Examinando a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular

Resumo

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos, que são prejudicadas em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, e isso resulta na incapacidade do músculo de se regenerar. Aqui, descrevemos um protocolo que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Resumo

O músculo esquelético tem uma notável capacidade de se regenerar após a lesão, que é impulsionada por células-tronco musculares residentes de tecido obrigatório. Após a lesão, a célula-tronco muscular é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. Em muitas condições de perda muscular, incluindo distrofia muscular e envelhecimento, esse processo é prejudicado, resultando na incapacidade do músculo de se regenerar. O processo de regeneração muscular em zebrafish é altamente conservado com sistemas de mamíferos fornecendo um excelente sistema para estudar a função e a regeneração das células-tronco musculares, em condições de perda muscular, como distrofia muscular. Aqui, apresentamos um método para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular. O primeiro passo envolve o uso de uma plataforma de genotipagem que permite a determinação do genótipo das larvas antes de provocar uma lesão. Tendo determinado o genótipo, o músculo é ferido usando uma facada de agulha, seguindo a qual a microscopia de luz polarizadora é usada para determinar a extensão da regeneração muscular. Por isso, fornecemos um gasoduto de alta produtividade que permite o exame da regeneração muscular em modelos de zebrafish de doença muscular.

Introdução

O músculo esquelético é responsável por 30-50% da massa corporal humana, e não é apenas indispensável para a locomoção, mas também serve como um órgão metabólico e de armazenamento crítico¹. Apesar de ser pós-metótico, o músculo esquelético é altamente dinâmico e mantém uma tremenda capacidade regenerativa após lesão. Isso é atribuído à presença de células-tronco residentes em tecidos (também chamadas de células satélites), localizadas sob a lamina basal de miofibers e marcadas pelos fatores de transcrição emparelhados da proteína da caixa 7 (pax7) e/ou proteína de caixa emparelhada 3 (pax3),entre outros^2,3. Após a lesão, a célula satélite é ativada e sofre proliferação celular para gerar um pool de míobios, que posteriormente se diferenciam para formar novas fibras musculares. A cascata altamente conservada de sinais pró-regenerativos que regulam a ativação celular por satélite e o reparo muscular robusto é afetada em várias condições, como miopatias e envelhecimento homeostático^4,5.

Um grupo tão diversificado de miopatias é a distrofia muscular, caracterizada pelo perda muscular progressiva e degeneração⁶. Essas doenças são consequência de mutações genéticas em proteínas-chave, incluindo distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsáveis pela fixação das fibras musculares à matriz extracelular^7,8. Dado que as proteínas implicadas na distrofia muscular desempenham um papel central na manutenção da estrutura muscular, por muitos anos acreditava-se que uma falha nesse processo era o mecanismo responsável pela patogênese da doença⁹. No entanto, estudos recentes identificaram defeitos na regulação de células-tronco musculares e subsequente comprometimento na regeneração muscular como segunda base possível para a patologia muscular observada na distrofia muscular^10,11. Como tal, mais estudos são necessários para investigar como um comprometimento na função de células-tronco musculares e elementos de nicho associados contribui para a distrofia muscular.

Na última década, o zebrafish (Danio rerio) emergiu como um importante modelo vertebrado para modelagem de^{doenças 12}. Isso é atribuído ao rápido desenvolvimento externo do embrião de zebrafish, aliado à sua clareza óptica, que permite a visualização direta da formação muscular, crescimento e função. Além disso, não só o desenvolvimento e estrutura do músculo altamente conservado em zebrafish, eles também apresentam um processo altamente conservado de regeneração muscular¹³. Consequentemente, o zebrafish representa um excelente sistema para estudar a trajetória das doenças musculares e explorar como a regeneração muscular é afetada nele. Para isso, desenvolvemos um método que permite o estudo oportuno da regeneração muscular esquelética em modelos de zebrafish de doença muscular. Este oleoduto de alto rendimento envolve um método para genótipo embriões vivos¹⁴, após o qual uma lesão agulha-facada é realizada e a extensão da regeneração muscular é imageada usando microscopia de luz polarizadora. A utilização desta técnica revelará, portanto, a capacidade regenerativa do músculo em modelos de zebrafish de doença muscular.

Protocolo

A manutenção de zebrafish foi realizada de acordo com os procedimentos operacionais padrão aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Universidade monash sob licença de colônia de reprodução ERM14481.

1. Determinação do genótipo de embriões vivos usando uma plataforma de genotipagem de embriões.

1. Anesthetize 3 dias após a fertilização (dpf) embriões de zebrafish adicionando metanos de tricaine a uma concentração final de 0,016% (v/v) em embrião médio (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄ na água). Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
2. Prepare o chip de extração de DNA de 24 câmaras descascando a película protetora clara da superfície superior do chip(Figura 1A).
3. Corte a ponta de uma ponta de filtro de 20 μL para ampliar a abertura. Com isso, escolha um único embrião em um volume de 13 μL de meio de embrião e carregue na primeira câmara do chip. Repita este processo até que os embriões tenham sido dispensados em cada câmara.
   NOTA: Esta etapa deve ser realizada em uma área com mínimos rascunhos de ar, pois o alto fluxo de ar pode causar evaporação excessiva do fluido, resultando posteriormente na redução da sensibilidade genotipagem e na sobrevivência dos embriões.
4. Uma vez que o número desejado de embriões tenha sido carregado no chip de extração de DNA, carregue-o na plataforma de genotipagem de embriões de zebrafish. Isso é melhor conseguido colocando-se em um lado primeiro, seguido pelo resto.
   NOTA: Evite adicionar muita pressão na plataforma, pois isso pode estressar e danificar as molas subjacentes.
5. Afixe a tampa da plataforma magnética sobre o chip, que impedirá a evaporação da mídia embrionária durante o protocolo de extração de DNA, e feche a tampa da plataforma.
6. Defina a unidade base para 2,4 volts, 0,051 A e 0,12 W e inicie o protocolo de extração de DNA pressionando o botão "ON/OFF". A plataforma deve começar a vibrar, o que pode ser avaliado tocando suavemente a tampa. O protocolo deve ser executado por 8 minutos.
   NOTA: A vibração vigorosa resulta no derramamento de células epidérmicas, das quais o DNA genômico é extraído.
7. Enquanto o programa estiver em execução, prepare uma placa de 24 poços adicionando 1 mL de meio de embrião a cada poço, o que é necessário para separar embriões individuais enquanto ensaios de genotipagem a jusante estão sendo realizados.
8. Além disso, rotule adequadamente 8 tubos de tira de poço, que serão usados para coleta de material de DNA de cada embrião.
9. Na conclusão do protocolo de 8 minutos, pressione o botão ON/OFF para parar a vibração da plataforma.
10. Abra a tampa da plataforma e remova suavemente a tampa magnética garantindo que a pressão mínima seja aplicada à plataforma.
11. Remova cuidadosamente o chip de extração de DNA da plataforma e coloque-o em uma superfície plana.
12. Da primeira câmara, remova 10 μL de mídia embrionária em torno do embrião e coloque-o no poço apropriado do tubo de tira de 8 poços. A mídia contém o material genético daquele embrião, que será usado para ensaios a jusante.
    NOTA: Evite tocar no embrião com a ponta da pipeta durante a coleta de mídia, pois isso pode danificar o embrião.
13. Usando uma pipeta de plástico, adicione imediatamente duas gotas de meio de embrião fresco à mesma câmara. Pegue o embrião e mova-o para o primeiro poço de uma placa de 24 poços.
14. Repita as etapas 1.12 e 1.13 para todas as câmaras restantes. Ao final deste, a placa de 24 poços contendo embriões vivos pode ser movida para uma incubadora de 28 °C.
15. Realizar ensaios adequados de genotipagem a jusante para determinar o genótipo dos embriões.
    NOTA: O DNA obtido da plataforma de genotipagem de embriões pode ser amplificado com sucesso pelo PCR e pode ser usado para análises subsequentes, incluindo sequenciamento, eletroforese de gel ou análise de derretimento de alta resolução¹⁴. Para genótipo foram utilizadas a cepa lama2 descrita nos resultados representativos, PCR, digestão de restrição e eletroforese gel. Dado que a concentração de DNA obtido de cada embrião é baixa, sugere-se utilizar a maioria, se não todos, do material genético obtido para o ensaio a jusante.
16. Uma vez identificado o genótipo de cada larva, transfira-as para placas de Petri de 90 mm, colocando cada genótipo em um prato diferente. Encha o prato com 25 mL médio embrião e mantenha-o na incubadora de 28 °C.

2. Realizar lesão muscular usando uma facada de agulha

1. Uma vez que as larvas são 4 dpf, anestesia-as adicionando metanos de tricamina a uma concentração final de 0,016% (v/v) no meio do embrião. Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
   NOTA: Para evitar viés, a identidade do genótipo deve ser cega para o investigador que realiza as facadas e análises a jusante.
2. Durante este tempo, prepare 24 placas de poço preenchendo cada poço com 1 mL de meio de embrião fresco, e configure o estereoscópio com fundo preto e luz de alta potência, para facilitar a visualização das bordas de somite.
3. Usando uma pipeta de plástico, transfira uma larva anestesiada em uma nova placa de Petri.
4. Remova cuidadosamente o excesso de embrião médio com uma pipeta, e sob um microscópio dissecando, oriente o peixe de tal forma que a cabeça esteja à esquerda, cauda à direita, região dorsal para cima e região ventral para baixo(Figura 1B).
5. Trabalhando sob um microscópio dissecando, use uma agulha de calibre 30 para executar uma facada rápida, mas precisa no músculo epaxial localizado acima do mioseptum horizontal. Para garantir a consistência na posição anterior-posterior, aponte para 1-2 somites localizados acima do poro anal(Figura 1B).
   NOTA: Evite esfaquear o tubo neural e o notochord, e trabalhe rapidamente para evitar a secagem do peixe durante o processo.
6. Usando uma pipeta de plástico, despeje uma gota de meio de embrião no zebrafish esfaqueado e transfira-o cuidadosamente para um poço da placa de 24 poços.
7. Repita as etapas 2.3 a 2.6. até que todos os peixes tenham sido esfaqueados.
   NOTA: Várias larvas podem ser esfaqueadas juntas dependendo da velocidade de processamento e proficiência do investigador, desde que os peixes não sequem durante o processo.
8. Uma vez que todas as larvas tenham sido esfaqueadas, coloque a placa de 24 poços na incubadora de 28 °C até que a imagem subsequente seja realizada.

3. Imagem de lesão muscular e recuperação

1. Aos 1 dia de lesão pós(1 dpi), anestesiar as larvas esfaqueadas adicionando metanosulfonato de tricaína a uma concentração final de 0,016% (v/v) no meio do embrião. Aguarde 10 minutos para garantir que os peixes estejam completamente anestesiados, evidentes quando os peixes param de nadar.
   NOTA: A 0 dpi, o local da ferida contém uma grande quantidade de detritos celulares, o que dificulta a quantificação da extensão da lesão muscular(Figura Suplementar 1A-B). Leva aproximadamente 18-20 horas para que esses detritos sejam retirados do local da ferida, e como tal é mais confiável para a imagem larvas a 1 dpi, em vez de 0 dpi, para determinar a extensão da lesão provocada.
2. Coloque um prato à base de vidro limpo e vazio no estágio do microscópio polarizador e coloque o fundo usando o software integrado.
   NOTA: Não use placas de Petri de plástico para a birefringência da imagem, pois elas não transmitem adequadamente a luz refratada. Dependendo do microscópio polarizado utilizado, configurações adicionais podem ser necessárias de acordo com as diretrizes do fabricante.
3. Tendo definido o fundo, remova o prato à base de vidro do estágio do microscópio, e usando uma pipeta de vidro, transfira o peixe anestesiado e esfaqueado para o prato à base de fundo de vidro.
4. Remova cuidadosamente o excesso de meio embrião usando uma pipeta e oriente o peixe conforme 2,5 - a cabeça está à esquerda, cauda à direita, região dorsal para cima e região ventral para baixo.
   NOTA: Certifique-se de que as larvas estão montadas o mais planas possível, pois a montagem desigual resulta em diferentes intensidades de birefringência em diferentes somitas.
5. Coloque o prato à base de vidro com as larvas anestesiadas no estágio do microscópio e imagem do músculo usando luz polarizada(Figuras 1C & 1D).
   NOTA: Dependendo do tipo de microscópio/lente polarizada utilizada, a orientação do peixe em seu eixo anterior-posterior pode afetar a birefringência geral¹⁵. Certifique-se de incluir pelo menos 5 somites em ambos os lados do local da lesão ao fotografar.
6. Usando uma pipeta de plástico, despeje uma gota de meio embrião para reidratar o peixe e coloque o peixe em um poço de uma placa de 24 poços cheia de meio de embrião.
   NOTA: É importante realizar a imagem o mais rápido possível para evitar que o peixe seque.
7. Repita os passos 3.3. para 3,6. até que todos os peixes tenham sido imagens.
8. Quando todas as imagens tiverem sido adquiridas, guarde-as em formato .tiff para análises subsequentes.
9. Coloque o peixe de volta na incubadora de 28 °C até realizar imagens subsequentes em 3 dpi (7 dpf).
10. Quando os peixes estiverem com 3 dpi, imagem do peixe de 3,3 a 3,8.
11. Uma vez que todos os peixes tenham sido imageados, eutanize-os adicionando metanos de tricaína a uma concentração final de 0,2% (v/v) em meio de embrião. Aguarde pelo menos 10 minutos para garantir que os peixes sejam eutanizados, evidentes pela perda da capacidade de natação, bombeamento das tampas da brânquia e falta de uma resposta de voo após o toque.

4. Quantificação da regeneração muscular

1. Abra uma imagem de 1 dpi em um software de análise de imagens, como o software Image J disponível gratuitamente.
2. Utilizando a ferramenta polígono, desenhe ao redor do local da ferida e meça a área e a intensidade média de birefringência desta região (Figuras 1C & 1D). Copie esses valores para as células D3 e E3 no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
3. Desenhe duas regiões adicionais, cada uma abrangendo 1-2 somites ilesos, e meça a área e intensidades médias de birefringência de cada uma dessas regiões (Figuras 1C e 1D). Copie esses valores para as células D4-D5 e E4-E5 no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
   NOTA: Embora seja preferível selecionar os mesmos somites não feridos nas imagens de 1 dpi e 3 dpi, o descolamento esporádico das fibras musculares e a subsequente redução da birefringência em mutantes podem tornar isso impossível. Portanto, caso as mesmas somitas não possam ser selecionadas em 1 dpi e 3 dpi devido à redução da integridade muscular em mutantes, selecione duas áreas diferentes, mas não afetadas em cada um dos pontos de tempo.
4. Calcule a birefringência normalizada para cada região dividindo a intensidade média de birefringência daquela região pela área - exibida na coluna F no modelo fornecido (Tabela Suplementar 1).
5. Repita as etapas 4.1-4.4 para todas as imagens de 1 dpi e 3 dpi.
   NOTA: Ao utilizar o modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), a área de 1 dpi e os valores médios de intensidade de birefringência devem ser inseridos nas colunas D e E, respectivamente, e a área de 3 dpi e valores médios de intensidade de birefringência devem ser inseridos nas colunas J e K, respectivamente.
6. Para cada ponto de tempo, calcule a média normalizada das duas regiões não feridas. Este valor fornece um ponto de referência do músculo ileso.
   NOTA: No modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado nas colunas G e M, para as imagens de 1 dpi e 3 dpi, respectivamente.
7. Em seguida, determine a extensão da lesão muscular em 1 dpi, dividindo a birefringência normalizada da região da lesão pela bireringência normalizada média das regiões não feridas (calculada em 4,6).
   NOTA: Utilizando o procedimento de punhalação de agulha detalhado acima, as larvas de tipo selvagem tipicamente apresentam uma bireringência normalizada de 48,5 ± 14,3% no local da ferida a 1 dpi, indicando que a birefringência reduziu em aproximadamente 50% quando comparada a somitas não feridas. Ao utilizar o modelo (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado como uma porcentagem na coluna H.
8. Para determinar a extensão da regeneração muscular, divida a birefringência normalizada da região da lesão na imagem de 3 dpi, pela intensidade normalizada média das regiões não feridas nesta fase.
   NOTA: A 3 dpi, as larvas de tipo selvagem normalmente apresentam uma bireringência normalizada de 60 ± 15,3% no local da ferida. Dado que a bireringência normalizada dentro do local da ferida em 1 dpi foi de 48,5 ± 14,3% (etapa 4,7), o aumento da birferência em 3 dpi para 60 ± 15,3% indica uma recuperação de aproximadamente 11,5%. Ao utilizar o modelo (Tabela Suplementar 1), esse valor é computado como uma porcentagem na coluna N.
9. Mantendo os peixes dentro de cada genótipo separados, realize um teste t emparelhado comparando a birefringência normalizada do local da ferida em 3 dpi (etapa 4.8) com o de 1 dpi (etapa 4.7). Isso revelará a trajetória de regeneração muscular exibida por cada peixe em cada genótipo, e destacará se a extensão da regeneração muscular exibida por cada genótipo foi significativamente alterada.
10. Por fim, calcule o índice regenerativo dividindo o valor obtido na etapa 4.8, que é a extensão da regeneração muscular em 3 dpi, pelo valor obtido na etapa 4.7, que é a extensão da lesão muscular em 1 dpi. Um índice regenerativo de 1 indica que a lesão em 1 dpi é comparável a 3 dpi e que a regeneração muscular não ocorreu; um valor acima de 1 indica que a 3 dpi novo músculo se formou no local da ferida destacando que o músculo se regenerou; e um índice regenerativo de menos de 1 destaca que a ferida em 3 dpi é pior que 1 dpi, e que a regeneração muscular em prejudicada. Um teste t ou um ANOVA unidirecional pode ser realizado para comparar estatisticamente a extensão da regeneração muscular entre os diferentes genótipos. Ao utilizar o modelo fornecido (Tabela Suplementar 1), esse valor é calculado na coluna O.
    NOTA: Recomenda-se realizar todo o experimento em triplicados, com peixes de cada experimento obtidos de diferentes pais biológicos, e cada experimento realizado em dias diferentes, para evitar qualquer viés.

Resultados

A capacidade de quantificar a birefringência do músculo esquelético fornece um método não invasivo, mas altamente reprodutível, para examinar e comparar níveis de dano muscular, e examinar a regeneração muscular in vivo. A birefringência resulta da difração da luz polarizada através da matriz pseudo-cristalina dos sarcomeres musculares¹⁵, e após lesão ou dano ao músculo, é evidente uma redução na birefringência. Da mesma forma, a ativa?...

Discussão

A regeneração muscular esquelética é impulsionada por células-tronco musculares residentes em tecidos obrigatórios, cuja função é alterada em muitas doenças musculares, como distrofia muscular, impedindo posteriormente o processo de regeneração muscular. Aqui, descrevemos um protocolo de alta produtividade para examinar a regeneração muscular em modelos de zebrafish vivos de doença muscular. O primeiro passo do gasoduto utiliza uma plataforma de genotipagem de embriões¹⁴, que é um...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A