Descoberta de reguladores metastáticos usando um modelo de membrana corioallantóica intravital rápida e quantitativa

Resumo

Este é um método eficaz para testar supressores ou condutores de metástase de câncer. As células, transduzidas com uma biblioteca de expressão, são injetadas na vasculatura da membrana corioallantóica do frango para formar colônias metastáticas. Colônias que têm diminuído ou aumentado a invasividade são extirpadas, expandidas, reinjetadas para confirmar seu fenótipo e, finalmente, analisadas usando alto sequenciamento de rendimento.

Resumo

Os recentes avanços na pesquisa sobre câncer ilustraram a natureza altamente complexa da metástase do câncer. Vários genes ou redes de genes estão envolvidos na regulação diferencial de genes em cascata metastáticas do câncer e produtos genéticos dependentes do tipo de câncer, tecido e características individuais do paciente. Estes representam alvos potencialmente importantes para terapêutica genética e abordagens medicinais personalizadas. O desenvolvimento de plataformas de triagem rápida é essencial para a identificação desses alvos genéticos.

A membrana corioallantóica do filhote (CAM) é uma membrana altamente vascularizada, rica em colágeno localizada sob a casca de ovo que permite a troca de gás no embrião em desenvolvimento. Devido à localização e vascularização da CAM, desenvolvemos-a como um modelo de metástase intravital de câncer humano que permite a xenoenxerização robusta de células cancerígenas humanas e a imagem em tempo real das interações celulares cancerígenas com a matriz rica em colágeno e a vasculatura.

Utilizando este modelo, uma plataforma de triagem quantitativa foi projetada para a identificação de novos condutores ou supressores de metástase de câncer. Transturamos um grupo de células cancerígenas HEp3 com uma biblioteca completa de genes de genoma humano, depois injetamos as células, em baixa densidade, na vasculatura cam. As células proliferaram e formaram colônias de células de tumor único. Colônias individuais que não puderam invadir o tecido CAM eram visíveis como um fenótipo de colônia compacta e excisadas para identificação do shRNA transduzido presente nas células. Imagens de colônias individuais foram avaliadas por sua invasividade. Foram realizadas várias rodadas de seleções para diminuir a taxa de falsos positivos. Clones individuais e isolados de células cancerígenas ou clones recém-projetados que expressam genes de interesse foram submetidos a ensaios de formação de tumores primários ou análise de co-opção de vasculatura de células cancerosas. Em resumo, apresentamos uma plataforma de triagem rápida que permite a identificação de alvos anti-metastáticos e a análise intravital de uma cascata dinâmica e complexa de eventos.

Introdução

Metástase é a principal causa de morte de paciente com câncer^1,2,3. As células cancerígenas metastáticas utilizam caminhos de sinalização distintos, dependentes do tipo de câncer, ao longo das cinco etapas da cascata metastática: invasão local, intravasão, sobrevivência na circulação, extravasão e expansão de colônias em locais metastáticos distantes. A compreensão atual desse processo metastático sugere que há duas etapas de gargalo, uma é a invasão direcional da célula cancerígena do tumor primário, e a segunda é o estabelecimento da lesão metastática do local distante

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as normas e diretrizes do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Alberta. Embriões aviários não são considerados animais vivos por muitos institutos de pesquisa e nenhum protocolo animal é necessário. É, no entanto, uma visão aceita de que os embriões aviários podem sentir dor e, portanto, devem ser tratados da forma mais humana possível. A autoridade local de pesquisa animal deve ser contatada antes do início de qualquer trabalho de pesquisa para garantir que as regulamentações adequadas sejam seguidas.

1. Cultura de ovos sem casca

1. Adquira ovos de ....

Resultados

A injeção de células cancerígenas é considerada bem sucedida se a maioria das células que estão alojadas nos capilares forem solteiras e localizadas a uma diferença significativa entre si (~0,05-0,1 cm) para que as colônias não se sobreponham após 5-6 dias de período de incubação(Figura 3A). A injeção não foi bem sucedida se um acúmulo de células cancerígenas pode ser visto na maioria dos capilares, embriões que exibem isso devem ser desc.......

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo de triagem intravital baseado em microscopia de fluorescência rápida que pode ser utilizado para aplicações importantes, como telas genéticas ou candidatas a medicamentos. Células cancerígenas que foram transduzidas com uma biblioteca genética de interesse ou transfeinadas com construtos de expressão individual podem ser rapidamente rastreadas e quantificadas quanto ao fenótipo de interesse usando este modelo CAM pintinho. Uma vez que os protocolos de transdução ou transfecção .......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 mL disposable syringes	BD	BD309659
15 mL conical centrifuge tubes.	Corning	CLS430791-500EA
18 gauge x 1 1/2  BD precision needle	BD	BD305196	we use 1.2mm x 40mm, it is possible to use shorter needles if preferred
2.5% Trypsin solution	many sources are available
4T1 mouse breast cancer	ATCC	CRL-2539
B16F10 mouse melanoma cell line	ATCC	CRL-6475
Benchtop centrifuge.	many sources are available		Any TC compatible centrifuge that can be used to spin down the cells is suitable
Circular coverslips, 22 mm.	Fisher Scientific	12-545-101
Collagenase	Sigma	C0130-100MG
Confocal microscope			We use Nikon A1r
cotton swabs	many sources are available		must be sterilized before use
Culture media appropriate for the cell lines used	many sources are available		We grow HT1080, HEp3 and b16 cell lines in DMEM, 10% FBS media
Egg incubator	many sources are available		An exact model that is necessary depends on the scale of the screen. Available sources are MGF Company Inc., Savannah, GA, or  Lyon Electric Company Inc., Chula Vista, CA
eppendor tubes , 1.5ml	Sigma	T4816-250EA
Fertilized White Leghorn eggs	any local supplyer
fine forceps	many sources are available		must be sterilized begfore use
Hemocytometer	Millipore-Sigma	MDH-4N1-50PK
HT1080 human fibrosarcoma cell line	ATCC	CCL-121
Image analysis software			We use Nikon Elements
Lectin Lens Culinary Agglutinin (LCA) conjugated with Fluorescein or Rhodamine	Vector Laboratories	RL-1042, FL-1041	Dilute stock (5mg/ml) 50-100x depending on the microscope sensetivity. Must be a different color from the color of cell line used for screening
MDA-MB-468 human breast cancer	ATCC	HTB-132
PBS (1x)	many sources are available
Plastic weighting dishes	Simport	CA11006-614	dimensions are 78x78x25mm; many other sources are available
small surgical scissors	many sources are available		must be sterilized before use
Sodium borosilicate glass capillary tubes, outer diameter 1.0 mm, inner diameter 0.58 mm, 10 cm length	Sutter Instrument	BF100-58-10
Square petri dishes (used as lids for the weighting dishes).	VWR	CA25378-115	dimensions are 100x100x15mm; many other sources are available
Stereo fluorescent microscope			We use Zeiss Lumar v12
Tygon R-3603 laboratory tubing	Cole-Parmer	AAC00001	1/32 in inner diameter, 3/32 in. outer diameter, 1/32 in. wall thickness
U-118 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-15
U-87 MG human glioblastoma	ATCC	HTB-14
Vertical pipette puller	many sources are available		we use David Kopf Instruments, Tujunga, CA; Model 720