Determinação semi-quantitativa da densidade do neurônio dopaminérgico na Substantia Nigra dos Modelos de Roedores usando análise automatizada de imagem

Resumo

Aqui apresentamos um método automatizado para determinação semi-quantitativa do número de neurônio dopaminérgico na substantia nigra pars compacta.

Resumo

A estimativa do número de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra é um método-chave na pesquisa pré-clínica da doença de Parkinson. Atualmente, a contagem esqueológica imparcial é o padrão para quantificação dessas células, mas continua sendo um processo trabalhoso e demorado, que pode não ser viável para todos os projetos. Aqui, descrevemos o uso de uma plataforma de análise de imagens, que pode estimar com precisão a quantidade de células rotuladas em uma região de interesse pré-definida. Descrevemos um protocolo passo-a-passo para este método de análise no cérebro de rato e demonstramos que ele pode identificar uma redução significativa nos neurônios positivos da hidroxilase de tyrosina devido à expressão de α-sinucleína mutante na substantia nigra. Validamos essa metodologia comparando-se com os resultados obtidos pela estereologia imparcial. Em conjunto, este método fornece um processo eficiente e preciso para detectar alterações no número de neurônios dopaminérgicos e, portanto, é adequado para uma determinação eficiente do efeito das intervenções na sobrevivência celular.

Introdução

A doença de Parkinson (DP) é um distúrbio de movimento neurodegenerativa prevalente caracterizado pela presença de agregados proteicos contendo α-sinucleína (α-syn) e a perda preferencial de neurônios dopaminérgicos na substantia nigra pars compacta (SNpc)¹. A quantificação do número de neurônios dopaminérgicos é uma parte vital da pesquisa da DP, pois permite a avaliação da integridade do sistema nigrostriatal, proporcionando assim um importante ponto final para avaliar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Atualmente, o padrão de quantificação do número de células é a contagem estológica imparcial, que utiliza seções....

Protocolo

Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Com Animais da Rede de Saúde universitária e realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo Conselho Canadense de Cuidados com Animais.

1. Injeção estereotática

1. Ratos adultos de casa par-house Sprague-Dawley (250-280 g) em gaiolas com roupa de cama de madeira e acesso a anúncios lib a alimentos e água. Mantenha a colônia animal em um ciclo regular de 12h de luz/escuridão (luzes em 06:30) com temperatura e umidade constantes.
2. Realize a injeção estereotática unilateral de AAV diretamente ao SNpc no lado direito do cérebro (lado direito....

Resultados

Aplicando os métodos acima ao tecido cerebral coletados 6 semanas após as injeções de AAV, demonstramos que a injeção estereotática de AAV expressando o mutante A53T α-syn (AAV-A53T) no SNpc do cérebro de rato resulta em uma redução significativa na densidade de neurônios dopaminérgicos em comparação com a injeção de AAV (AAV-EV) vetorial vazio como controle (Figura 5A,B). O número médio de neurônios TH-positivo/mm² no SNpc de ratos injetados c.......

Discussão

A avaliação confiável da integridade do sistema dopaminérgico em modelos pré-clínicos de DP é fundamental para determinar a eficácia de potenciais terapêuticas modificadoras de doenças. Por isso, é importante controlar e minimizar potenciais confusões que possam reduzir a confiabilidade e a reprodutibilidade dos dados histopatológicos. Resultados quantitativos cuidadosos podem fornecer mais informações do que descrições qualitativas ou semi-quantitativas. Ao mesmo tempo, devemos reconhecer que as restri?.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
A-Syn Antibody	ThermoFisher Scientific	32-8100
ABC Elite	Vector Labs	PK-6102
Alexa Fluor 488 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-11008
Alexa Fluor 555 secondary antibody	ThermoFisher Scientific	A-28180
Alkaline phosphatase-conjugated anti-rabbit igG	Jackson Immuno	111-055-144
Biotinylated anti-mouse IgG	Vector Labs	BA-9200
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
DAKO fluorescent mouting medium	Agilent	S3023
HALO™	Indica Labs
Histo-Clear II	Diamed	HS202
ImmPACT DAB Peroxidase substrate	Vector Labs	SK-4105
LSM880 Confocal Microscope	Zeiss
NeuN Antibody	Millipore	MAB377
Normal Goat Serum	Vector Labs	S-1000-20
OCT	Tissue-Tek
Paraformaldehyde	BioShop	PAR070.1
Sliding microtome	Leica	SM2010 R
Stereo Investigator	MBF Bioscience
Sucrose	BioShop	SUC700
TH Antibody	ThermoFisher Scientific	P21962
VectaMount mounting medium	Vector Labs	H-5000
Vector Blue Alkaline Phosphatase substrate	Vector Labs	SK-5300
Zen Black Software	Zeiss
Zen Blue Software	Zeiss