCR estão listados na Tabela 2 e são usados da seguinte forma: H19-DMR-P1 e P3 (407 bp para H19-DMR excluído); H19-DMR-P2 e P3 (623 bp para wildtype H19-DMR); IG-DMR-P1 e P3 (319 bp para IG-DMR excluído); IG-DMR-P2 e P3 (492 bp para wildtype IG-DMR). O perfil de temperatura do PCR para todos os pares de primer é o seguinte: 30 s 98 °C, 35 x (10 s 98 °C, 20 s 56 °C, 30 s 72 °C), 5 min 72 °C. O comprimento dos fragmentos de DNA amplificados para as exclusões H19-DMRe IG-DMRmostra alguma variação devido à união final não homólogo associada à edição mediada pelo CRISPR/Cas9. Os PhaESCs foram cultivados com MEFs, que contêm DNA wildtype H19-DMR e IG-DMR. Portanto, os pares de primer de H19-DMR-P2/P3 e IG-DMR-P2/P3, que amplificam fragmentos de DNA do tipo selvagem, não são informativos. No entanto, esses pares de primer são incluídos como controles e devem dar uma banda em todas as reações.
8. Analise os fragmentos de PCR por eletroforese de gel agarose. Consulte o protocolo publicado sobre o procedimento detalhado da eletroforese¹⁶.
9. Identifique linhas celulares com exclusões tanto de H19-DMR quanto IG-DMR. Uma imagem representativa da eletroforese é mostrada na Figura 2B.
   NOTA: No nosso caso, oito linhas de células com exclusões tanto de H19-DMR quanto de IG-DMRforam identificadas entre 135 linhas phaESC subs clonadas.

5. Purificação de células haploides de linhas phaESC subs clonadas

1. Quando as culturas phaESC sub clonadas nos frascos T25 do passo 3.22 se tornarem densas o suficiente para a passagem, aspire o meio e adicione 1,5 mL de trippsina. Incubar o frasco a 37 °C por 5 min. Em seguida, adicione 4,5 mL de tampão de lavagem e pipeta várias vezes para obter uma suspensão unicelular.
2. Transfira cada suspensão celular para um tubo de 15 mL e centrífugue o tubo a 160 x g por 5 min. Remova o supernasciente e resuspenque as pelotas celulares em 400 μL de tampão de manutenção haESC complementado com 15 μg/mL Hoechst 33342.
3. Incubar as suspensões celulares a 37 °C por 15 min. Após a incubação, transfira as suspensões celulares para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular. Enxágüe a tampa do coador celular com um adicional de 400 μL de tampão de manutenção haESC e colete as células restantes no mesmo tubo de 5 mL. Mantenha o tubo a 4 °C até ficar pronto para classificar.
4. Configure um citómetro de fluxo com um bocal de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Hoechst 33342 pode ser detectado por excitação a 405 nm. Aqui, um laser UV de 355 nm é usado para detecção de Hoechst 33342.
5. Configure a suspensão celular (a partir da etapa 5.3) e um novo tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de manutenção haESC para coletar células classificadas no citómetro de fluxo.
6. Inicie a análise e configure o portão de classificação para coletar células haploides na fase G1/S. Consulte o histograma na Figura 2A para identificar a população da fase G1/S da PHAESC.
   NOTA: Algumas linhas de phaESC subs clonadas podem não conter células haploides por causa da diploidização completa ou plating errôneo de células diploides na etapa 2. Se as células haploides não forem observadas na fase G1/S, proceda para outra amostra sem classificação. No nosso caso, 5 linhas de células continham células haploides e 3 linhas celulares continham apenas células diploides de 8 linhas de phaESC subs clonadas.
7. Após a triagem celular, adicione 5 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do tubo de coleta de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min. Remova o supernatante.
8. Selecione uma placa de tamanho adequado para cultivo, dependendo do número de células classificadas. Use um único poço de uma placa de 96 poços, uma placa de 24 poços, e uma placa de 12 poços para cultivar 1.000-40.000 células, 40.000-200.000 células, e 200.000-400.000 células, respectivamente. Resuspenque a pelota celular em 120 μL, 600 μL e 1,2 mL de média haESC, respectivamente.
   NOTA: As células em alta densidade porque a baixa confluência pode causar a morte celular das células após a triagem. A partir deste ponto, os phaESCs são cultivados em poços revestidos de gelatina sem MEFs para facilitar o genotipagem na etapa 6 e a aplicação subsequente para injeção intracytoplasmática a partir do passo 9.
9. Depois de transferir a suspensão celular para um poço revestido de gelatina do tamanho apropriado, incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
10. Continue expandindo as culturas phaESC repetindo passos 3.18 para 3.21 com o aumento do tamanho das placas e aumentando os volumes de trippsina, tampão de lavagem e meio haESC. As células são cultivadas em poços revestidos de gelatina sem MEFs.
11. Para cada linha phaESC subs clonada, prepare uma cultura em um poço de uma placa de 24 poços e um poço de uma placa de 6 poços para as etapas 6 e 9, respectivamente.
    NOTA: Algumas células de cada linha phaESC subs clonada devem ser congeladas em 300 μL de meio de congelamento como criostock em um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido antes de prosseguir para o passo 9.

6. Segundo genotipagem de linhas de phaESC sub clonadas sem MEFs

NOTA: Uma segunda rodada de genotipagem é realizada para confirmar que as linhas phaESC sub clonadas possuem exclusões tanto dos H19- quanto de IG-DMRs, e que alelos do tipo selvagem estão ausentes após a remoção de MEFs.

1. Confirme sob o microscópio que as culturas em poços das placas de 24 poços da etapa 5.11 estão livres de MEFs.
   NOTA: Se os MEFs forem observados, é necessário continuar a passar as culturas até que os MEFs tenham desaparecido para evitar contaminar o PCR com DNA de tipo selvagem de MEFs.
2. Aspire o meio a partir de culturas confluentes e adicione 400 μL de tampão de lise por poço da placa de 24 poços. Depois de pipetting várias vezes, transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL.
3. Incubar o tubo de 1,5 mL a 55 °C durante 3 h com mistura.
4. Após a incubação, adicione 400 μL de isopropanol ao tubo de 1,5 mL e misture suavemente até que um precipitado de DNA se torne visível.
5. Centrifugar o tubo a ≥ 10.000 x g por 5 min e remova o supernasal. Lave a pelota de DNA com 200 μL de 70% de etanol.
6. Centrifugar o tubo a ≥ 10.000 x g por 5 min e remova o supernasal.
7. Seque o tubo no ar por 10 minutos e depois resuspenque o DNA em 50 μL de água.
8. Realize o PCR genotipagem seguindo o passo 4.7 e eletroforese de gel na etapa 4.8 para identificar linhas celulares, que possuem exclusões tanto do H19- quanto do IG-DMRs e estão livres de alelos do tipo selvagem.
   NOTA: Uma imagem de uma análise típica de segundo genotipagem é mostrada na Figura 2B para referência. No nosso caso, todas as 5 linhas celulares selecionadas após a purificação de células haploides (etapa 5) estavam livres de alelos wildtype e possuíam apenas os alelos de exclusão dos H19- e IG-DMRs.
9. Use as linhas phaESC subs clonadas selecionadas após esta segunda genotipagem como linhas DKO-phaESC.

7. Superovulação de ratos

1. Para a produção de oócitos MII, inicie a superovulação por injeção intraperitoneal de 5 UI de solução de égua grávida gonadotropina (PMSG) em cada rato fêmea B6D2F1 (4-5 semanas) 63-65 h antes da coleta de oócito.
   NOTA: A cepa do mouse B6D2F1 é recomendada para este protocolo porque os oócitos B6D2F1 toleram bem a injeção intracytoplasmática e mostram alto potencial de desenvolvimento após o procedimento¹⁷.
2. Quarenta e oito horas após a injeção de PMSG, injete intraperitoneally 5 UI de solução de gonadotropina coriônica humana em cada rato.

8. Coleção Oócito

1. Prepare uma placa de 4 poços contendo 700 μL de meio de hialuronidase em um poço e 700 μL de m2 médio nos 3 poços restantes. Além disso, prepare um prato de 6 cm com 7 mL de m2 médio e um prato de centro-poço com 900 μL de m16 médio. Pré-aqueça o prato e os pratos a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
2. No dia da injeção intracytoplasmática, eutanize as fêmeas superovuladas (a partir do passo 7.2) por deslocamento cervical ou inalação de CO₂ por volta das 8h da manhã. Disseque os ovidutos usando pinças e tesouras. Coloque os ovidutos no prato de 6 cm com meio M2.
3. Solte os complexos cumulus-oocyte (COCs) rasgando a ampola dos oviducts com uma agulha de 30 G. Transfira os COCs para o meio de hialuronidase pré-aquecido e mantenha a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
4. Após 2-3 min, colete oócitos sem cumulus com uma pipeta bucal e lave os oócitos 3 vezes transferindo-os para o meio M2 fresco nos outros 3 poços da placa de 4 poços.
5. Coletar oócitos metafase II (MII), que possuem os primeiros corpos polares, em um prato de centro-poço com meio M16 e manter a placa a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% até ser usada para injeção intracytoplasmática na etapa 12.

9. Tratamento e coleta de DKO-phaESCs

1. Prepare uma cultura DKO-phaESC em um poço de uma placa de 6 poços sem MEFs a 60-80% de confluência um dia antes da injeção intracytoplasmática (a partir do passo 5.11).
2. Para induzir a detenção do ciclo celular em fase M, aspire o meio completamente e adicione 2 mL de meio haESC contendo 0,05 mg/mL demecolcina.
3. Após 8h de tratamento demecolcina, aspire o meio e adicione 800 μL de trippsina.
4. Incubar a placa a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 5 min, depois adicione 2 mL de tampão de lavagem para saciar a trippsina e pipeta várias vezes para obter uma suspensão unicelular.
5. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 15 mL. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min e remover o supernaspe.
6. Resuspenque a pelota de célula em 400 μL de tampão de manutenção haESC contendo 15 μg/mL Hoechst 33342.
7. Incubar a suspensão da célula a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 15 minutos. Após a incubação, transfira a suspensão celular para um tubo de 5 mL através de uma tampa de filtro celular, e mantenha o tubo a 4 °C até a classificação celular na etapa 10.

10. Purificação de DKO-phaESCs presos em fase M

1. Configure um citómetro de fluxo com um bocal de 100 μm de acordo com as instruções do fabricante.
   NOTA: Hoechst 33342 pode ser detectado por excitação a 405 nm. Aqui, um laser UV de 355 nm é usado para detecção de Hoechst 33342.
2. Configure os DKO-phaESCs presos em fase M a partir da etapa 9.7 e inicie a análise. Selecione um portão de classificação adequado para coletar as células de fase M haploide (2n) da amostra tratada com demecolcina.
   NOTA: Após o tratamento da demecolcina, são esperadas 2 populações de células, correspondendo às células haploides e diploides de prisão em fase M, conforme mostrado na Figura 3B. A parada do ciclo celular após o tratamento da demecolcina está completa, portanto, não é observado pico de DNA haploide 1n. Isso é importante, pois as células de fase M haploide e células diploides G1 possuem o mesmo conteúdo de DNA (2n) e produziriam picos sobrepostos.
3. Configure um tubo de 15 mL contendo 2 mL de tampão de manutenção haESC para coletar as células classificadas no citômetro de fluxo. Comece a classificar as células.
4. Após a triagem celular, adicione 5 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do tubo de coleta. Centrifugar o tubo a 160 x g por 5 min e remover o supernaspe.
5. Resuspenque as células em um volume apropriado de tampão de manutenção haESC para obter uma concentração final de 5 x 10⁵ células/mL.
6. Transfira a suspensão da célula para um tubo de 1,5 mL. Mantenha o tubo no gelo até ficar pronto para injeção intracytoplasmática na etapa 12.

11. Preparação de pipetas de retenção e microinjeção

NOTA: Para a realização da injeção intracytoplasmática (etapa 12), são necessárias várias pipetas de retenção e microinjeção(Figura 4A). Estas pipetas podem ser compradas sob demanda sob medida de um fornecedor comercial ou feitas de capilares de vidro adequados usando um puxador de micropipette e uma microforge.

1. Puxe capilares de vidro borossilicato em um puxador de micropipette. Para puxar capilares de vidro borossilicato sem filamento (0,78 x 1,00 x 80 mm) os seguintes parâmetros são dados para um puxador horizontal flamejante(Tabela de Materiais) como referência, mas diferem para outros instrumentos e tipos capilares de vidro: Calor 510 (Teste de rampa 480), Pull 0, Velocity 150, Time 175 e Pressure 200 para segurar pipetas; Heat 510 (Teste de rampa 480), Pull 90, Velocity 140, Time 125 e Pressure 200 para pipetas de microinjeção.
   NOTA: Os parâmetros ideais precisam ser definidos individualmente porque vários fatores, incluindo a umidade, o modelo de um puxador de micropipette e o lote dos capilares de vidro podem afetar a forma das pipetas de injeção. Uma forma alongada com um taper gradual deve ser destinada.
2. Preparação de pipetas de retenção
   1. Definir um capilar puxado preparado na etapa 11.1 para um microforge. Coloque o capilar sobre a conta de vidro no filamento e baixe o capilar para fazer um contato com a conta de vidro enquanto aquece o filamento.
   2. Quebre o capilar desligando o aquecimento e se desprendendo da conta de vidro de tal forma que seu diâmetro externo seja de 60-100 μm.
   3. Posicione a ponta capilar horizontalmente para enfrentar a conta de vidro no filamento.
   4. Aqueça o filamento para permitir que o diâmetro interno da ponta capilar derreta até um diâmetro de 10-20 μm.
   5. Mova o capilar para que a conta de vidro se posiciona a um ponto ~1 mm da ponta capilar sem contato. Aqueça o filamento para permitir que o capilar dobre em um ângulo de 20°. Desmonte o capilar, chamado de pipeta de retenção, do microforge.
      NOTA: Para medir o tamanho do capilar, uma ântice de ocular é preferencialmente instalada no microforge.
3. Preparação de pipetas de microinjeção
   1. Definir um capilar puxado preparado na etapa 11.1 para um microforge. Coloque o capilar sobre a conta de vidro no filamento e baixe o capilar para fazer um contato com a conta de vidro enquanto aquece o filamento.
   2. Quebre o capilar desligando o aquecimento e se destacando da conta de vidro em uma posição que seu diâmetro externo é de 6 μm.
   3. Mova o capilar para que a conta de vidro se posiciona a um ponto ~1 mm da ponta capilar sem contato. Aqueça o filamento para permitir que o capilar dobre para cima em um ângulo de 20°. Desmonte a pipeta de microinjeção do microforge e armazene em uma caixa segura para uso posterior.
      NOTA: As pipetas de microinjeção são preparadas com as seguintes especificações: diâmetro externo, 6 μm; diâmetro interno, 4,5-5 μm; ângulo de dobra, 20°. Definir o design ideal da pipeta de microinjeção é importante para o sucesso da injeção intracytoplasmática. Um diâmetro interno muito grande pode impedir a ruptura da membrana plasmática dos DKO-phESCs doadores (ver seção de discussão). Se o diâmetro interno for muito estreito, pode impedir a pipetação suave dos DKO-phESCs doadores. Um ângulo de dobra < 30° é preferível, pois um ângulo de curva alta impede o efeito dos pulsos piezo.

12. Injeção intracytoplasmática de DKO-phaESCs

1. Antes da injeção intracytoplasmática (a partir da etapa 12.2), prepare uma solução de polivinillpyrrolidone (PVP) adicionando 5 mL de m2 médio em um tubo de 50 mL contendo 0,6 g de PVP e agitando o tubo em um roqueiro a 4 °C por 2 dias. Depois que o PVP se dissolveu completamente, a solução é filtrada estéril e armazenada a 4 °C.
2. No dia da injeção intracytoplasmática, prepare um prato de centro-poço com 900 μL de meio KSOM e pré-aqueça o prato a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
3. Prepare um prato de micromanipulação alinhando gotas de 5 μL de solução PVP e 20 μL de m2 médio em uma tampa de um prato de 10 cm que é colocado de cabeça para baixo. Cubra as gotas com óleo mineral e coloque o prato no palco do microscópio de injeção.
   NOTA: O arranjo recomendado do prato de micromanipulação é mostrado na Figura 4B.
4. Instale uma pipeta de retenção no micromanipulador. Encha a pipeta de microinjeção com o óleo de fluorocarbono usando uma ponta de microcarregador e monte-a no atuador piezo.
5. Mergulhe a pipeta de microinjeção em uma gota com solução PVP e pipeta para cima e para baixo várias vezes para revestir o vidro com PVP e torná-lo menos pegajoso. Carregue um pequeno volume de solução PVP na pipeta de microinjeção e mova a pipeta para uma gota com meio M2.
6. Mergulhe a pipeta de retenção no meio M2 e foque na pipeta na parte inferior da gota.
7. Transfira aproximadamente 2 μL de suspensão DKO-phaESC da etapa 10.6 para a queda média M2.
8. Transfira 10 oócitos MII da etapa 8.5 para a mesma gota média M2 usando uma pipeta bucal.
9. Para injeção, gire um oócito na gota média M2 para que o espaço perivitelline fique de frente para a pipeta de microinjeção, e a placa MII não esteja localizada no caminho da pipeta de microinjeção(Figura 4A). Segure o oócito aplicando pressão negativa através da pipeta de retenção.
   NOTA: Uma placa MII é visualmente identificada como uma saliência de ooplasma que é referida como uma "corcunda" e muitas vezes localizada ao lado do primeiro corpo polar. A placa MII contém o eixo meiotic com cromossomos conectados. O toque da pipeta de microinjeção e da placa MII deve ser evitado, pois danos mecânicos do fuso e cromossomos podem interromper o desenvolvimento de embriões.
10. Carregue um DKO-phaESC na ponta da pipeta de microinjeção aplicando pressão negativa suave. Ruptura da membrana plasmática de um DKO-phaESC por pipetação para evitar a injeção de um DKO-phaESC intacto(Figura 3C; ver discussão).
    NOTA: No caso de a membrana plasmática de um DKO-phaESC não ser rompida por pipetação, descarte o DKO-phaESC e carregue outro DKO-phaESC.
11. Coloque a pipeta de microinjeção em contato com a zona pellucida do oócito, e aplique uma pequena quantidade de pressão negativa dentro da pipeta de microinjeção.
12. Aplique impulsos piezo (intensidade, 20; frequência, 4) para romper a zona enquanto empurra a ponta da pipeta de microinjeção em direção ao espaço perivitelline. Confirme que a placa MII, contendo um fuso e cromossomos, não está localizada no caminho da pipeta de microinjeção.
    NOTA: Ajuste empiricamente a configuração aos pulsos piezo mais baixos para perfuração através da zona para minimizar a possibilidade de danos ao oolemma.
13. Descarte o fragmento da zona pellucida da pipeta de microinjeção e posicione o DKO-phaESC na borda da pipeta.
14. Penetre o oócito com a pipeta de microinjeção para que o oolemma chegue ao lado oposto.
    NOTA: Não toque na placa MII para evitar danos ao fuso e aos cromossomos.
15. Aplique um pulso piezo (intensidade, 6; frequência, 1) para perfurar o oolemma. Certifique-se de que o oolemma relaxe ao longo do eixo da pipeta de microinjeção.
    NOTA: Defina empiricamente o ajuste mais baixo do pulso piezo para quebrar o oolemma para minimizar os danos ao oócito.
16. Injete o DKO-phaESC com um volume mínimo de meio no ooplasma e retire a pipeta de microinjeção suavemente do oócito.
17. Solte o oócito injetado da pipeta de retenção e coloque-o na lateral da microdrop para coleta posterior.
18. Repita o procedimento de injeção das etapas 12.9 às 12:17 para os outros oócitos MII na queda média M2.
    NOTA: Evite manter os oócitos fora da incubadora por mais de 20 minutos. Em nossa experiência, um lote de 10 oócitos pode ser manipulado confortavelmente dentro de 15 minutos após o treinamento adequado.
19. Transfira o lote de oócitos injetados da gota média M2 para um prato de centro-poço pré-aquecido com meio KSOM.
20. Mantenha o prato por 1h a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
21. Repita a manipulação de oócitos das etapas 12.5 e 12.20 com grupos adicionais de oócitos MII para obter oócitos injetados suficientes.

13. Ativação de embriões semi-clonados construídos

1. Prepare dois pratos de centro-poço com 900 μL cada um do meio KSOM e meio de ativação. Prepare uma placa de 4 poços com 700 μL de meio KSOM em cada poço. Pré-aqueça os pratos e o prato a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO_2.
2. Após 1 h no meio KSOM, transfira os oócitos injetados da etapa 12.21 para o prato de centro-poço pré-aquecido com meio de ativação.
3. Mantenha o prato por 6h a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% para ativação.
4. Após a ativação, observe alguns embriões semi-clonados formam três corpos polares, que são o primeiro e o segundo corpos polares do oócito, e o corpo pseudo polar do DKO-phaESC(Figura 3E).
5. Lave os embriões 3 vezes transferindo-os para novos poços com meio KSOM em uma placa de 4 poços.
6. Transfira os embriões para o prato central-bem com meio KSOM, e mantenha o prato a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% para maior desenvolvimento.

14. Desenvolvimento de embriões semi-clonados construídos

1. Após 1 dia de cultura no meio KSOM a partir da etapa 13.6, vários embriões semi-clonados atingem o estágio de 2 células(Figura 5A).
2. Para o desenvolvimento adicional de embriões de pré-implantação in vitro, continue a culminar os embriões semi-clonados no meio KSOM a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%. Transfira os embriões semi-clonados para o meio KSOM fresco no dia 2. No dia 4, vários embriões chegarão ao estágio blastocisto(Figura 5A).
3. Para a derivação de camundongos semi-clonados, transfira embriões de 2 células da etapa 14.1 para os ovidutos de fêmeas pseudo-grávidas. Identifique fêmeas pseudo-grávidas acasalando em machos vasectomizados um dia antes da transferência do embrião e selecione-as com base na presença de um plugue claramente visível na manhã do dia para a transferência do embrião (0,5 dias pós-coitum (dpc)). Em torno de 19,5 dpc, os filhotes de termo são naturalmente entregues de fêmeas receptoras(Figura 5B).

Resultados

O objetivo deste protocolo é aplicar haESCs como substituto de espermatozoides para obter embriões e camundongos semi-clonados. Para isso, foi gerada e utilizada uma linha DKO-phaESC que transportava o transgene CAG-EGFP para injeção intracytoplasmática em oócitos MII. Para obter uma linha phaESC adequada com uma configuração de impressão paterna, realizamos engenharia genética utilizando núcleos Cas9. Uma linha ESC haploide contém células haploides e diploides que surgem devido a uma tendência inerente de ESCs haploides para diploidização¹⁰. Um conjunto de cromossomos haploides é um pré-requisito para a substituição bem sucedida do genoma do esperma. A análise do conteúdo de DNA por citometria de fluxo mostra a distribuição de células haploides e diploides nas fases G0/G1-, S e G2/M(Figura 2A).

Para estabelecer as linhas DKO-phaESC, as linhas phaESC do tipo selvagem foram transfeinadas com construções transposon piggyBac para expressão transgênica estável e com plasmídeos CRISPR/Cas9 para obtenção de exclusões do H19- e IG-DMRs. Para excluir ESCs diploides e isolar apenas ESCs haploides expressando EGFP, foi definido um portão de tipo específico(Figura 2A). Células eGFP-positivas haploides únicas foram então emplacar em poços individuais de placas de 96 poços para obter sub-clones. Os alimentadores MEF foram utilizados para aumentar a eficiência do revestimento e a sobrevivência dos phaESCs transfectados. Após a expansão das culturas, uma rodada inicial de genotipagem foi realizada pelo PCR para identificar sub-clones que carregam exclusões de ambas as DMRs. Após a retirada dos alimentadores mef das culturas, um segundo genotipo foi realizado para confirmar a ausência de alelos do tipo selvagem no H19- e IG-DMRs(Figura 2B). De um total de 135 sub-clones, obtivemos 5 linhas haploid DKO-phESC que carregavam os alelos excluídos e estavam livres de alelos wildtype tanto do H19-DMR quanto do IG-DMR.

Um transgene CAG-EGFP foi introduzido em DKO-phaESCs para estudar sua contribuição para embriões semi-clonados por visualização de fluorescência verde sob um microscópio(Figura 3A). Para a injeção intracytoplasmática, dko-phaESCs foram tratados com demecolcina para prendê-los em fase M. Assim, o ciclo celular de DKO-phaESCs foi sincronizado com o dos oócitos MII. A análise da citometria de fluxo mostrou 2 populações correspondentes à fase G2/M presas em células haploides (2n) e diploides (4n) após o tratamento com demecolcina (Figura 3B). A ausência do pico haploide de 1n indicou que a prisão do ciclo celular estava em grande parte completa. Os ESCs haploides da fase M foram então classificados e injetados em oócitos. Para isso, um único DKO-phaESC foi carregado na pipeta de microinjeção e injetado no citoplasma de um oócito MII(Figura 3C). A membrana plasmática do DKO-phaESC foi rompida por tubulação na ponta da pipeta de microinjeção.

Após a injeção, a expressão EGFP raramente foi detectada nos embriões semi-clonados construídos, pois o citoplasma dos DKO-phaESCs havia se dispersado no grande citoplasma do oócito (Figura 3D). Em casos raros, uma mancha redonda de intensa expressão EGFP poderia ser observada dentro do ooplasma. Esta observação foi provavelmente causada pela injeção inadvertida de DKO-phaESCs intactos. A falha na ruptura da membrana celular DKO-phaESC provavelmente não é compatível com o desenvolvimento de embriões e deve ser evitada. Uma hora após a injeção, os embriões foram ativados pelo tratamento com cloreto de estrôncio¹⁸. Seis horas após o início da ativação, até 3 corpos polares foram observados sob o microscópio (Figura 3E). Estes corpos polares correspondem ao primeiro e segundo corpos polares do oócito e a um corpo pseudo polar do DKO-phaESC⁷. Além disso, dois pronucleis foram observados sob um microscópio de contraste de interferência diferencial, que se assemelhava ao estágio pronuclear de zigotos após fertilização normal com espermatozoides.

Para demonstrar competência de desenvolvimento, embriões semi-clonados foram cultivados até o estágio blastocisto(Figura 5A). Além disso, um camundongo a termo foi obtido após a transferência de embriões semi-clonados de estágio de 2 células para os ovidutos de uma fêmea receptora(Figura 5B). Como esperado, o rato derivado de um embrião semi-clonado era uma fêmea, pois nem oócitos nem phaESCs derivados de oócitos carregam um cromossomo Y. O rato semi-clonado era excessivamente normal e produzia descendentes saudáveis quando acasalado com um macho webster suíço selvagem. Até agora, o rato semi-clonado está vivo há mais de 600 dias sem problemas de saúde aparentes.

Figura 1: Visão geral da aplicação de DKO-phaESCs como substituição de espermatozoides. (A) Um período de tempo dos procedimentos do protocolo. (B) O esquema mostra as etapas para estabelecer linhas DKO-phaESC (etapas 1-6). (C) O esquema mostra os passos para construir embriões semi-clonados por injeção intracytoplasmática de um DKO-phaESC em um oócito MII (passos 7-14). Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; FACS = classificação celular ativada por fluorescência; MEF = fibroblasto embrionário de camundongos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Estabelecimento de linhas DKO-phaESC por exclusões mediadas por CRISPR/Cas9 de H19- e IG-DMRs. (A) Análise da citometria de fluxo de phaESCs após a transfecção com plasmídeos piggyBac para expressão estável EGFP e com 4 plasmídeos CRISPR/Cas9. Os phaESCs não transfectados são mostrados como controle. O perfil de DNA (topo) mostra a distribuição do ciclo celular das células haploides e diploides. As células haploides da fase G1/S expressando EGFP são indicadas pelo portão verde (inferior, à direita). (B) Genotipagem de sub-clones phaESC que foram cultivados em MEFs (primeiro genotipagem) e após a remoção de MEFs (segunda genotipagem). As linhas phaESC sub clonadas 1, 2, 3 e 4 representam células do tipo selvagem, células com exclusão H19-DMR, com exclusão IG-DMR, e com exclusões combinadas de H19- e IG-DMR,respectivamente. As linhas DKO-phaESC 5-8 possuem exclusões H19-DMR e IG-DMRe estão livres de alelos do tipo selvagem. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; DMR = região diferencialmente metilada; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; WT = tipo selvagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Injeção de DKO-phaESCs presos mitoticamente em oócitos MII. (A) Morfologia de uma cultura DKO-phaESC que carrega um transgene CAG-EGFP e exclusões dos DMRs H19 e IG; barra de escala = 50 μm. (B) Análise representativa da citometria de fluxo de DKO-phaESCs após a detenção com demecolcina por 8 h. DKO-phaESCs sem tratamento demecolcina são mostrados como controle. (C) Morfologia de DKO-phaESCs na pipeta de microinjeção. Um único DKO-phaESC intacto antes (esquerda) e depois (direita) rompendo a membrana plasmática por tubulação é mostrado; barra de escala = 20 μm. (D) Embriões construídos a 1 h após a injeção de DKO-phaESCs em oócitos MII. Uma imagem mesclada de fluorescência EGFP e campo brilhante é mostrada. Pontas de flecha pretas indicam pontos redondos de intensa expressão EGFP após a injeção de DKO-phaESCs intactos, que devem ser evitados; barra de escala = 50 μm. (E) Uma imagem de contraste de interferência diferencial de embriões semi-clonados 6 h após o início da ativação com cloreto de estrôncio é mostrada. Pontas de flechas brancas indicam embriões com 3 corpos polares, incluindo um corpo pseudo polar do DKO-phaESC injetado; barra de escala = 50 μm. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética; EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Esquema da configuração para injeção intracytoplasmática de DKO-phaESCs em oócitos. (A) O arranjo de uma pipeta de injeção, uma pipeta de retenção e um oócito na câmara de injeção é mostrado. α, ângulo de dobra da pipeta de microinjeção. (B) Layout das gotas na antena de micromanipulação para injeção intracytoplasmática. Abreviaturas: DKO = duplo nocaute; phaESC = célula-tronco embrionária haploide parthogenética. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Desenvolvimento de embriões semi-clonados. (A) Desenvolvimento de pré-implantação de embriões semi-clonados in vitro. A expressão EGFP é inicialmente observada em embriões de quatro células no dia 2 após injeção intracytoplasmática. No dia 4, a expressão intensa do EGFP pode ser observada em blastocistos; barra de escala = 100 μm. (B) Um rato semi-clonado obtido após a transferência de embrião de 2 células para uma fêmea receptora. Aos 74 dpp, o rato semi-clonado (ponta de flecha) entregou seus primeiros filhotes (asterisco) por nascimento natural após o acasalamento com um macho suíço webster selvagem. Embriões semi-clonados e o camundongo semi-clonado mostrado nesta figura são idênticos aos relatados em Aizawa et al.³. Abreviaturas: EGFP = proteína fluorescente verde aprimorada; .dpp, dias pós-parto. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Solução de gelatina
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Água	-	500 mL	-
gelatina	-	1 g	0.2%
Célula-tronco embrionária haploide (HaESC) média
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
NDiff 227	-	10 mL	-
CHIR 99021	10 mM	3 μL	3 μM
PD 0325901	10 mM	1 μL	1 μM
Lif	1 x 106 UI/mL	10 μL	1.000 UI/mL
Penicilina-Estreptomicina	100x	100 μL	1x
Tampão de manutenção HaESC
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Meio HaESC	-	1 mL	-
Solução HEPES	1 M	20 μL	20 mM
Tampão de lavagem
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
DMEM / F-12	-	100 mL	-
Fração BSA	7.5%	7,1 mL	0.5%
Meio MEF
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
DMEM	-	500 mL	-
FBS	-	56 mL	10%
β-Mercaptoetanol	14.3 mol/L	3,9 μL	100 μM
Penicilina-Estreptomicina	100x	5,6 mL	1x
Tampão de lise
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Água	-	8,25 mL	-
Tris-HCl (pH 8.5)	1 M	1 mL	100 mM
Edta	0,5 M	100 μL	5 mM
Solução SDS	10%	200 μL	0.2%
NaCl	5 M	400 μL	200 mM
Proteinase K	20 mg/mL	50 μL	100 μg/mL
Meio de ativação
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Rio KSOM	-	1 mL	-
Cloreto de estrôncio	1 M	5 μL	5 mM
EGTA	0,5 M, pH 8.0	4 μL	2 mM
Solução PVP
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Meio M2	-	5 mL	-
Pvp	-	0,6 g	12%
Solução PMSG
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Pbs	-	450 μL	-
PMSG	500 UI/mL	50 μL	50 UI/mL
solução hCG
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Pbs	-	450 μL	-
hCG	500 UI/mL	50 μL	50 UI/mL
Meio de hialuronidase
componente	Concentração de estoque	Volume / peso	Concentração final
Meio M2	-	380 μL	-
Hialuronidase	10 mg/mL	20 μL	0,5 mg/mL
Abreviaturas: LIF = fator inibidor da leucemia; MEF = fibroblasto embrionário de camundongo;
FBS = soro bovino fetal; DMEM = Meio águia modificada de Dulbecco; BSA = albumina de soro bovino;
EDTA = ácido etilenodiaminetetraacético; SDS = dodecylsulfato de sódio; EGTA = ácido tetraacético e egta = etileno-bis (oxyethylenenitrilo)tetraacético;
PBS = soro fisiológico tamponado com fosfato; PVP = polivinylpyrrolidone; hCG = gonadotropina coriônica humana;
PMSG = égua grávida gonadotropina.

Tabela 1: Receita de meio, tampão e solução.

nome	Sequência (5' a 3')		aplicação
H19-DMR-P1	GTG GTT AGT TCT ATA TGG GG		Genotyping
H19-DMR-P2	AGA TGG GGT CAT TCT TTT CC		Genotyping
H19-DMR-P3	TCT TAC AGT CTG GTC TTG GT		Genotyping
IG-DMR-P1	TGT GCA GCA GCA AAG CTA AG		Genotyping
IG-DMR-P2	CCA CAA AAA CCT CCC TTT CA		Genotyping
IG-DMR-P3	ATA CGA TAC GGC AAC CAA CG		Genotyping
H19-DMR-gRNA1-F	CAC CCA TGA ACT CAG AAG AGA CTG		gRNA
H19-DMR-gRNA1-R	AAA CCA GTC TCT TCT GAG TTC ATG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-F	CAC CAG GTG AGA ACC ACT GCT GAG		gRNA
H19-DMR-gRNA2-R	AAA CCT CAG CAG TGG TTC TCA CCT		gRNA
IG-DMR-gRNA1-F	CAC CCG TAC AGA GCT CCA TGG CAC		gRNA
IG-DMR-gRNA1-R	AAA CGT GCC ATG GAG CTC TGT ACG		gRNA
IG-DMR-gRNA2-F	CAC CCT GCT TAG AGG TAC TAC GCT		gRNA
IG-DMR-gRNA2-R	AAA CAG CGT AGT ACC TCT AAG CAG		gRNA

Tabela 2: Lista de oligonucleotídeos.

Discussão

A clonagem de mamíferos por transferência nuclear de células somáticas (SCNT) foi pioneira na década de 1990,^20,21. Esses desenvolvimentos seguiram estudos de clonagem realizados 30 anos antes em anfíbios²². O atraso considerável reflete a dificuldade da embriologia e da impressão genômica em mamíferos. O desenvolvimento do SCNT mamífero é a base para a aplicação do haESC para substituição de espermatozoides, que está detalhado neste protocolo.

A sincronização do ciclo celular é um fator importante para o sucesso do SCNT²³. Este também é o caso da injeção de haESC neste protocolo. A introdução de um genoma doador em um receptor requer que as fases do ciclo celular sejam combinadas para evitar quebras cromossômicas ou aneuploidies que revogariam o desenvolvimento de embriões. A semi-clonagem tem a complexidade adicional que dois genomas e um citoplasto precisam ser compatíveis. Um relatório anterior demonstrou que a injeção de haESCs androgenéticos presos em fase M produziu melhores taxas de desenvolvimento de embriões semi-clonados do que a injeção de haESCs em fase G1 em oócitos⁷. Este relatório sugere a fase M como um ponto de sincronização adequado para a semi-clonagem. Assim, os phaESCs foram mitoticamente presos em metafase com demecolcina e injetados no ooplasma dos oócitos MII, que foram naturalmente presos em metafase II da meiose. É importante ressaltar que a detenção em fase M pode ser alcançada em ESCs de camundongos com alta eficiência, proporcionando excelente sincronização entre ciclos de células doadoras e receptoras.

Durante a mitose, a membrana nuclear se rompe e um fuso se forma a que os cromossomos replicados se conectam. Após a injeção de DKO-phaESCs de fase M, os cromátides irmãos são segregados em um corpo pseudo polar e o zigoto⁷ (Figura 3E). Consequentemente, um único conjunto de cromossomos de um DKO-phaESC contribui para o embrião semi-clonado. É fundamental que os cromátides irmãs dos cromossomos DKO-phaESC possam ser corretamente segregados após a injeção. A membrana plasmática de um DKO-phaESC intacto impede a segregação em um corpo pseudo polar. Observamos casos raros em que a membrana plasmática de DKO-phaESCs não foi rompida, e os embriões apresentaram DKO-phaESCs intactos no ooplasma após a injeção(Figura 3D). Portanto, deve-se tomar cuidado para remover a membrana plasmática de DKO-phaESCs por pipetação. Durante a injeção, é igualmente importante evitar a interrupção do fuso meiotico do oócito, o que poderia levar a defeitos de segregação do cromossomo e induzir aneuploidia também.

Em mamíferos, a impressão genômica limita a aplicação de phaESCs como substituição de espermatozoides. HaESCs partenogenéticas possuem uma configuração materna de impressões genômicas, enquanto os espermatozoides possuem uma configuração paternal. Portanto, a geração de filhotes a termo não ocorreu após a injeção de phaESCs de tipo selvagem como substituição de espermatozoides. Para superar essa limitação, as exclusões dos IG- e H19-DMRs são projetadas em phaESCs. A modificação da expressão impressa no Igf2-H19 materno e gtl2-dlk1 loci é suficiente para alterar a configuração de impressões genômicas para permitir a geração de camundongos semi-clonados com uma frequência de mais de 5,1%, com base em embriões transferidos de 2 células. Essas observações sugerem que o alvo de dois genes impressos muda o genoma dos phaESCs para uma configuração paternal funcional que pode substituir o esperma em camundongos. No entanto, é necessária uma modificação genética permanente dos phaESCs para essa estratégia. Como estratégia alternativa, pode-se considerar haESC androgenético. HaESCs androgenéticos são derivados do genoma do esperma e possuem impressões paternas. Há relatos de que os haESCs androgenéticos selvagens contribuíram como reposição de esperma para gerar filhotes a termo em uma frequência entre 1,3% e 1,9% dos embriões transferidos^4,7,24. Os filhotes a termo também foram obtidos injetando haESCs androgenéticos com exclusões do IG- e H19-DMRs a uma frequência de 20,2% dos embriões de 2 células transferidos²⁴. O aumento da eficiência da semi-clonagem usando haESCs androgenéticos modificados é provável porque as impressões podem se tornar instáveis na cultura. Os defeitos de impressão são corrigidos pelas exclusões genéticas das DMRs críticas.

Considerando a dificuldade em introduzir modificações genéticas diretamente nos genomas oócitos ou espermatozoides, os haESCs são uma ferramenta valiosa para manipular os genomas parentais separadamente. O uso de haESCs como substituto do esperma fornece uma vantagem notável para a edição de genomas na germe do rato. Um estudo recente combinou a edição de genoma baseada em CRISPR/Cas9 com a aplicação de haESCs para a caracterização de regiões de impressão que são fundamentais para o desenvolvimento embrionário¹². Este estudo analisou o papel do Rasgrf1-DMR em combinação com os H19-e IG-DMRsno desenvolvimento de camundongos bimaternais, e a função de 7 DMRs diferentes no desenvolvimento de camundongos bipaternos. O método de substituição de haESCs por espermatozoides formou a base para abordagens de triagem genética para identificar aminoácidos-chave dentro da proteína DND1 no desenvolvimento de células germinativas primordiais e para a identificação de genes no desenvolvimento ósseo^24,25,26. Estudos sobre impressão genômica e triagem genética para identificar fatores-chave no desenvolvimento embrionário são abordagens consideráveis para a aplicação de haESCs como genomas gameticos.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mLTube	Eppendorf	0030 125.150	haESC culture
15 ml Tube	Greiner Bio-One	188271	haESC culture
12-well plate	Thermo Scientific	150628	haESC culture
24-well plate	Thermo Scientific	142475	haESC culture
6-well plate	Thermo Scientific	140675	haESC culture
96-well plate	Thermo Scientific	167008	haESC culture
β-Mercaptoethanol	Merck	M6250	haESC culture
BSA fraction	Gibco	15260-037	haESC culture
CHIR 99021	Axon	1386	haESC culture
Demecolcine solution	Merck	D1925	haESC culture
DMEM	Gibco	41965-039	haESC culture
DMEM / F-12	Gibco	11320-033	haESC culture
DR4 mouse	The Jackson Laboratory	3208	haESC culture
EDTA	Merck	E5134	haESC culture
FBS	biowest	S1810-500	haESC culture
Freezing medium	amsbio	11897	haESC culture
Gelatin	Merck	G1890	haESC culture
Hepes solution	Gibco	15630-056	haESC culture
Irradiated MEF	Gibco	A34966	haESC culture
LIF (Leukemia inhibitory factor)	(Homemade)	-	haESC culture
Lipofection reagent	Invitrogen	11668019	haESC culture
NDiff 227	Takara	Y40002	haESC culture
PD 0325901	Axon	1408	haESC culture
Pen Strep	Gibco	15140-122	haESC culture
piggyBac plasmid carrying a CAG-EGFP transgene	Addgene	#40973	haESC culture
piggyBac transposase plasmid	System Biosciences	PB210PA-1	haESC culture
pX330 plasmid	Addgene	#42230	haESC culture
pX458 plasmid	Addgene	#48138	haESC culture
Trypsin	Gibco	15090-046	haESC culture
DNA polymerase	Thermo Scientific	F549S	Genotyping
dNTP Mix	Thermo Scientific	R0192	Genotyping
Ethanol	Merck	100983	Genotyping
Hydrochloric acid	Merck	100317	Genotyping
Isopropanol	Merck	109634	Genotyping
Proteinase K	Axon	A3830	Genotyping
SDS	Merck	71729	Genotyping
Sodium chloride	Merck	106404	Genotyping
ThermoMixer	Epeendorf	5384000012	Genotyping
Tris	Merck	T1503	Genotyping
5 mL Tube	Falcon	352063	Flow cytometry
5 mL Tube with cell strainer cap	Falcon	352235	Flow cytometry
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Flow cytometry
MoFlo Astrios EQ	Beckman Coulter	B25982	Flow cytometry
1 mL syringe	Codan	62.1640	Superovulation
30-gauge 1/2 inch needle	Merck	Z192362-100EA	Superovulation
B6D2F1 mouse	The Jackson Laboratory	100006	Superovulation
hCG	MSD animal health	49451	Superovulation
PBS	Gibco	10010015	Superovulation
PMSG	Avivasysbio	OPPA1037 5000 IU	Superovulation
10-cm dish	Thermo Scientific	150350	Embryo manipulation
4-well plate	Thermo Scientific	179830	Embryo manipulation
50 mL tube	Greiner Bio-One	227261	Embryo manipulation
6 cm dish	Thermo Scientific	150288	Embryo manipulation
Center-well dish	Corning	3260	Embryo manipulation
Digital rocker	Thermo Scientific	88880020	Embryo manipulation
EGTA	AppliChem	A0878	Embryo manipulation
Hyaluronidase	Merck	H4272	Embryo manipulation
KSOM	Merck	MR-020P-5F	Embryo manipulation
M16 medium	Merck	M7292	Embryo manipulation
M2 medium	Merck	M7167	Embryo manipulation
Mineral oil	Merck	M8410	Embryo manipulation
Glass capillary	Merck	P1049-1PAK	Embryo manipulation
Stereomicroscope	Nikon	SMZ745	Embryo manipulation
Strontium chloride	Merck	13909	Embryo manipulation
5ml syringe	Codan	62.5607	Microinjection
Borosilicate glass cappilary	Science product	GB100T-8P	Microinjection
CellTram 4r Oil	Eppendorf	5196000030	Microinjection
Fluorinert FC-770	Merck	F3556	Microinjection
Holding pipette	BioMedical Instruments	-	Microinjection
Inverted microscope	Nikon	Eclipse Ti-U	Microinjection
Microforge	Narishige	MF-900	Microinjection
Microinjection pipette	BioMedical Instruments	-	Microinjection
Microlaoder tips	Eppendorf	5252 956.003	Microinjection
Micromanipulaor arms	Narishige	NT-88-V3	Microinjection
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-1000	Microinjection
PiezoXpert	Eppendorf	5194000016	Microinjection
PVP (Polyvinylpyrrolidine)	Merck	PVP360	Microinjection
Syringe filter	SARSTEDT	83.1826.001	Microinjection