Modelo de cocultura sem contato para o estudo da ativação de células imunes inatas durante a infecção por vírus respiratório

Resumo

Este protocolo detalha uma investigação das interações iniciais entre células epiteliais nasais infectadas viralmente e ativação celular inata. Subconjuntos individuais de células imunes podem ser distinguidos com base em sua ativação em resposta a infecções virais. Eles podem então ser investigados para determinar seus efeitos sobre as respostas antivirais precoces.

Resumo

As interações precoces entre a camada epitelial nasal e as células imunes inatas durante infecções virais permanecem uma área pouco explorada. A significância da sinalização de imunidade inata em infecções virais aumentou substancialmente à medida que pacientes com infecções respiratórias que apresentam alta ativação de células T inatas mostram um melhor desfecho da doença. Assim, dissecar essas interações imunológicas inatas precoces permite a elucidação dos processos que os regem e pode facilitar o desenvolvimento de potenciais alvos terapêuticos e estratégias para amortecer ou mesmo prevenir a progressão precoce de infecções virais. Este protocolo detalha um modelo versátil que pode ser usado para estudar o crosstalk precoce, interações e ativação de células imunes inatas a partir de fatores secretados por células epiteliais viralmente infectadas pelas vias aéreas. Utilizando um vírus de influenza H3N2 (A/Aichi/2/1968) como modelo representativo do vírus, a ativação celular inata de células mononucleares periféricas co-cultivadas (PBMCs) foi analisada usando citometria de fluxo para investigar os subconjuntos das células que são ativadas pelos fatores solúveis liberados do epitélio em resposta à infecção viral. Os resultados demonstram a estratégia de diferenciação dos subconjuntos das células e revelam as diferenças claras entre as populações ativadas de PBMCs e seu crosstalk com o controle e epitélio infectado. Os subconjuntos ativados podem então ser analisados para determinar suas funções, bem como alterações moleculares específicas das células. Os achados de tal investigação de crosstalk podem descobrir fatores importantes para a ativação de populações celulares inatas vitais, que são benéficas no controle e na supressão da progressão da infecção viral. Além disso, esses fatores podem ser universalmente aplicados a diferentes doenças virais, especialmente em vírus recém-emergentes, para amortecer o impacto desses vírus quando circulam pela primeira vez em populações humanas ingênuas.

Introdução

Os vírus respiratórios estão talvez entre os patógenos mais difundidos que causam cuidados de saúde graves e carga econômica. Desde os surtos globais periódicos de cepas epidêmicas emergentes (por exemplo, H1N1, H5N1, H3N2, MERS, COVID-19) até as cepas sazonais da gripe todos os anos, os vírus são uma ameaça constante à saúde pública. Embora as vacinas formem a maior parte da resposta a esses desafios globais de saúde pública, é preocupante notar que essas contramedidas são^{meramente responsivas 1,2}. Além disso, um atraso entre o surgimento de uma nova cepa infecciosa e o desenvolvimento bem-sucedido de sua vacina é inevitável³, levando a um período em que as medidas disponíveis para conter a propagação do vírus são altamente limitadas.

Esses atrasos são ainda mais enfatizados pelos custos que são infligidos à sociedade economicamente e socialmente. Só a gripe sazonal é responsável por aproximadamente US$ 8 bilhões em custos indiretos, US$ 3,2 bilhões em custos médicos e 36,3 mil mortes nos Estados Unidos da América anualmente⁴. Isso é antes da consideração dos custos de pesquisa necessários para financiar o desenvolvimento de vacinas. Surtos epidêmicos têm efeitos ainda mais graves na sociedade, agravados pelo aumento da taxa de globalização a cada ano, como evidenciado pelas perturbações globais causadas pelo surgimento e rápida disseminação da síndrome respiratória aguda grave coronovírus 2 (SARS-CoV-2)^5,6,7.

Estudos recentes têm mostrado que pacientes infectados com maior população de células T inatas ativadas tendem a ter um melhor desfecho da doença ^8,9,10. Além disso, a população de células T inatas é categorizada em múltiplos subgrupos: as células invariantes associadas à mucosa T (MAIT), células Vδ1 γδ T, células Vδ2 γδ T e as células T (NKT) assassinas naturais. Esses subgrupos de células T inatas também apresentam heterogeneidade dentro de suas populações, aumentando a complexidade das interações entre as populações celulares envolvidas na resposta imune inata¹¹. Assim, o mecanismo que ativa essas células T inatas e o conhecimento dos subgrupos específicos de células T inatas podem fornecer uma via diferente de pesquisa para reduzir os efeitos infecciosos desses vírus no hospedeiro humano, especialmente durante o período de desenvolvimento vacinal.

As células epiteliais infectadas pela gripe produzem fatores que ativam rapidamente^as células T inatas 12,13,14. Com base nessa descoberta, este modelo de co-cultura de Interface Ar-Líquido (ALI) sem contato tem como objetivo imitar as interações químicas iniciais (mediadas por fatores solúveis liberados pela camada epitelial infectada) entre a camada epitelial nasal infectada e os PBMCs durante a infecção precoce. A separação física entre a camada epitelial nasal (cultivada nas pastilhas de membrana) e os PBMCs (na câmara inferior) e a integridade epitelial previne a infecção direta dos PBMCs pelo vírus, permitindo um estudo detalhado dos efeitos dos fatores solúveis derivados da epitelial nos PBMCs. Os fatores identificados podem, portanto, ser investigados por seu potencial terapêutico em induzir a população de células T inatas apropriadas que possam proteger contra a infecção por gripe. Este artigo, portanto, detalhou os métodos de estabelecer uma cocultura para o estudo da ativação inata de células T a partir de fatores solúveis derivados do epitélio.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela 1 para receitas de mídia utilizadas neste protocolo.
NOTA: o hNECS cultivado em transwell de 12 poços foi encontrado para crescer em espessura mais ideal para fatores solúveis para chegar à câmara basal prontamente quando infectados com o vírus influenza. Por isso, recomenda-se o uso de transwell de 12 bem dimensionados para a cocultura.

1. Estabelecimento da camada alimentador 3T3

1. Estabelecimento de estoques congelados
   1. Descongele um criovial de fibroblastos NIH/3T3 de estoques congelados. Adicione o conteúdo do criovial a 2 mL de DMEM (Minimal Essential Media, mídia essencial mínima) da Dulbecco e resuspenque as células.
   2. Centrifugar por 5 min a 300 × g e temperatura ambiente/pressão (rtp), e remover o sobrenatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
   3. Conte as células usando manchas azuis de tripano. Adicione 10 μL de trippan azul a 10 μL da suspensão da célula resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da suspensão a um hemótmetro para contar as células.
   4. Células de sementes a uma densidade de 1 × 10⁴ células/cm² em um prato de cultura apropriado (por exemplo, frasco T75). Incubar o frasco de cultura resultante por 3 dias a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
2. Tratamento mitomicina C
   1. Aos 3 dias, certifique-se de que a confluência seja de 60%-80%, remova o meio e lave as células com soro fisiológico tamponado de fosfato 1x (PBS).
      NOTA: É importante que a camada de alimentador 3T3 não atinja a confluência total; caso contrário, o tratamento mitomicina C não será eficaz.
   2. Adicione dMEM completo suplementado por mitomicina C ao frasco e incubar por 3,5 h a 37 °C em uma atmosfera de CO_{2 de} 5%. Remova o meio contendo mitomicina C e lave as células 2x com 1x PBS.
3. Semeadura de células 3T3 em placas de 6 poços
   1. Adicione 3 mL de 1x trypsin-EDTA ao frasco por 3-5 min para desassociar as células. Colete as células dissociadas em um tubo fresco de 15 mL. Centrifugar o tubo de 15 mL por 5 min a 300 × g, rtp; descartar o supernatante. Resuspenda as células em DMEM completo.
   2. Conte as células usando manchas azuis de tripano. Semente as células em uma placa de 6 poços a 7,5 × 10 5-2,5 × 10⁶ células/bem. Incubar a placa durante a noite a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂.
      NOTA: A camada de alimentador 3T3 é considerada pronta se as células estiverem saudáveis. Neste ponto, semeou as células-tronco/progenitoras epiteliais nasais humanas (hNESPCs) na camada alimentadora para expansão.
   3. Adicione DMEM completo ao frasco e incubar a 37°C, 5% DE CO² durante a noite para as células 3T3 se recuperarem do tratamento mitomicina C.

2. Estabelecimento da cultura da célula epitelial nasal humana (hNEC)

NOTA: As amostras clínicas devem ser obtidas de pacientes livres de sintomas de infecção do trato respiratório superior.

1. Processamento de tecido nasal em suspensão unicelular
   1. Lave o tecido nasal no PBS (dPBS) de Dulbecco (PBS) (PBS sem Mg²⁺ e Ca²⁺) contendo 100 μL/mL de uma mistura antibiótico-antimíctico. Corte o tecido em pequenos fragmentos e trate a amostra em 10 mg/mL de uma protease neutra durante a noite a 4 °C com agitação.
   2. Centrifugar por 5 min a 200 × g, e remover o sobrenatante após centrifugação. Incubar a pelota em 1-2 mL de 1x trypsin-EDTA (37 °C, 15 min), e saciar adicionando um volume de soro bovino fetal igual a 10% do volume no tubo.
   3. Dissociar mecanicamente o tecido digerido em agregados unicelulares por pipetação, e então passar a suspensão resultante através de um coador de células de 70 μm. Resuspenda as células em DMEM completo.
      NOTA: Após esta etapa, a suspensão celular é uma mistura de células terminais diferenciadas e células-tronco que são referidas como células-tronco/progenitoras nasais humanas (hNESPCs). O objetivo das etapas subsequentes é selecionar e enriquecer a população do HNESPC a partir da mistura de diferentes populações celulares.
2. Semeadura de uma suspensão de célula única na camada alimentador 3T3 para seleção de hNESPCs
   1. Centrifugar a suspensão celular da etapa 2.1.3 (300 × g, 5 min, rtp), e remover o sobrenante. Resuspense as células em 3-5 mL de média 3.
      NOTA: O Medium 3 é formulado para promover o crescimento seletivo dos hNESPCs.
   2. Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 1 x 10⁶ células em 2mL de média 3 por poço em placa de 6 poços contendo camada de alimentador 3T3 preparada após a remoção da mídia na placa de 6 poços. Incubar a cocultura resultante a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5%.
      NOTA: Após a semeadura, tome cuidado para não agitar a placa, pois ela afetará a fixação dos hNESPCs.
   3. Troque o médio 3 (2 mL) a cada 2-4 dias, removendo o médio antigo inteiramente e substituindo-o por meio fresco 3.
      NOTA: O médio é alterado para repor nutrientes e para evitar que condições excessivamente ácidas influenciem negativamente o crescimento dos hNESPCs. O intervalo entre cada mudança média depende de quão ácido (amarelo) o meio se torna. Os intervalos devem ser encurtados se o meio se tornar ácido rapidamente.
   4. Após 7-10 dias, observe que os hNESPCs estão em uma confluência adequada para transferi-los para as pastilhas de membrana. Consulte a Figura 1 para morfologia representativa de hNESPCs em 3 horários diferentes (2 dias, 5 dias e 10 dias).
3. Transferência de hNESPCs para pastilhas de membrana
   NOTA: Devido ao tratamento da mitomicina C, a camada alimentador 3T3 se degradará lentamente durante o período de expansão do hNESPC. Isso resultará em uma adesão enfraquecida à superfície do poço, permitindo seu desalojamento lavando-se com uma pipeta, deixando para trás apenas os hNESPCs saudáveis.
   1. Retire o meio e adicione 500 μL de 1x dPBS a cada poço. Lave as células 3x com uma micropipette para desalojar as células 3T3 e descartar o 1x dPBS. Observe sob o microscópio que os hNESPCs redondos permanecem enquanto a camada alimentador 3T3 em forma de fuso é desalojada.
   2. Adicione 500 μL de um reagente de dissociação celular por poço, e incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% por 5-10 min, ou até que os hNESPCs tenham se destacado da superfície do poço.
   3. Colete a suspensão hNESPC, centrífuga (300 × g, 5 min, rtp) e remova o supernaspeso.
   4. Resuspenda a pelota em média 3. Conte as células através de coloração azul trypan. Semente 3 × 10⁴ células em 150 μL de inserção média 3 por membrana (placa de 24 poços) ou 1 × 10⁵ células em 300 μL de média 3 por inserção de membrana (placa de 12 poços) (Figura 2). Incubar as células a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ .
   5. Troque o médio (médio 3) das câmaras apical e basal a cada 2 dias. Navegue por uma ponta de pipeta entre os braços de suporte da pastilha de membrana para acessar a câmara basal, remova o meio antigo e, em seguida, reintroduza o meio fresco pelo mesmo método. Embora a câmara apical seja facilmente acessível, tome cuidado para não perturbar a crescente camada hNESPC.
      NOTA: Não perturbe o meio na câmara apical por pelo menos 2 dias após a semeadura, pois as células precisam de tempo para se prender à membrana.
4. Diferenciação dos hNESPCs em hNECs
   1. Quando os hNESPCs atingem 100% de confluência (aproximadamente 3-7 dias a partir da semeadura na pastilha da membrana), inicie a cultura ALI. Altere o meio basal para o meio de diferenciação e remova o meio da câmara apical. Basta adicionar meio à câmara basal sem adicioná-la à câmara apical ao alterar o meio a cada 2-3 dias, conforme indicado na Figura 3 e etapa 2.3.5.
      NOTA: O meio é alterado para meio de diferenciação para promover a diferenciação dos hNESPCs em hNECs em ALI. Os hNESPCs levam aproximadamente 3-4 semanas para atingir a maturidade total para se tornarem hNECs em ALI, momento em que as células teriam se tornado uma multicamadas com diferentes populações de células em cada camada. Cília também deve ser observada em uma ampliação de 400x (cílio pode ser identificado pelo seu movimento de espancamento, o que faz com que o campo de microscópio pareça estar vibrando). Neste ponto, as células estão prontas para serem usadas para os experimentos de co-cultura. Consulte a Figura 4 para obter a seção transversal de uma camada hNEC totalmente diferenciada.
   2. Depois de obter hNECs maduros, lave as células na câmara apical 3x com 1x dPBS em intervalos de 2-3 dias durante uma semana antes do experimento de cocultura. Sinergize a etapa de lavagem com as alterações do meio basal e realize as lavagens da seguinte forma.
      1. Adicione 50 μL (24-bem)/150 μL (12-bem) de 1x dPBS na câmara apical da inserção da membrana e incubar as células a 37 °C por 10 min. Remova o dPBS após 10 minutos de incubação para remover muco acumulado e células mortas ao longo da diferenciação.
         NOTA: Dependendo da natureza do experimento, a solução de bicarbonato de sódio pode ser usada para lavar totalmente a camada de muco. No entanto, para infecção viral em experimentos de cocultura, a camada de muco é retida, e apenas o excesso de muco é removido com lavagem dPBS. Esta retenção é para imitar a camada fisiológica do muco presente na epitélia nasal que vai interagir com a infecção viral que se entrada.

3. Medição da resistência elétrica transeptelial (TEER)

NOTA: A confirmação da integridade epitelial é importante para garantir que uma camada epitelial intacta e saudável seja obtida. Uma camada epitelial intacta é determinada através da medição teer realizada em 4 poços aleatórios usando um voltohmômetro.

1. Enxágüe o eletrodo com 70% de etanol e esterilize-o com luz ultravioleta por 15 minutos antes de usar para garantir a esterilidade. Enxágüe com 1x dPBS após a esterilização.
2. Adicione 100 μL (para 24-bem) ou 300 μL (para 12-bem) de 1x dPBS à câmara apical da inserção da membrana. Incubar a placa a 37 °C por 10 min; em seguida, remova o dPBS.
3. Para cada poço a ser medido, prepare um bem nãoutilado com 1 mL (para 24-bem) ou 3 mL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-equipado (a 37 °C). Coloque a inserção de membrana no poço preparado e adicione 200 μL (para 24-bem) ou 600 μL (para 12-bem) de meio de diferenciação pré-armado à câmara apical. Equilibre a 37 °C (sujeito à temperatura de incubação do tipo de vírus adicionado, por exemplo, 35 °C para Influenza) por 15 min.
   NOTA: Prepare um branco (inserção de membrana vazia) da mesma forma para o cálculo do TEER.
4. Equilibre um tubo de 15 mL de meio de diferenciação pré-armado na mesma temperatura por 15 min também. Coloque os eletrodos no tubo de 15 mL e ligue o voltohmômetro.
   NOTA: Neste ponto, a leitura deve ser de 0 resistência, pois os eletrodos estão no mesmo meio. Se alguma outra leitura for obtida, equilibre o eletrodo no tubo de 15 mL até que a leitura seja 0.
5. A partir do espaço em branco, posicione os eletrodos em cada poço de tal forma que um eletrodo esteja submerso no meio da câmara apical e o outro no meio da câmara basal. Registo a leitura somente quando uma leitura constante é obtida por um período de pelo menos 5 minutos.
6. Após cada medição, lave o eletrodo com PBS antes da próxima medição. Para cada poço testado, faça medições para três amostras em diferentes posições da membrana. Para calcular o TEER líquido de cada amostra, subtraia a resistência de fundo, dada pela inserção da membrana em branco, a partir de cada medição.
7. Calcule a leitura total do TEER para um poço usando a seguinte equação:
   Integridade Epitelial (Ωcm²) = Net TEER(ohms) × Área da membrana (cm²)
   NOTA: Os valores teer de hNECs para experimentos de infecção viral devem ser >1000 Ωcm² 13,15,16. 

4. Isolamento de monócitos sanguíneos periféricos e células NK

NOTA: As amostras de sangue devem ser obtidas de voluntários saudáveis e usadas no mesmo dia do isolamento.

1. Coletar 30-40 mL de sangue inteiro de cada doador em tubos de coleta de sangue de 10 mL.
2. Isole os PBMCs usando centrifugação de gradiente de densidade e obtenha PBMCs da camada buffy após os passos seguintes (veja também a Tabela de Materiais).
   1. Misture completamente ~10 mL de sangue do tubo de coleta de sangue em um vacutainer antes de diluir com um volume igual de solução de sal balanceada (PBS).
   2. Adicione 15 mL de gradiente de densidade médio à base de um tubo de 50 mL.
      NOTA: A razão entre o gradiente de densidade e o sangue diluído devem ser de 2:3-3.5.
   3. Camada 35 mL de sangue diluído no meio gradiente de densidade com uma pistola pipeta (com a configuração de dispensa definida para o mais baixo possível) inclinando o tubo em 45° e permitindo que o sangue diluído caia de forma gota na parede interna do tubo para que a camada de gradiente de densidade não seja perturbada.
   4. Centrifugar lysate a 500 × g, 18-20 °C por 30 min (freio: desligado). Remova e descarte cuidadosamente a camada de plasma superior sem perturbar a camada inferior.
   5. Transfira a camada de buffy para um novo tubo sem misturar a camada de glóbulos vermelhos, a camada média de densidade gradiente ou a camada buffy. Uma vez que o casaco buffy tenha sido coletado em um novo tubo de 50 mL, cubra o volume para 50 mL com 1x PBS.
   6. Centrifugar lysate a 800 × g, 18-20 °C, 8 min (freio: desligado) e remover o sobrenatante com uma arma de pipeta. Resuspenque a pelota celular com 50 mL de 1x PBS, e centrífuga a 120 × g, 18-20 °C, 10 min para remover plaquetas.
   7. Descarte o supernatante por pipetação, sem perturbar a pelota celular.
      NOTA: Como a pelota de célula pode estar solta, é desaconselhável descartar o supernatante derramando.
   8. Resuspend a pelota celular com meio RPMI completo (Roswell Park Memorial Institute). Realize uma contagem celular adicionando 10 μL de ácido acético de 3% com azul de metileno a 10 μL da suspensão celular resuspended. Misture bem e adicione 10 μL da mistura a um hemótmetro para contar as células.
3. PBMCs diluídos com meio RPMI completo a uma densidade de 2 × 10⁶/mL (para 24-bem) ou 4 × 10⁶/mL (para 12-bem).

5. hNEC Infecção viral e transição para hNEC:PBMC co-cultura

NOTA: H3N2 (A/Aichi/2/1968) é usado como a cepa representativa da infecção neste protocolo. A multiplicidade de infecção (MOI) de 0.1 é utilizada como moi representativa neste protocolo.

1. Dia 0 (Infecção de hNECs)
   NOTA: Um poço dos hNECs cultivados a partir do mesmo doador é usado para obter uma contagem de células representativa para cada bem utilizado no experimento.
   1. No bem representativo, adicione 150 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara apical da inserção da membrana e 350 μL de 1x trypsin-EDTA à câmara basal, e incubar a 37 °C por 10 minutos, ou até que as células se desprendem da membrana.
   2. Lave as células na membrana tubondo para cima e para baixo, e colete a suspensão em um tubo de centrífuga de 1,5 mL. Adicione 200 μL de DMEM completo para saciar a atividade de trypsin. Conte células através de coloração azul trypan para obter a contagem de células por poço.
   3. Calcule o MOI necessário do vírus com base na contagem de células por poço, e dilua o estoque do vírus de acordo com o RPMI completo no gelo.
      NOTA: MOI 0.1 de 1,26 × 10⁶ hNECs por poço = 1,26 × 10⁵ H3N2 partículas virais por poço em 30 μL (para 24-well)/100 μL (para 12-bem)
   4. Para os demais poços para o experimento de infecção, adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS nas câmaras apical das pastilhas de membrana, incubar a 37 °C por 10 minutos e remover o 1x dPBS.
   5. Altere o meio basal nas pastilhas de membrana para completar o meio RPMI transferindo as pastilhas para uma nova placa com RPMI completo adicionado aos poços (350 μL (para 24-bem)/700 μL (para 12-bem)).
      NOTA: Quando os hNESPCs têm totalmente diferenciado para os hNECs, eles são tolerantes/permissivos a diferentes mídias por até 72 h, sem alterações na morfologia ou organização quando o meio é trocado para RPMI¹². O RPMI é usado para apoiar o crescimento e manutenção da população do PBMC.
   6. Adicione o inóculo preparado de 30 μL (para 24-bem)/100 μL (para 12-bem) do inóculo do vírus na câmara apical da inserção da membrana, incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 1 h, e remover o inóculo viral da câmara apical.
   7. Mude o meio basal da inserção de membrana para meio RPMI completo fresco e incubar para 35 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% por 24 h.
2. Dia 1 (estabelecimento de hNECs + CO-cultura PBMCs)
   1. Semente o número necessário de PBMCs em 150 μL (para 24-well)/300 μL (para 12-bem) de meio RPMI completo adicionando diretamente a suspensão PBMC na câmara basal de cada poço de hNECs não infectados ou infectados a partir do dia 0 (1,5 × 10⁶ para placas de 24 poços e 3 × 10⁶ para placas de 12 poços). Incubar a 37 °C por 24/48 h.
      NOTA: O volume final na câmara basal após a criação da cocultura é de 500 μL (para 24-well)/1000 μL (para 12-well).
3. Dias 2-3 (colheita de PBMCs 48/72 h infecção pós-viral)
   1. Coleta de supernantes apical (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Adicione 50 μL (para 24-bem)/150 μL (para 12-bem) de 1x dPBS em cada câmara apical, e incubar a 37 °C por 10 min. Colete o 1x dPBS em tubos de 1,5 mL. Aliquot 25 μL (para 24-well)/50 μL (para 12-well) do supernasal para ensaio de placa em um novo tubo de 1,5 mL, e congele imediatamente tanto o estoque quanto as alíquotas a -80 °C.
   2. Coleta de RNA celular de hNECs (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Transfira a inserção da membrana para um poço limpo, adicione 300 μL (para 24-bem)/600 μL (para 12-bem) de tampão de RNA para a câmara apical e incubar na rtp por 5 min. Colete o supernante em um tubo de centrífuga de 1,5 mL e armazene-o a -80 °C até a extração de RNA para análise molecular.
   3. Colheita de PBMCs (infecção pós-viral de 48/72 h)
      1. Com a base ampla de uma ponta de pipeta estéril, raspe suavemente a superfície do poço para desalojar os PBMCs ativados que podem ser aderentes à superfície do poço. Colete o meio basal contendo PBMCs em um tubo de centrífuga de 2 mL.
      2. Lave os poços 2x com 300 μL de 1x dPBS, e colete a lavagem no mesmo tubo de 2 mL. Centrifugar o tubo de 2 mL (500 × g, 5 min, rtp), e coletar o supernatante em um tubo fresco de 2 mL sem perturbar a pelota celular. Armazene o supernatante a -80 °C para análise de citocina e quimioterapia; resuspensar a pelota de célula em 200 μL de 1x dPBS.

6. Citometria de fluxo

NOTA: Esta seção do protocolo é continuada diretamente da seção anterior usando a suspensão da célula PBMC da etapa 5.3.3.2. Certifique-se de exposição mínima à luz durante as seguintes etapas nesta seção. Um painel de amostra de marcadores de coloração de superfície pode ser encontrado na Tabela 2.

1. Coloração de superfície
   1. Transfira a cápsula de célula PBMC resuspended para uma placa de fundo de 96 V. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e remover o sobrenante.
   2. Incubar todos os PBMCs (exceto os "não manchados") com 100 μL de uma mancha de viabilidade por 15 min no rtp. Cubra até 200 μL com 150 μL de buffer MACS (Magnetic-Activated Cell Sorting, classificação celular ativada magnética). Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o sobrenante.
   3. Prepare um painel de anticorpos de coloração superficial de interesse com razões de diluição apropriadas e um volume final de 50 μL por reação (retoco com tampão MACS para obter o volume final). Realize a coloração da superfície adicionando 50 μL da mistura de anticorpos preparados às células usando uma pipeta multicanal. Incubar a 4 °C por 15 min no escuro.
   4. Lave adicionando 150 μL de buffer MACS. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min, e descartar o supernasce. Se não for necessária a coloração intracelular, proceda diretamente à incubação de 15 min na etapa 6.3.
2. Coloração intracelular (se necessário)
   1. Adicione 100 μL de uma solução de fixação e permeabilização a cada poço. Incubar a 4 °C por 20 min no escuro. Cubra os poços com 100 μL de 1x tampão MACS.
   2. Centrífuga (800 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenante. Repita a lavagem adicionando 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização. Centrífuga (500 × g, 3 min, 25 °C), e remova o sobrenatante.
   3. Prepare as diluições para o painel de anticorpos de interesse para obter um volume final de 50 μL usando 1x tampão de lavagem de permeabilização. Incubar no gelo por 30 minutos no escuro. Adicione 200 μL de 1x tampão de lavagem de permeabilização.
   4. Centrifugar as células (800 × g, 3 min, 4 °C) e remover o sobrenante. Resuspenque as células em 100 μL de tampão de classificação celular ativado pela fluorescência.
3. Pipette 200 μL de uma solução de lise em cada poço. Incubar por 15 min na RTP. Centrifugar lysate a 800 × g por 3 min e descartar o sobrenante.
4. Resuspense as pelotas de célula em 200 μL de buffer MACS. Realize a citometria de fluxo de acordo com as configurações descritas anteriormente¹³, ou armazene a 4 °C no escuro.

7. Determinação dos níveis de citocina e quimiocina

1. Processe 25 μL do supernasciente da câmara basal usando um ensaio multiplex de imunologia de acordo com o protocolo¹⁸ do fabricante.
2. Calcule a concentração de cada analito usando o software multiplex manager utilizando um algoritmo de ajuste de curva (5 parâmetros) para a curva padrão.

8. Avaliação da contaminação viral

1. Extrair RNA viral utilizando um kit de extração em 4 conjuntos de soluções: a solução de estoque H3N2, a diluição MOI 0.1 para infecção, as diluições seriais de 10x do MOI 0.1 e o meio basal das amostras (48 e 72 h pós-infecção viral)¹².
2. Selecione gene não estrutural (NS1) e matriz (M1) como alvos para reação em cadeia de polimerase (PCR) (ver a Tabela de Materiais para primers usados no experimento representativo).
3. Realize a transcrição reversa-PCR (RT-PCR) (42 °C, 60 min) para converter o RNA viral em cDNA antes de realizar pcr quantitativo (qPCR) para medir os níveis NS1 e M1 como um proxy para presença viral, e correlacionar os níveis à curva padrão obtida da RT-qPCR realizada na diluição serial de 10x do MOI 0.1 alit. Consulte a Tabela 3 para a composição das misturas de reação e utilize as seguintes condições: pré-insubtação a 95 °C por 10 min, seguida de amplificação de 3 etapas para 40 ciclos: 95 °C para 10 s, 60 °C para 10 s, 72 °C para 30 s; curva de fusão: 95 °C para 10 s, 65°C para 60 s e 97°C para 1 s.

9. Ensaio de placa

1. Dia 0: semeadura MDCK (Madin Darby Canine Kidney) em placas de 24 poços
   1. Remova o meio de um frasco T75 de células MDCK confluentes. Lave 2x com 1x PBS para remover todos os traços de soro. Trypsinize as células MDCK adicionando 10 mL de trippsina e incubando a 37 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 20-30 min até que as células se desprendem.
      NOTA: Não toque no frasco, pois isso pode resultar em aglomeração.
   2. Pipete a suspensão da célula em um tubo de 15 mL contendo 2 mL de Meio Essencial Mínimo (EMEM) completo da Eagle. Centrífuga (300 × g, 5 min, rtp), e remova o supernante.
   3. Resuspende as células em 6 mL de EMEM completo. Conte as células por manchas azuis.
   4. Diluir a suspensão da célula MDCK a uma concentração de 1 × 10⁵ células/mL, e sementes 1 mL da suspensão diluída em cada poço de uma placa estéril de 24 poços. Incubar a 37 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% por 24 horas para obter uma monocamada confluente de células MDCK em cada poço.
2. Dia 1: infecção de células MDCK
   1. Prepare o meio de infecção. Retire o meio da monocamhada MDCK na placa de 24 poços e lave 2x com 1x dPBS. Para a segunda lavagem, deixe o PBS nos poços enquanto prepara diluições seriais do vírus.
   2. Descongele as amostras do vírus no gelo, e dilui-as em série em uma placa de 24 poços para obter diluições seriais de ^10-1 a ^10-6.
      NOTA: Como exemplo, encha cada poço em uma placa de 24 poços com 270 μL de meio de infecção.
   3. Adicione 30 μL da amostra do vírus ao primeiro poço da linha. Com uma nova ponta de pipeta, misture bem e transfira para o próximo poço na linha para diluir a amostra em 10x. A continuação até ^10-6 diluição foi alcançada; realizar etapas 9.2.1-9.2.3 para todas as amostras de vírus.
   4. Remova o PBS da placa MDCK e infecte em duplicata com 100 μL das diluições virais preparadas. Para poços de controle, adicione 100 μL do meio de infecção (sem a amostra viral). Incubar a 35 °C em uma atmosfera de 5% de CO₂ por 1h, agitando a placa para eliminar manchas secas a cada 15 minutos.
   5. Remova o inóculo viral e adicione 1 mL de sobreposição líquida para cada poço. Incubar a 35 °C em uma atmosfera de CO₂ de 5% por 72 h.
3. Dia 4 (72 h pós-infecção): visualização de placa
   1. Remova a sobreposição líquida e fixe as células com 4% de formaldeído em 1x PBS por 1h. Remova a solução de formaldeído e lave uma vez com 1x PBS ou água destilada.
   2. Manche as células fixas adicionando 1% de solução violeta cristalina por 15 minutos. Remova o corante violeta cristalino e lave as células com água corrente. Seque a placa na rtp.
   3. Uma vez seco, conte placas e calcule o título viral de acordo com a seguinte fórmula:
      Número de placas × Fator de Diluição = Número de Placa - Unidades de Formação em 100 μL

Resultados

Embora as células T convencionais formem o principal repertório de resposta imune adaptativa contra infecção viral para facilitar o despejo viral, a população de células T inatas trabalha em um espectro mais amplo para suprimir a carga viral para liberação eficaz em um estágio posterior. Portanto, este protocolo cria especificamente uma condição robusta para estudar células T inatas, sua ativação e sua população funcional após a infecção por gripe, sem precisar de amos...

Discussão

As respostas imunológicas inatas contra vírus são um campo de estudo pouco investigado no manejo antiviral. As células epiteliais das vias aéreas e as células imunes inatas trabalham em conjunto para suprimir a replicação viral durante uma infecção, além de servir como determinante de resposta adaptativa hiperativa se a carga viral não for mantida em xeque 12,13,17. No entanto, o desenvolvimento de um modelo humano r...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Trypsin-EDTA	Gibco	15400-054
0.5 M Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), pH 8.0, RNase-free	Thermofisher	AM9260G	0.5M EDTA
1.5 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120086	1.5mL Centrifuge Tube
10 mL K3EDTA Vacutainer Tubes	BD	366643	10mL Blood Collection Tubes
10x dPBS	Gibco	14200-075
10x PBS	Vivantis	PC0711
12-well Plate	Corning	3513
12-well Transwell Insert	Corning	3460	membrane insert
1x FACS Lysing Solution	BD	349202
2.0 mL SafeLock Tubes	Eppendorf	0030120094	2 mL centrifuge tube
24-well Plate	Corning	3524
24-well Transwell Insert	Corning	3470
3% Acetic Acid with Methylene Blue	STEMCELL Technologies	07060
3,3',5-triiodo-l-thyronine	Sigma	T-074
37% Formaldehyde Solution w 15% Methanol as Stabilizer in H2O	Sigma	533998
5810R Centrifuge	Eppendorf	5811000320
5 mL polypropylene tubes (flow tubes)	BD	352058
70 µm Cell Strainer	Corning	431751
A-4-62 Rotor	Eppendorf	5810709008
Accutase	Gibco	A1110501	Cell Dissociation Reagent
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062
Avicel CL-611	FMC Biopolymer	NA	Liquid Overlay
Bio-Plex Manager 6.2 Standard Software	Bio-Rad Laboratories, Inc	171STND01	Multiplex Manager Software
Butterfly Needle 21 G	BD	367287
Cholera Toxin	Sigma	C8052
Crystal Violet	Merck	C6158
Cytofix/Cytoperm Solution	BD	554722	Fixation and Permeabilization Solution
Dispase II	Sigma	D4693	Neutral Protease
DMEM/High Glucose	GE Healthcare Life Sciences	SH30243.01
DMEM/Nutrient Mixture F-12	Gibco-Invitrogen	11320033
dNTP Mix	Promega	U1515	dNTP Mix
EMEM (w L-Glutamine)	ATCC	30-2003
EVOM voltohmmeter device	WPI, Sarasota, FL, USA	300523
FACS Lysing Solution	BD	349202	1x Lysing Solution
Falcon tube 15 mL	CellStar	188271	15 mL tube
Falcon tube 50 mL	CellStar	227261	50 mL Tube
Fast Start Essential DNA Probes Master	Roche	6402682001	qPCR Master Mix
Ficoll Paque Premium	Research Instruments	17544203	Density Gradient Media
H3N2 (A/Aichi/2/1968)	ATCC	VR547
H3N2 M1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ATGGTTCTGGCCAGCACTAC-3'
H3N2 M1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- ATCTGCACCCCCATTCGTTT-3'
H3N2 NS1 Forward Primer Sequence	Sigma	5'- ACCCGTGTTGGAAAGCAGAT-3'
H3N2 NS1 Reverse Primer Sequence	Sigma	5'- CCTCTTCGGTGAAAGCCCTT-3'
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum	Gibco	10500-064
hNESPCs	Human Donors	NA
Human Epithelial Growth Factor	Gibco-Invitrogen	PHG0314
Hydrocortisone	STEMCELL Techonologies	7925	Collected from nasal biopsies during septal deviation surgeries
Insulin	Sigma	I3536
Lightcycler 96	Roche	5815916001	qPCR Instrument
Live/DEAD Blue Cell Stain Kit *for UV Excitation	Thermofisher	L23105	Viability Stain
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel II - Premixed 23 Plex	Merck Pte Ltd	HCP2MAG-62K-PX23	Immunology Multiplex Assay
Mitomycin C	Sigma	M4287
M-MLV 5x Buffer	Promega	M1705	RT-PCR 5x Buffer
M-MLV Reverse Transcriptase	Promega	M1706	Reverse Transcriptase
N-2 supplement	Gibco-Invitrogen	17502-048
NIH/3T3	ATCC	CRL1658
Perm/Wash Buffer	BD	554723	Permeabilization Wash Buffer
PneumaCult-ALI 10x Supplement	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Basal Medium	STEMCELL Techonologies	5001
PneumaCult-ALI Maintenance Supplement (100x)	STEMCELL Techonologies	5001
Random Primers	Promega	C1181	Random Primers
Recombinant Rnasin Rnase Inhibitor	Promega	N2511	RNase Inhibitor
RNA Lysis Buffer	Qiagen	Part of 52904
RPMI 1640 (w L-Glutamine)	ATCC	30-2001
STX2 electrodes	WPI, Sarasota, FL, USA	STX2	Electrode
T25 Flask	Corning	430639
T75 Flask	Corning	430641U
TPCK Trypsin	Sigma	T1426
Trypan Blue	Hyclone	SV30084.01
Viral RNA Extraction Kit	Qiagen	52904	Viral RNA Extraction Kit
V-Shaped 96-well Plate	Corning	3894