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Resumo

Aqui, descrevemos protocolos usando sensores lipídicos fluorescentes e lipossomos para determinar se uma proteína extrai e transporta fosfatidylserina ou fosfattidylinositol 4-fosfato in vitro.

Resumo

Vários membros da família de proteínas relacionadas ao oxisterol (OSBP) (ORP)/OSBP (Osh) foram recentemente encontrados para representar um novo grupo de proteínas de transferência de lipídios (LTP) em leveduras e células humanas. Eles transferem fosfaticidalserina (PS) do ânticulo endoplasmático (ER) para a membrana plasmática (PM) via ciclos de troca PS/fosfartidylinositol 4-fosfato (PI(4)P). Esse achado permite uma melhor compreensão de como o PS, que é fundamental para os processos de sinalização, é distribuído por toda a célula e a investigação da ligação entre esse processo e o metabolismo de fosforinostito (PIP). O desenvolvimento de novos protocolos baseados em fluorescência tem sido fundamental na descoberta e caracterização deste novo mecanismo celular in vitro a nível molecular. Este artigo descreve a produção e o uso de dois sensores lipídicos fluorescentes rotulados, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,para medir a capacidade de uma proteína de extrair PS ou PI(4)P e transferir esses lipídios entre membranas artificiais. Primeiro, o protocolo descreve como produzir, rotular e obter amostras de alta pureza desses dois construtos. Em segundo lugar, este artigo explica como usar esses sensores com um leitor de microplaca de fluorescência para determinar se uma proteína pode extrair PS ou PI(4)P de lipossomos, usando Osh6p como estudo de caso. Finalmente, este protocolo mostra como medir com precisão a cinética do PS/PI(4)P troca entre lipossomos de composição lipídica definida e determinar taxas de transferência lipídica por transferência de energia de ressonância fluorescência (FRET) usando um fluorômetro padrão.

Introdução

A distribuição precisa de lipídios entre diferentes membranas e dentro das membranas das células eucarióticas1,2 tem profundas implicações biológicas. Descriptografar como as LTPs funcionam é uma questão importante na biologia celular3,4,5,6, e abordagens in vitro são de grande valor para abordar esta questão7,8,9,10,11. Aqui, é apresentada uma estratégia in vitro,baseada em fluorescência, que tem sido fundamental para estabelecer que várias proteínas ORP/Osh afetam a troca de PS/PI(4)P entre as membranas celulares12 e, assim, constituem uma nova classe de LTPs. PS é um glicerofosfolipídio aniônico que representa 2-10% do total de lipídios de membrana em células eucarióticas13,14,16. É distribuído ao longo de um gradiente entre o PS e o PM, onde representa 5-7% e até 30% dos glicerofosfolipídios,respectivamente 17,18,19. Além disso, ps está essencialmente concentrado no folheto citosolico do PM. Esse acúmulo e a partição desigual do PS no PM são fundamentais para os processos de sinalização celular19. Devido à carga negativa das moléculas de PS, o folheto citosolico da PM é muito mais aniônico do que o folheto citosolico de outras organelas1,2,19,20. Isso permite o recrutamento, através de forças eletrostáticas, de proteínas de sinalização como o substrato C-kinase rico em mirina-de-mirina (MARCKS)21, sarcoma (Src)22, o sarcoma viral de ratos kirsten (K-Ras)23, e o substrato de toxina botulínica C3 1 (Rac1)24 que contêm um trecho de aminoágenos carregados positivamente e uma cauda lipidica.

PS também é reconhecido pela proteína convencional quinase C de forma estereoselétrica através de um domínio C225. No entanto, o PS é sintetizado no ER26,indicando que deve ser exportado para a PM antes de poder desempenhar seu papel. Não se sabia como isso foi realizado19 até a constatação de que, em leveduras, Osh6p e Osh7p transferem PS do PS do PS para a PM27. Estes LTPs pertencem a uma família evolutivamente conservada em eucariotes cujo membro fundador é OSBP e que contém proteínas (ORPs em humanos, proteínas Osh na levedura) integrando um domínio relacionado à OSBP (ORD) com um bolso para hospedar uma molécula lipídica. Osh6p e Osh7p consistem apenas em um ORD cujas características estruturais são adaptadas para ligar especificamente PS e transferi-lo entre membranas. No entanto, não ficou claro como essas proteínas transferiam o PS do PS para o PS. Osh6p e Osh7p podem prender PI(4)P como um ligante lipídemo alternativo12. Na levedura, PI(4)P é sintetizado a partir de fosfaticdylinositol (PI) no Golgi e pm por PI 4-kinases, Pik1p e Stt4p, respectivamente. Em contraste, não há PI(4)P na membrana ER, pois este lipídio é hidrolisado para PI pela fosfattase Sac1p. Assim, existe um gradiente PI(4)P nas interfaces ER/Golgi e ER/PM. Osh6p e Osh7p transferem PS do PS para o PM via ciclos de troca PS/PI(4)P utilizando o gradiente PI(4)P que existe entre essas duas membranas12.

Dentro de um ciclo, Osh6p extrai PS do ER, troca PS por PI(4)P na PM e transfere PI(4)P de volta para o PS para extrair outra molécula de PS. Osh6p/Osh7p interagem com Ist2p28, uma das poucas proteínas que conectam e trazem a membrana ER e o PM em proximidade entre si para criar locais de contato ER-PM na levedura29,30,31. Além disso, a associação de Osh6p com membranas negativamente carregadas torna-se fraca assim que a proteína extrai um de seus ligantes lipídicos devido a uma mudança conformacional que modifica suas características eletrostáticas32. Isso ajuda a Osh6p encurtando seu tempo de vida na membrana, mantendo assim a eficiência de sua atividade de transferência lipídica. Combinado com a vinculação ao Ist2p, este mecanismo poderia permitir que os Osh6p/7p executasse de forma rápida e precisa a troca lipídica na interface ER/PM. Nas células humanas, as proteínas ORP5 e ORP8 executam a troca de PS/PI(4)P nos locais de contato do ER-PM através de mecanismos distintos33. Eles possuem um ORD central, semelhante a Osh6p, mas são diretamente ancorados ao P através de um terminal C transmembrano segmento33 e atracam na PM através de um domínio de Pleckstrinia N-terminal (PH) que reconhece PI(4)P e PI(4,5)P233,34,35. Orp5/8 use pi(4)P para transferir PS, e foi demonstrado que orp5/8 regula adicionalmente os níveis PM PI(4,5)P2 e, presumivelmente, modulando vias de sinalização. Por sua vez, a diminuição dos níveis PI(4)P e PI(4,5)P2 reduz a atividade ORP5/ORP8, uma vez que essas proteínas associam-se ao PM de forma dependente de PIP. Síntese de PS anormalmente alta, que leva à síndrome de Lenz-Majewski, impacta os níveis de PI(4)P através de ORP5/836. Quando a atividade de ambas as proteínas é bloqueada, o PS torna-se menos abundante na PM, diminuindo a capacidade oncogênica de sinalização de proteínas37.

Por outro lado, a superexpressão orp5 parece promover a invasão de células cancerosas e processos metastáticos38. Assim, alterações na atividade ORP5/8 podem modificar severamente o comportamento celular através de alterações na homeostase lipídica. Além disso, ORP5 e ORP8 ocupam locais de contato ER-mitocôndrias e preservam algumas funções mitocondriais, possivelmente fornecendo PS39. Além disso, o ORP5 localiza os locais de contato com gotículas ER-lipídidas para fornecer PS a gotículas lipídicas por PS/PI(4)P troca40. A estratégia aqui descrita para medir (i) PS e PI(4)P extração de lipossomos e (ii) PS e PI(4)P transporte entre lipossomos foi concebida para estabelecer e analisar o PS/PI(4)P atividade de troca de Osh6p/Osh7p12,32 e usado por outros grupos para analisar a atividade de ORP5/ORP835 e outras LTPs10, 41. Baseia-se no uso de um leitor de placas de fluorescência, um espectrofluorômetro padrão em formato L e dois sensores fluorescentes, NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP,que podem detectar PS e PI(4)P, respectivamente.

O NBD-C2Lact corresponde ao domínio C2 da glicoproteína, lactadherina, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a solventes única perto do suposto local de ligação PS; um NBD sensível à polaridade (7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol) fluoróforo está covalentemente ligado a este resíduo(Figura 1A)12. Para ser mais preciso, o domínio C2 de lactadherina (Bos taurus, UniProt: Q95114,resíduos 270-427) foi clonado em um vetor pGEX-4T3 para ser expresso em fusão com glutathione S-transferase (GST) em Escherichia coli. coli . A sequência de C2Lact foi então mutada para substituir dois resíduos de cisteína acessíveis a solventes (C270, C427) com resíduos de alanina e para introduzir um resíduo de cisteína em uma região próxima ao local putativo de ligação PS (mutação H352C) que pode ser posteriormente rotulado com N,N'-dimethyl-N-(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl) diamina de etileno (IANBD) 12. Um local de decote para trombina está presente entre a proteína GST e o N-terminus do domínio C2. Uma grande vantagem é que este domínio reconhece seletivamente o PS de forma independente de Ca2+contrária a outros domínios C2 conhecidos ou anexo a A542. OFAPP NBD-PH é derivado do domínio PH da proteína 1 (FAPP1) humana de quatro fosfatos, que foi reprojetada para incluir uma cisteína exposta a um único solvente que pode ser rotulada com um grupo NBD próximo ao local de ligação PI(4)P(Figura 1A)43. A sequência nucleotídea do domínio PH da proteína FAPP humana (UniProt: Q9HB20, segmento [1-100]) foi clonada em um vetor pGEX-4T3 para ser expressa em conjunto com uma tag GST. A sequênciaPH FAPP foi modificada para inserir um resíduo único de cisteína dentro da interface de ligação de membrana da proteína43. Além disso, um linker de nove resíduos foi introduzido entre o local de decote trombina e o n-terminus do domínio PH para garantir a acessibilidade à protease.

Para medir a extração de PS de lipossomos, NBD-C2Lact é misturado com lipossomos feitos de fosfattidylcholina (PC) contendo traços de PS. Devido à sua afinidade com ps, esta construção se liga aos lipossomos, e o fluorophore NBD experimenta uma mudança na polaridade à medida que entra em contato com o ambiente hidrofóbico da membrana, que provoca uma mudança azul e um aumento da fluorescência. Se o PS for extraído quase completamente por uma quantidade estequiométrica de LTP, a sonda não se associa a lipossomos, e o sinal NBD é menor(Figura 1B)32. Essa diferença de sinal é usada para determinar se um LTP(por exemplo, Osh6p) extrai PS. Uma estratégia semelhante é usada com oFAPP NBD-PH para medir a extração PI(4)P (Figura 1B),conforme descrito anteriormente12,32. Dois ensaios baseados em FRET foram projetados para (i) medir o transporte de PS de lipossomos LA a LB, que imitam a membrana ER e a PM, respectivamente, e (ii) pi(4)P transporte na direção inversa. Estes ensaios são realizados sob as mesmas condições (ou seja, mesmo buffer, temperatura e concentração lipídica) para medir a troca de PS/PI(4)P. Para medir o transporte de PS, o NBD-C2Lact é misturado com lipossomos LA compostos por PC e dopados com 5 PS mol% e 2% de uma fosfatidetanolamina fluorescente rotulada por rhodamina (Rhod-PE)-e lipossomos LB incorporando 5 mol% PI(4)P.

No tempo zero, FRET com Rhod-PE sacia a fluorescência NBD. Se o PS for transportado de lipossomos LA para LB (por exemplo, ao injetar Osh6p), um descosmamento rápido ocorre devido à translocação de moléculas deLact NBD-C2 de lipossomos LA para LB (Figura 1C). Dada a quantidade de PS acessível, o NBD-C2Lact permanece essencialmente em um estado ligado à membrana ao longo do experimento12. Assim, a intensidade do sinal NBD se correlaciona diretamente com a distribuição de NBD-C2Lact entre lipossomos LA e LB e pode ser facilmente normalizada para determinar quanto PS é transferido. Para medir a transferência de PI(4)P na direção oposta, oFAPP NBD-PH é misturado com lipossomos LA e LB; dado que ele se liga apenas a lipossomos LB que contêm PI(4)P, mas não Rhod-PE, sua fluorescência é alta. Se pi(4)P for transferido para lipossomos LA, ele se transloca para esses lipossomos, e o sinal diminui devido ao FRET com Rhod-PE(Figura 1C). O sinal é normalizado para determinar quanto PI(4)P é transferido43.

Protocolo

1. Purificação de NBD-C2Lact

NOTA: Embora este protocolo detalhe o uso de um disruptor celular para quebrar bactérias, ele pode ser modificado para usar outras estratégias de lise(por exemplo, uma prensa francesa). No início da purificação, é obrigatório o uso de tampão recém-desgaseado, filtrado e suplementado com dithiothiothreitol de 2 mM (DTT) para evitar a oxidação da cisteína. No entanto, para a etapa de rotulagem de proteínas, é crucial remover completamente o DTT. Muitas etapas devem ser realizadas no gelo ou em uma sala fria para evitar qualquer degradação proteica. Amostras de volume de 30 μL devem ser coletadas em diferentes etapas do protocolo para realizar uma análise por eletroforese de gel de sódio dodecylsulfate-poliacrilamida (SDS-PAGE) utilizando um gel de acrilamida de 15% para verificar o progresso da purificação. Misture o tampão de amostra laemmli suficiente com cada alíquota e aqueça a mistura a 95 °C. Congele e armazene os tubos a -20 °C até a análise.

  1. Expressão de GST-C2Lact em Escherichia coli
    1. Misture 20 μL de células competentes BL21 Gold com 18 μL de água esterilizada. Em seguida, misture 2 μL de plasmídeo delact pGEX-C2 (a ~65 ng/μL) com as bactérias, e transforme-as por eletroporação. Resuspenque as bactérias com 150 μL de meio autoclavado Lennox Lysogeny-Broth (LB) (10 g/L tryptone, 5 g/L extrato de levedura, 5 g/L NaCl em água deionizada, livre de glicose). Deixe as bactérias crescerem a 37 °C por 1 h em um tubo de microcentrifus de tampa de estalo de 2 mL.
    2. Inoculação de 25 mL de meio LB, suplementada com 50 μg/mL ampicillin, com 150 μL de suspensão bacteriana em um frasco erlenmeyer estéril de 125 mL. Coloque o frasco em um agitador orbital a 37 °C, e deixe as bactérias crescerem durante a noite com agitação a 185 rpm.
    3. Encha dois frascos estéreis 2 L Erlenmeyer com 500 mL de meio LB suplementados com 50 μg/mL ampicillin, e adicione 5 mL de suspensão pré-cultura. Deixe as bactérias crescerem a 37 °C com agitação a 220 rpm.
    4. Meça periodicamente a densidade óptica (OD) da suspensão em um comprimento de onda (λ) de 600 nm. Quando o OD atingir um valor de ~0,6-0,7, adicione 500 μL de uma solução de estoque de 1 M isopropílico β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) a cada frasco para iniciar a expressão de GST-C2Lact. Agite os frascos a 185 rpm por 4 h a 37 °C.
    5. Transfira o conteúdo de cada frasco para uma garrafa centrífuga de polipropileno. Centrifugar as duas garrafas por 30 min a 4600 × g a 4 °C para pelotar as bactérias. Descarte o supernasciente e resuspenque cada pelota em 50 mL de soro fisiológico tamponado a frio.
    6. Transfira a suspensão bacteriana contida em cada garrafa para um tubo de centrífuga cônica de 50 mL. Centrifugar os dois tubos por 30 min a 2300 × g a 4 °C. Remova o supernatante e armazene os tubos, cada um deles contém uma pelota bacteriana, a -20 °C.
  2. Purificação de C2Lact
    1. No gelo, encha dois tubos centrífugos cônicos de 50 mL com 50 mL de tampão contendo 50 mM Tris-HCl, pH 7.4 e 150 mM NaCl (doravante chamado tampão TN), previamente filtrado e desgaseado pela filtração de vácuo de membrana.
    2. Para preparar o tampão de lise em cada tubo, dissolva um comprimido de coquetel inibidor de protease livre de ácido etilenodiamina no tampão TN por sônica leve ou vórtice. Adicione outros antiprotesos(10 μM bestatin, 1 μg/mL pepstatin A e 10 μM phosphoramidon). É importante ressaltar que complemente o buffer com 2 mM DTT.
    3. Encha os dois tubos que contêm as pelotas bacterianas preparadas na etapa 1.1.6, com tampão de lise para obter um volume final de 30 mL em cada tubo, e descongele lentamente as pelotas no gelo por 10 minutos. Esmague cada pelota com uma espátula de aço inoxidável e resumê-las vórtice dos tubos e/ou por tubos da suspensão para frente e para trás com um controlador de pipeta e uma pipeta de 25 mL até que uma suspensão homogênea seja obtida.
    4. Realize a lise utilizando um disruptor de células pré-cozidos (ver a Tabela de Materiais) carregando 30 mL da amostra dentro do reservatório e executando um ciclo de ruptura no modo contínuo com uma pressão de 1,6 bar. Colete o lysate no mesmo tubo, mantenha o tubo no gelo e adicione imediatamente 250 μL de uma solução de estoque de 200 mM de flúor de fenilmetilsulfonyl de 200 mM (PMSF) preparado em isopropanol.
    5. Lyse a outra amostra seguindo o mesmo procedimento. Use o restante do tampão de lise para lavar o disruptor da célula e colete a lavagem para ajustar o volume de cada lise (~30 mL) a um volume final de 50 mL.
    6. Suplemente cada lise com 5 mM MgCl2e adicione 20 μg/mL de DNAse I para fragmentar o DNA e, assim, reduzir a viscosidade da amostra. Incubar no gelo por 30 minutos. Colete uma amostra para análise de gel.
    7. Transfira cada 50 mL para um tubo de ultracentrifutura de policarbonato pré-estímulo (dois no total, consulte a Tabela de Materiais). Centrifugar a 186.000 × g a 4 °C por pelo menos 1 h usando uma ultracentrifugação.
    8. Paralelamente à etapa de centrifugação, dispensar 1,4 mL de um chorume contendo glutationa acoplada a 4% de contas agarose em dois tubos centrífugos cônicos de 50 mL, adicionar 20 mL de tampão TN complementado com 1 mM DTT (tampão TND) em cada tubo, centrífugas a 1200 × g por 5 min e descartar o supernatante. Repita esta etapa de lavagem duas vezes.
    9. Após a centrifugação do linfante bacteriano, remova uma amostra de 30 μL do sobrenante e transfira o sobrenatante de cada tubo ultracentrífuga para um tubo de centrífuga conical correspondente de 50 mL que contém contas limpas. Para análise de gel, resuspengue a pelota de detritos em um dos tubos ultracentrífugas com 50 mL de tampão TND, e colete uma amostra de 30 μL.
    10. Coloque os tubos em um rotador por 3-4 h a 4 °C para obter uma suspensão homogênea de contas. Acumule as suspensões de contas em uma coluna de cromatografia vazia de 25 mL. Deixe as contas decantarem, e remova o tampão e proteínas desvinculadas pelo fluxo gravitacional. Pegue uma amostra do eluato para análise.
    11. Resuspenque as contas com 20 mL de tampão TND e colete o elunato pelo fluxo gravitacional. Repita esta etapa duas vezes para lavar completamente as contas. Acumule os eluatos coletados e retenha uma amostra de 30 μL para análise suplementar.
      NOTA: Após uma breve decantação, um volume de ~2 mL de suspensão de contas, ao qual GST-C2Lact está anexado, sedimentos na parte inferior da coluna.
    12. Adicione 1 mL de suspensão de contas a dois tubos de microcentrifuge de tampa de estalo de 2 mL. Encha cada tubo com tampão TND a um volume final de 1.970 mL. Pegue uma amostra de 30 μL de um tubo para análise posterior (amostra B1). Adicione 10 μL de solução CaCl2 de 10 mM e 25 μL de uma solução de estoque de solução de protease de trombina humana a 0,02 U/μL.
    13. Coloque os dois tubos em um rotador a 4 °C durante a noite para permitir que a trombina ceda a tag GST do domínio C2Lact. No dia seguinte, em cada tubo, misture 10 μL de solução PMSF de 200 mM com a suspensão de contas para inibir a ação da trombina.
    14. Centrifugar os tubos a 700 × g por 5 min, e coletar o supernante, que contém domínio solúvel de C2Lact, de cada tubo, sem tomar as contas. Acumule os supernantes em um tubo de microcentrifus de tampa de 2 mL (E1 eluado) que é mantido no gelo.
    15. Adicione 1 mL de tampão TND a cada tubo para resuspensar as contas e lavá-las; repetir o passo 1.2.14. Realize esta etapa três vezes mais para recuperar uma quantidade máxima de proteína. Cada vez, acumule os supernacantes coletados em um novo tubo de 2 mL (E2, E3, E4 e E5) e tome uma alíquota para análise posterior. No final das etapas de lavagem, tome uma alíquota da suspensão da conta (alíquota B2).
    16. Analise as 30 amostras de μL coletadas nas diferentes etapas do protocolo de purificação pela separação SDS-PAGE em um gel de acrilamida de 15%.
    17. Remova as contas contaminantes potenciais, juntando todas as supernacantas (ou seja,~10 mL) coletadas durante as etapas 1.2.14 e 1.2.15 em uma coluna de cromatografia de 10 mL. Colete o eluado pelo fluxo gravitacional e mantenha as contas na parte inferior da coluna.
    18. Concentre a amostra de C2Lact usando uma unidade de filtro centrífuga com um corte de peso molecular (MWCO) de 3 kDa e uma velocidade de centrifugação de 2300 × g. Pare o procedimento de concentração quando o volume da amostra de proteína é ~1 mL.
  3. Preparação e purificação do NBD-C2Lact
    1. Equilibre uma coluna de desalhado (ver a Tabela de Materiais) com tampão TN. Carregue a coluna com 1 mL de amostra concentrada de C2Lact. Permita que a amostra entre completamente no leito de gel, adicione 1,5 mL de tampão TN livre de DTT recém-desgaseado à coluna e colete o eluato por fluxo gravitacional em um tubo de microcentrifusagem de tampa de snap de 2 mL.
    2. Diluir 50 μL de elunato em um volume final de 300 μL TN buffer, e registrar um espectro de absorção de 230 a 450 nm usando tampão TN puro como um branco. Determinar a concentração de C2Lact com base na absorvância medida em 280 nm, considerando um coeficiente de extinção ε igual a 44.920 M-1.cm-1.
    3. Para rotular a construção de C2Lact com um fluoróforo NBD, misture a proteína com um excesso de molar de dez vezes de N,N'-dimetil-N(iodoacetyl)-N'-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)etilenodiamina (amida IANBD).
      1. Dissolver 1 mg de IANBD em dimetilaformamida anidro (DMF), tendo em mente que o volume final de DMF utilizado para rotular o construto C2Lact não deve exceder 5% (v/v) do volume da amostra de proteína.
      2. Para determinar o volume de DMF (VDMF) para dissolver o IANBD, primeiro calcule a quantidade necessária de IANBD (m, expressa em mg) para rotular a proteína usando a fórmula 1.
        m = 10.000 × C × V × MWIANBD (1)
        onde C é a concentração de C2Lact medida na etapa 1.3.2, V é o volume da amostra de C2Lact, e MWIANBD é o peso molecular do fluoróforo (420 g/mol).
      3. Calcule oV DMF usando as fórmulas 2 (com m0=1) e 3.
        VDMF= (m0/m) × VIANBD (2)
        VIANBD=0,05 × V (3)
        Onde m0 é a quantidade de pó IANBD em mg, e VIANBD é o volume de solução IANBD a ser adicionado à amostra C2Lact.
      4. Adicione o volume VIANBD da solução IANBD recém-preparada à amostra C2Lact e agite a mistura de reação a 800-900 rpm por 30 min a 25 °C usando um termomixer protegido contra a luz. Deixe a reação prosseguir por 90 minutos no gelo. Enquanto isso, limpe uma unidade de filtro centrífuga (MWCO= 3 kDa) com 10 mL de tampão TN.
    4. Adicione L-cisteína (em excesso molar de 10 vezes ao IANBD) à mistura de reação para inativar IANBD livre.
    5. Adicione 15 mL de tampão TN à solução NBD-C2Lact e transfira a solução NBD-C2Lact para a unidade do filtro centrífugo. Concentre a amostra em 2 mL para separar a maior parte do NBD livre da proteína por centrifugação a 2300 × g. Repita esta etapa de lavagem duas vezes. Centrifugar a amostra em um tubo de centrífuga de 2 mL por 10 minutos a 19.000 × g a 4 °C para pelotizar potenciais agregados, e coletar o supernatante.
    6. Diluir 50 μL de elunato em um volume final de 300 μL de tampão TN. Registo o espectro de absorvância de 230 a 650 nm utilizando o eluato coletado durante o procedimento de concentração como um branco. Determine a concentração deLact NBD-C2 utilizando a absorvância máxima em λ=280 e 495 nm e coeficientes de extinção ε= 44.920 M-1.cm-1 (proteína) e 25.000 M-1.cm-1 (nBD fluorophore).
      NOTA: Se os dois valores de concentração forem semelhantes, isso indica que a construção de C2Lact é rotulada em uma razão de 1:1 com o grupo NBD.
    7. Se a concentração deLact NBD-C2 estimada a partir da medição da absorvância de NBD exceder a concentração estimada a partir da absorção de resíduos de triptofano (Trp), repita o passo 1.3.5 para remover ainda mais o NBD livre.
    8. Adicione glicerol à amostra para obter uma concentração final de 10% (v/v) para proteger crio-proteger a construção deLact NBD-C2 durante o congelamento de flash. Meça a concentração final de proteínas.
    9. Prepare 50 alíquotas de proteína de 0,5 mL. Congele os tubos em nitrogênio líquido e armazene-os a -80 °C.

2. Purificação doFAPP NBD-PH

NOTA: O procedimento para produzir e rotular PHFAPP é idêntico ao do NBD-C2Lact até a transferência da solução NBD-C2Lact para uma unidade de filtro centrífugo na etapa 1.3.4. A partir deste passo em diante, siga o protocolo descrito abaixo.

  1. Após a etapa de concentração, mantenha 2 mL deFAPP NBD-PH a 4 °C no escuro por não mais de 1 dia antes de realizar cromatografia de exclusão de tamanho. Antes da cromatografia de exclusão de tamanho, verifique se não há depósito de laranja (agregação durante a concentração) na parte inferior do tubo. Se este for o caso, centrifugar a amostra a 540.000 × g por 10 min a 4 °C, e purificar o supernatante por cromatografia de exclusão de tamanho.
    NOTA: A cromatografia de exclusão de tamanho é realizada em uma coluna repleta de copolímero de dextran-acrilamida transligado (ver a Tabela de Materiais),previamente equilibrada com tampão TND, utilizando um sistema de cromatografia líquida de proteína rápida (ver a Tabela de Materiais). A coluna deve ser protegida da luz. Utilizou-se uma taxa de fluxo de 1 mL/min, e a eluição do construto deFAPP NBD-PH foi seguida pelo registro da absorvência em λ=280 (proteína) e 480 nm (NBD) na saída da coluna.
    1. Injete a amostra deFAPP NBD-PH carregada em um loop de injeção de 2 mL na coluna e colete imediatamente frações de 2,5 mL de eluato.
  2. Analise todas as frações que correspondem ao pico principal detectado em 280 e 480 nm em um gel SDS-PAGE de 15%. Misture uma amostra de 25 μL de cada fração com 15 μL de tampão de amostra de Laemmli antes de aquecer e carregar no gel.
    NOTA: Um pico principal, que é detectado simultaneamente em λ= 280 e 480 nm, aparece uma vez que um volume de ~150 mL tampão é passado através da coluna.
  3. Junte as frações que contêm exclusivamente proteína NBD-PHFAPP (~12,2 kDa) e adicione glicerol em uma concentração final de 10% (v/v). Concentre a amostra usando uma unidade de filtro centrífuga com um MWCO de 3 kDa a um volume final de 1 mL usando uma velocidade de centrifugação de 2300 × g.
  4. Prepare alíquotas e regise um espectro de absorvância conforme descrito para NBD-C2Lact. Use um coeficiente de extinção ε= 29.450 M-1.cm-1 para determinar a concentração da proteína com base na absorvância medida em λ=280 nm.

3. Preparação de lipossomos para ensaios de extração ou transferência de PS e PI(4)P

NOTA: Execute todas as etapas à temperatura ambiente, a menos que seja especificado de outra forma. Manuseie solventes orgânicos, rotavapor e nitrogênio líquido com cautela.

  1. Prepare ácido fresco, filtrado e desgaseado 50 mM 4-(2-hidroxitil)-1-piperazineethanesulfonic ácido (HEPES)-hidróxido de potássio (KOH), pH 7.4, 120 mM tampão de acetato de potássio (HK).
  2. Para cada tipo de lipossomo, pegue quantidades precisas de lipídios diferentes de soluções de estoque e misture-os em um frasco de vidro em forma de pera de 25 mL(Tabela 1). Adicione clorofórmio puro para ajustar o volume de cada mistura a 1 mL. Rotule cada frasco com o nome lipososom. Enrole os frascos contendo mistura lipídica dopada com Rhod-PE com papel alumínio.
  3. Coloque o frasco em um evaporador rotativo. Seque os lipídios sob vácuo e a 25 °C por pelo menos 30 min a uma velocidade de rotação de 500 rpm. Para filmes lipídides que contêm PI(4)P, pré-aquece o frasco a 32-34 °C por 5 min, sob rotação suave, para misturar adequadamente PI(4)P com os outros lipídios antes de criar vácuo no frasco para remover o solvente, o que deixará para trás um filme de lipídios secos na parede do frasco.
  4. Desconecte o frasco do evaporador e coloque-o em uma câmara de vácuo por 45 minutos para remover quaisquer vestígios restantes de solvente. Encha o frasco com 2 mL de tampão HK e adicione algumas contas de vidro de 4 mm de diâmetro à solução. Vórtice suavemente o frasco por 2 minutos para resuspensar os lipídios e preparar vesículas lipídicas multilamellar (MLVs) com uma concentração lipídica de 4 mM. Prepare 0,5 mL de alíquotas de MLVs em tubos de microcentrifus de tampa de parafuso de 1,5 mL.
  5. Descongele os tubos 5x (usando nitrogênio líquido e banho de água a 37 °C, respectivamente). Extrude os lipossomos ou armazene-os a -20 °C.
  6. Use uma mini extrusora para preparar os lipossomos (ou seja, grandes vesículas unilamellar) dos MLVs de acordo com as diretrizes do fabricante. Use um filtro de policarbonato com poros cilíndricos uniformes de 200 nm de diâmetro.
  7. Para preparar cada tipo de liposesomo, extrude pelo menos 250 μL da suspensão correspondente de MLVs. Armazene os lipossomos extrudados a 4 °C e no escuro se eles contiverem Rhod-PE. Use os lipossomos dentro de 2 dias.
Composição lipídica (mol/mol)Lipídio
Nome liposominoDOPC
(25 mg/mL)		POPS
(10 mg/mL)		16:0 Liss Rhod-PE
(1 mg/mL)		C16:0/C16:0-PI(4)P
(1 mg/mL)
Ensaios de extraçãoLipososome 2 mol% PSPC/PS 98/2247 μL12,5 μL
Lipososom 2 mol% PI(4)PPC/PI(4)P 98/2247 μL153 μL
Liposome do PCPC 100252 μL
Ensaios de transporteLA PC/PS/Rhod-PE 93/5/2234 μL31,4 μL200 μL
LA sem PSPC/Rhod-PE 98/2247 μL200 μL
LB PC/PI(4)P 95/5237 μL383 μL
LB sem PI(4)PPC 100252 μL
LA-Eq PC/PS/PI(4)P/Rhod-PE 93/2.5/2.5/2234 μL15,7 μL200 μL191 μL
LB-Eq PC/PS/PI(4)P 95/2.5/2.5239 μL15,7 μL191 μL

Tabela 1: Volumes de soluções de caldo lipíduo a serem misturados para preparação liposa. Abreviaturas: PS= fosfaticdylserine; PC = fosfatidylcholina; PI(4)P = fosfaticdylinositol 4-fosfato; Rhod-PE = fosfatidylethanolamina rotulada por rhodamina; DOPC = dioleoylphosphatidylcholine; POPS= 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine; 16:0 Liss Rhod-PE = 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl).

4. Medição da extração de PS ou PI(4)P

NOTA: As medições devem ser realizadas utilizando uma placa preta de 96 poços e um leitor de placa de fluorescência equipado com monocromadores: um para excitação de fluorescência e outro para emissão, com largura de banda variável.

  1. Prepare o tampão HK fresco, filtrado e desgaseado complementado com 1 mM MgCl2 (tampão HKM). Prepare lipossomos puros para PC e lipossomos de PC dopados com 2 mol% PS ou 2 mol% PI(4)P (concentração lipídica final de 4 mM, ver Tabela 1).
    NOTA: Mantenha os tubos cheios com a suspensão de lipossomos extrudados à temperatura ambiente durante todo o experimento, e mantenha as proteínas no gelo. Além disso, proteja os sensores lipídes da luz.
  2. Para o ensaio de extração de PS, em um poço, misture lipossomos contendo 2 mol% PS (80 μM de concentração lipídica final, 0,8 μM de concentração de PS acessível) com NBD-C2Lact (concentração final de 250 nM) em um volume final de 100 μL. Encha um segundo poço com a mesma quantidade de lipossomo (80 μM, 2 mol% PS) e NBD-C2Lact (250 nM) misturado com 3 μM LTP (Osh6p como controle positivo ou uma proteína de interesse).
    NOTA: Um tempo de incubação de 5 min é suficiente para osh6p alcançar a extração lipídica.
  3. Encha um terceiro poço com NBD-C2Lact (250 nM) misturado com lipossomos puros para PC (80 μM). Encha um quarto poço apenas com lipossomos puros para PC (80 μM). Repita as etapas 4.2-4.3 para preparar três séries adicionais de quatro poços.
  4. Para cada poço, registe um espectro NBD de 505 a 650 nm (largura de banda 5 nm) após excitação a 490 nm (largura de banda 5 nm) a 25 °C. Para cada série, subtraia o espectro registrado apenas com lipossomos dos outros espectros.
    NOTA: F e Fmax correspondem à intensidade a 536 nm medida com lipossomos contendo PS na presença ou ausência de LTP, respectivamente, enquanto F0 é a intensidade no mesmo comprimento de onda com lipossomos puros de PC. Para cada série, a porcentagem de PS acessível que é extraída pela proteína é dada usando a seguinte fórmula.
    100 × (1-((F-F0)/(Fmax-F0))) (4)
  5. Para o ensaio de extração PI(4)P, prepare os lipossomos dopados com 2 mol% PI(4)P, e realize medições com a sondaFAPP NBD-PH. Realize experimentos de controle e determine a porcentagem de extração da mesma forma descrita acima.
    NOTA: Lipososom e concentração de proteínas são idênticos aos utilizados no ensaio de extração de PS.

5. Medição em tempo real do transporte PS

NOTA: Um fluorímetro padrão (formato 90°) equipado com um suporte celular controlado pela temperatura e um agitador magnético é usado para gravar cinéticas de transferência lipídica. Para adquirir dados com precisão, é fundamental manter permanentemente a amostra na mesma temperatura (fixada entre 25 e 37 °C, dependendo da origem da proteína (por exemplo,levedura ou humana)) e mexê-la constantemente. O protocolo descrito abaixo é para a medição do transporte lipídico em uma amostra de 600 μL contida em uma célula de quartzo cilíndrico.

  1. Prepare o buffer HKM recém-desgaseado e filtrado. Mantenha os tubos contendo lipossomos extrudados à temperatura ambiente. Enrole tubos contendo lipossomos com rhod-PE em papel alumínio e/ou armazene-os em uma caixa opaca para evitar qualquer fotobleaching.
  2. Ajuste os monocromadores de excitação e emissão em λ = 460 nm (com largura de banda curta (1-3 nm)) e em λ = 530 nm (com uma grande largura de banda (≥ 10 nm)), respectivamente. Ajuste o tempo de aquisição em 25 min com uma resolução de tempo ≤ 1 s.
  3. No cuvette de quartzo, diluir 30 μL da suspensão liposasome LA e um volume de solução de estoque NBD-C2Lact em tampão HKM pré-armado para preparar uma amostra de 570 μL que contém lipídios totais de 200 μM e 250 nM NBD-C2Lact. Adicione uma pequena barra de agitação magnética e posicione a cuvette no suporte do fluorômetro.
  4. Uma vez que a amostra esteja termicamente equilibrada (após 3-5 min), acione a medição. Após 1 min, adicione 30 μL de suspensão liposasome lB (concentração final de lipídios totais de 200 μM) à amostra. Após 3 min, injete LTP na amostra para que a concentração final do LTP seja de 200 nM, e adquira o sinal para os 21 minutos restantes.
  5. Realize um experimento paralelo para normalizar o sinal NBD. Misture 30 μL de suspensão liposasome LA-Eq com 250 nM NBD-C2Lact em tampão HKM (volume final de 570 μL). Após 1 min, injete 30 μL de suspensão liposesome LB-Eq.
    NOTA: A composição lipídica dos liposetos LA-Eq e LB-Eq são semelhantes aos lipossos LA e LB utilizados no ensaio de transferência, exceto que cada um deles contém 2,5 mol% PS e 2,5 mol% PI(4)P. Como resultado, o sinal NBD medido, chamado FEq,corresponde ao sinal que deve ser medido se o PS foi totalmente equilibrado entre lipossómos LA e LB por um processo de transferência.
  6. Converta as curvas cinéticas medidas com um LTP de interesse para determinar a quantidade de PS (em μM) transferida de lipossómos LA para LB ao longo do tempo. Normalize cada ponto de dados (F) da curva usando a seguinte fórmula.
    FNorma = (F-F0)/(FEq-F0) (5)
    em que F0 corresponde ao sinal NBD pouco antes da adição de um LTP, e FEq é o sinal medido na etapa 5.5.
    NOTA: A quantidade de PS (em μM) transferida de lipossomos LA para LB corresponde a 2,5 ×NormaF, considerando que o equilíbrio corresponde a uma situação em que metade das moléculas de PS acessíveis, contido no folheto externo dos lipossomos LA, (ou seja,, correspondente a 5 mol% de 0,5 × lipídios totais de 200 μM) foi transferido para lipossomos LB.

6. Medição em tempo real do transporte PI(4)P

  1. Defina o fluorímetro (excitação e comprimento de onda de emissão, largura de banda, tempo de aquisição, resolução de tempo) como feito para o ensaio de transferência de PS. Da mesma forma, use o mesmo tampão, cuvette e lipossomos para realizar os experimentos sob constante agitação na mesma temperatura.
  2. No cuvette, misture 30 μL de suspensãoliposa eFAPP NBD-PH com tampão HKM pré-armado para obter um volume final de 570 μL (lipídios totais de 200 μM, 250 nM NBD-PHFAPP). Uma vez alcançado o equilíbrio térmico da amostra, inicie a medição e, após 1 min, injete 30 μL de suspensão liposasome LA. Após 3 min, injete o LTP de interesse (concentração final de 200 nM), e regisse o sinal.
  3. Realize um segundo experimento para normalizar o sinal NBD. Misture 30 μL de suspensão liposasome LB-Eq comFAPP NBD-PH de 250 nM em 570 μL de tampão HKM. Após 1 min, injete 30 μL de suspensão liposesome LA-Eq.
    NOTA: Aqui, o sinal NBD, chamado FEq,corresponde ao que deve ser medido se pi(4)P foi totalmente equilibrado entre lipossomos LA e LB.
  4. Converta as curvas cinéticas para determinar a quantidade de PI(4)P (em μM) transferida de liposomos LB para LA ao longo do tempo. Cada ponto de dados (F) é normalizado usando a fórmula 5 na qual f0 corresponde ao sinal NBD antes da adição de um LTP, e FEq é o sinal medido na etapa 6.3.
    NOTA: A quantidade de PI(4)P (em μM) transferida de lipossomos LB para LA corresponde a 2,5 ×NormaF, considerando que o equilíbrio corresponde a uma situação em que metade do PI(4)P contido no folheto externo dos lipossomos LB (ou seja, 0,5 × 5 μM) foi transferido em LA lipossoms.

7. Análise das curvas cinéticas

  1. Quantifique até que ponto uma LTP é eficiente, determinando a velocidade com que este LTP transfere lipídios de uma população liposoma para a outra nos primeiros segundos após sua injeção para o cuvette.
    1. Realize uma regressão linear dos primeiros pontos de dados da cinética de transferência para obter uma inclinação. Divida o valor da inclinação pela concentração de LTP na mistura de reação para determinar o número de moléculas lipídicas transferidas por proteína por unidade de tempo (min ou s).

Resultados

figure-results-58
Figura 1: Descrição dos sensores lipídicos fluorescentes e ensaios in vitro. (A) Modelos tridimensionais de NBD-C2Lact e NBD-PHFAPP baseados na estrutura cristalina do domínio C2 da lactadherina bovina (PDB ID: 3BN648) e a estrutura NMR do domínio PH da proteína FAPP1 humana (PDB I...

Discussão

Os resultados desses ensaios dependem diretamente dos sinais dos sensores lipídes fluorescentes. Assim, a purificação dessas sondas rotuladas em uma proporção de 1:1 com NBD e sem contaminação livre de fluoróforos NBD é um passo crítico neste protocolo. Também é obrigatório verificar se a LTP em análise está devidamente dobrada e não agregada. A quantidade de LTP testada nos ensaios de extração deve ser igual ou superior à das moléculas acessíveis de PS ou PI(4)P para medir adequadamente se este LTP ...

Divulgações

Os autores declaram que não há conflitos de interesse.

Agradecimentos

Somos gratos ao Dr. A. Cuttriss por sua cuidadosa revisão do manuscrito. Este trabalho é financiado pela Agência Nacional de Pesquisa francesa exCHANGE (ANR-16-CE13-0006) e pelo CNRS.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
 L-cysteine ≥97 % (FG) SigmaW326305-100GPrepare a 10 mM L-cysteine stock solution in water. Aliquots are stored at -20 °C
2 mL Amber Vial, PTFE/Rub Lnr, for lipids storage in CHCL3WheatonW224681
4 mm-diameter glass beadsSigmaZ265934-1EA
50 mL conical centrifuge tubeFalcon
ÄKTA purifierGE healthcareFPLC
Aluminium foil
Amicon Ultra-15 with a MWCO of 3 and 10 kDaMerckUFC900324, UFC901024
Amicon Ultra-4 with a MWCO of 3 and 10 kDaMerckUFC800324, UFC801024
AmpicillinPrepare a 50 mg/mL stock solution with filtered and sterilized water and store it at -20 °C.
BestatinSigmaB8385-10mg
BL21 Gold Competent CellsAgilent
C16:0 Liss  (Rhod-PE) in CHCl3 (1 mg/mL)Avanti Polar Lipids810158C-5MG
C16:0/C16:0-PI(4)P  Echelon LipidsP-4016-3Dissolve 1 mg of C16:0/C16:0-PI(4)P powder in 250 µL of MeOH and 250 µL of CHCl3. Then complete with CHCl3 to 1 mL. The solution must become clear.
C16:0/C18:1-PS (POPS) in CHCl3 (10 mg/mL)Avanti Polar Lipids840034C-25mg
C18:1/C18:1-PC (DOPC) in CHCl3 (25 mg/mL)Avanti Polar Lipids850375C-500mg
CaCl2 SigmaPrepare 10 mM CaCl2 stock solution in water.
Cell DisruptorConstant Dynamics
Chloroform (CHCl3) RPE-ISOCarlo Erba438601
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktailRoche5056489001
Deionized (Milli-Q) water
Dimethylformamide (DMF), anhydrous, >99% pure
DNAse I Recombinant, RNAse free, in powderRoche10104159001
DTTEuromedexEU0006-BPrepare 1 M DTT stock solution in Milli-Q water.  Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
Econo-Pac chromatography columns (1.5 × 12 cm).Biorad7321010
Electroporation cuvette 2 mmOzymeEP102
Electroporator Eppendorf 2510Eppendorf
Fixed-Angle Rotor Ti45 and Ti45 tubesBeckmanSpinning the batcerial lysates
Glass-syringes (10, 25, and 50 µL) for fluorescence experimentHamilton
Glass-syringes (25 , 100, 250, 500, and 1000 µL) to handle lipid stock solutionsHamilton1702RNR, 1710RNR, 1725RNR, 1750RN type3, 1001RN
Glutathione Sepharose 4B beadsGE Healthcare17-0756-05
Glycerol (99% pure)SigmaG5516-500ML
Hemolysis tubes with a cap
HEPES , >99 % pureSigmaH3375-500G
Illustra NAP 10 desalting columnGE healthcareGE17-0854-02
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) EuromedexEU0008-BPrepare 1 M IPTG stock solution in Milli-Qwater. Prepare 1 mL aliquots and store them at -20 °C. 
K-AcetateProlabo26664.293
Lennox LB Broth medium without glucosePrepared with milli-Q water and autoclaved.
Liquid nitrogenLinde
Methanol (MeOH) ≥99.8%VWR20847.24
MgCl2SigmaPrepare a 2 M MgCl2 solution. Filter the solution using a 0.45 µm filter. 
Microplate 96 Well PS F-Botom Black Non-BindingGreiner Bio-one655900
Mini-Extruder with two 1 mL gas-tight Hamilton syringesAvanti Polar Lipids610023
Monochromator-based fluorescence plate readerTECANM1000 Pro
N,N'-Dimethyl-N-(Iodoacetyl)-N'-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-yl)Ethylenediamine) (IANBD Amide)Molecular ProbesDissolve 25 mg of IANBD in 2.5 mL of dimethylsulfoxide (DMSO) and prepare 25 aliquot of 100 µL in 1.5 mL screw-cap tubes. Do not completely screw the cap. Then, remove DMSO in a freeze-dryer to obtain 1 mg of dry IANBD per tube. Tubes are closed and stored at -20 °C in the dark.  
NaClSigmaS3014-1KG
PBS137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM NaH2PO4, 1.8 mM KH2PO4, autoclaved and stored at 4 °C.
Pear-shaped glass flasks (25 mL, 14/23, Duran glass)Duran Group
PepstatinSigmap5318-25mg
pGEX-C2LACT  plasmidAvailable on request from our lab
pGEX-PHFAPP plasmidAvailable on request from our lab
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98.5% (GC)SigmaP7626-25gPrepare a 200 mM PMSF stock solution in isopropanol
PhosphoramidonSigmaR7385-10mg
Polycarbonate filters (19 mm in diameter) with pore size of 0.2 µmAvanti Polar Lipids610006
Poly-Prep chromatography column (with a 0-2 mL bed volume and a 10 mL reservoir)Biorad7311550
Prefilters (10 mm in diameter).Avanti Polar Lipids610014
PyMOLhttp://pymol.org/Construction of the 3D models of the proteins (Figure 1A)
Quartz cuvette for UV/visible fluorescence (minimum volume of 600 µL)Hellma
Quartz cuvettesHellma
Refrigerated centrifuge  Eppendorf 5427REppendorf
Rotary evaporatorBuchiB-100
Screw-cap microcentriguge tubes (1.5 mL)Sarsted
Small magnetic PFTE stirring bar (5 × 2 mm)
Snap-cap microcentriguge tubes (0.5, 1, and 2 mL)Eppendorf
SYPRO orangefluorescent stain to detect protein in SDS-PAGE gel
ThermomixerStarlab
THROMBIN, FROM HUMAN PLASMASigma10602400001Dissolve 20 units in 1 mL of milli-Q water and prepare 25 µL aliquots in 0.5 mL Eppendorf tubes. Then freeze and store at -80 °C.
Tris, ultra pureMP819623
Ultracentrifuge L90KBeckman
UV/Visible absorbance spectrophotometerSAFAS
UV/visible spectrofluorometer with a temperature-controlled cell holder and stirring deviceJasco or ShimadzuJasco FP-8300 or Shimadzu RF-5301PC
Vacuum chamber
Water bathJulabo
XK 16/70 column packed with Sephacryl S200HRGE healthcare

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