Avaliação Funcional da Permeabilidade Intestinal e Migração Transepitelial de Neutrófilo em Camundongos usando um Modelo de Laço Intestinal Padronizado

Resumo

Função de barreira epitelial intestinal disregulada e respostas imunológicas são marcas de doença inflamatória intestinal que permanecem mal investigadas devido à falta de modelos fisiológicos. Aqui, descrevemos um modelo de alça intestinal de camundongos que emprega um segmento intestinal bem vascularizado e exteriorizado para estudar a permeabilidade mucosa e o recrutamento de leucócitos in vivo.

Resumo

A mucosa intestinal é forrada por uma única camada de células epiteliais que forma uma barreira dinâmica que permite o transporte paracelular de nutrientes e água, evitando a passagem de bactérias luminais e substâncias exógenas. Uma violação dessa camada resulta em maior permeabilidade ao conteúdo luminal e recrutamento de células imunes, ambas marcas de estados patológicos no intestino, incluindo doença inflamatória intestinal (DII).

Os mecanismos que regulam a função da barreira epitelial e a migração transepitelial (TEpM) de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) são incompletamente compreendidos devido à falta de métodos experimentais in vivo que permitem análises quantitativas. Aqui, descrevemos um modelo experimental murino robusto que emprega um segmento intestinal exteriorizado de íleo ou cólon proximal. O laço intestinal exteriorizado (iLoop) é totalmente vascularizado e oferece vantagens fisiológicas sobre abordagens baseadas em câmara ex vivo comumente usadas para estudar permeabilidade e migração de PMN através de monocamadas de células epiteliais.

Demonstramos duas aplicações deste modelo em detalhes: (1) medição quantitativa da permeabilidade intestinal através da detecção de dextrans rotulados por fluorescência no soro após injeção intraluminal, (2) avaliação quantitativa do PMN migrado através do epitélio intestinal para o lúmen intestinal após introdução intraluminal de quimioattractants. Demonstramos viabilidade deste modelo e fornecemos resultados utilizando o iLoop em camundongos sem a proteína epitelial associada à junção JAM-A em comparação com os controles. O JAM-A tem sido mostrado para regular a função da barreira epitelial, bem como pmn TEpM durante respostas inflamatórias. Nossos resultados utilizando o iLoop confirmam estudos anteriores e destacam a importância do JAM-A na regulação da permeabilidade intestinal e do PMN TEpM in vivo durante a homeostase e doença.

O modelo iLoop fornece um método altamente padronizado para estudos in vivo reprodutíveis de homeostase intestinal e inflamação e aumentará significativamente a compreensão da função da barreira intestinal e inflamação mucosa em doenças como o DII.

Introdução

A mucosa intestinal abrange uma única camada de células epiteliais intestinais colunares (IECs), células imunes de lamina propria subjacentes e mucosa muscular. Além de seu papel na absorção de nutrientes, o epitélio intestinal é uma barreira física que protege o interior do corpo de bactérias luminais, patógenos e antígenos dietéticos. Além disso, IECs e células imunes lamina propria coordenam a resposta imune induzindo tolerância ou resposta, dependendo do contexto e estímulos. Foi relatado que o rompimento da barreira epitelial pode preceder o aparecimento de inflamação patológica da mucosa e contribuir para a doença inflamatória intestinal (DII) que abrange tanto ....

Protocolo

Todos os experimentos em animais foram conduzidos de acordo com as diretrizes e políticas dos Institutos Nacionais de Saúde e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.

1. Preparação pré-operatória

NOTA: Este método foi gerado empregando camundongos adultos de origem genética C57BL/6, de 8 a 12 semanas. Todos os camundongos foram mantidos sob rigorosas condições específicas de livre patógenos com acesso ad libitum à comida e água normais. Os resultados foram obtidos utilizando C57BL/6, Jam-a - ratos nulos(Jam-a^-/-) ou camundongos que ab....

Resultados

Uma representação esquemática dos modelos ileal loop e pcLoop é retratada na Figura 1 e Figura 2, respectivamente. As imagens anatômicas exibem as etapas críticas do procedimento, incluindo a exteriorização do segmento intestinal (Figura 1B e Figura 2B),identificação de um local apropriado para ligaduras que permite perturbação mínima do suprimento de sangue

Discussão

Os mecanismos responsáveis pela desregulação da função da barreira intestinal e o recrutamento de células imunes em condições patológicas como o IBD são incompletamente compreendidos. Aqui, detalhamos um modelo robusto in vivo murine que emprega um segmento intestinal exteriorizado bem vascularizado de cólon ileum ou proximal e permite a avaliação da permeabilidade intestinal, estudos de migração de neutrófilos, bem como outras aplicações.

O iLoop é uma cirurgia de não recu.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment and Material
BD Alcohol Swabs	BD	326895
BD PrecisionGlide Needle, 25G X 5/8"	BD	305122
BD PrecisionGlide Needle, 30G X 1/2"	BD	305106
BD 1ml Tuberculin Syringe Without Needle	BD	309659
15ml Centrifuge Tube	Corning	14-959-53A
Corning 96-Well Solid Black Polystyrene Microplate	FisherScientific	07-200-592
Corning Non-treated Culture Dish, 10cm	MilliporeSigma	CLS430588
Cotton Tip Applicator (cotton swab), 6", sterile	FisherScientific	25806 2WC
Dynarex Cotton Filled Gauze Sponges, Non-Sterile, 2" x 2"	Medex	3249-1
EZ-7000 anesthesia vaporizer (Classic System, including heating units)	E-Z Systems	EZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml	VWR	21008-940
Fisherbrand Colored Labeling Tape	FisherScientific	15-901-10R
Halsey Needle Holder (needle holder)	FST	12001-13
Kimwipes, small (tissue wipe)	FisherScientific	06-666
1.7ml Microcentrifuge Tubes	Thomas Scientific	c2170
Micro Tube 1.3ml Z (serum clot activator tube)	Sarstedt	41.1501.105
Moria Fine Scissors	FST	14370-22
5ml Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap (35 µm nylon mesh)	Falcon	352235
Puralube Vet Ointment, Sterile Ocular Lubricant	Dechra	12920060
Ring Forceps (blunt tissue forceps)	FST	11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YD	FisherScientific	NC9452680
Semken Forceps (anatomical forceps)	FST	1108-13
Sofsilk Nonabsorbable Coated Black Suture Braided Silk Size 3-0, 18", Needle 19mm length 3/8 circle reverse cutting	HenrySchein	SS694
Student Fine Forceps, Angled	FST	91110-10
10ml Syringe PP/PE without needle	Millipore Sigma	Z248029
96 Well Cell Culture Plate	Corning	3799
Yellow Feeding Tubes for Rodents 20G x 30 mm	Instech	FTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTA	Lonza	51201
Ammonium-Chloride-Potassium (ACK) Lysing Buffer	BioWhittaker	10-548E
Hanks' Balanced Salt Solution	Corning	21-023-CV
Phosphate-Buffered Saline without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Antibody (1A8)	BioLegend	127610
CD11b Monoclonal Antibody, PE, eBioscience (M1/70)	ThermoFisher	12-0112-81
CountBright Absolute Counting Beads	Invitrogen	C36950
Dithiotreitol	FisherScientific	BP172-5
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	R&D Systems	511550
Fluorescein Isothiocyanate-Dextran, average molecular weight 4.000	Sigma	60842-46-8
Isoflurane	Halocarbon	12164-002-25
Leukotriene B4	Millipore Sigma	71160-24-2
PerCP Rat Anti-Mouse CD45 (30-F11)	BD Pharmingen	557235
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD FC Block)	BD Bioscience	553142
Recombinant Murine IFN-γ	Peprotech	315-05
Recombinant Murine TNF-α	Peprotech	315-01A