Criando quimeras do prosencéfalo aviário para avaliar o desenvolvimento facial

Resumo

Este artigo descreve uma técnica de transplante tecidual que foi projetada para testar as propriedades de sinalização e padronização do prosencéfalo basal durante o desenvolvimento craniofacial.

Resumo

O embrião aviário tem sido usado como um sistema modelo por mais de um século e levou à compreensão fundamental do desenvolvimento de vertebrados. Um dos pontos fortes desse sistema modelo é que o efeito e a interação entre os tecidos podem ser avaliados diretamente em embriões quiméricos. Mostramos anteriormente que sinais do prosencéfalo contribuem para a morfogênese facial regulando a forma do domínio de expressão do ouriço sônico (SHH) na Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ). Neste artigo, o método de gerar quimeras do prosencéfalo e fornecer ilustrações dos resultados desses experimentos é descrito.

Introdução

Muitas pesquisas contemporâneas em biologia do desenvolvimento se concentram no papel dos genes na formação de embriões. Existem boas ferramentas para examinar os mecanismos de desenvolvimento de uma perspectiva genética. No entanto, os embriões são montados e sofrem morfogênese em resposta às interações teciduais. O sistema aviário é uma ferramenta clássica usada para avaliar a variedade de interações teciduais que regulam o desenvolvimento pelas seguintes razões: a embriologia é bem compreendida, os embriões são facilmente acessíveis, as ferramentas para análise de sistemas aviários são bem desenvolvidas e os embriões são baratos.

O sistema de transplante aviário tem sido amplamente empregado para rastreamento de linhagens e para avaliar interações teciduais durante o desenvolvimento^há quase um século 1,2,3,4. Esse sistema foi utilizado para investigar um centro de sinalização, a Zona Ectodérmica Frontonasal (FEZ), que regula a morfogênese da mandíbula^superior5, e um vídeo foi publicado descrevendo essa técnica^{anteriormente6}. Além das codornas-pintinhos, outras espécies também têm sido utilizadas na produção de quimeras para análise de interações teciduais. Por exemplo, o camundongo FEZ foi transplantado de camundongos selvagens tipo⁷ e mutantes⁸, e outros utilizaram os sistemas pato, codorna e pintinho para avaliar o papel da crista neural na padronização do esqueleto facial 9,10,11,12.

Neste trabalho, o papel do prosencéfalo na regulação do padrão de expressão gênica no FEZ através do transplante do prosencéfalo ventral reciprocamente entre embriões de codorna, pato e pintinho foi avaliado, pois um sinal do prosencéfalo é necessário para induzir a expressão do ouriço sônico no FEZ. Os transplantes de prosencéfalo não são únicos no campo. Esses transplantes foram utilizados para avaliar o desenvolvimento da motilidade em embriões de codornas e^patos13, embora nesses experimentos também tenham sido transplantados tecidos que contribuíram para derivados não neurais. Em outros trabalhos, circuitos auditivos em aves foram avaliados por transplante de prosencéfalo14, mas esses transplantes continham células presuntivas da crista neural, que contribuem para a forma^facial9,10 e participam da regulação da expressão de SHH no^FEZ15. Assim, um sistema para transplantar apenas o prosencéfalo ventral de uma espécie de ave para outra antes do fechamento do tubo neural foi concebido para avaliar o papel do cérebro na forma facial¹⁶ (Figura 1A,B). Este método foi isento de contaminação da crista neural do enxerto. Neste artigo, o método é ilustrado e os resultados esperados são descritos, e os desafios enfrentados são discutidos.

Protocolo

Pato Pekin branco (Anas platyrhynchos), galinha Leghorn branco (Gallus gallus) e codorna japonesa (Cortunix coturnix japonica) são incubados a 37 °C em câmara umidificada até estágio combinado em HH7/8¹⁷.

1. Preparação do tecido doador

NOTA: A preparação de reagentes e ferramentas e a forma de abrir ovos para manipulação experimental foram descritas⁶.

1. Prepare meios DMEM com vermelho neutro, uma pipeta de transferência de vidro e agulhas de tungstênio afiadas.
2. Expor embriões (como mostrado em⁶).
3. Colher enxertos teciduais do lado esquerdo do prosencéfalo basal de embriões estágio 7/8. Use agulhas curvas de tungstênio^{afiadas 6} para incisar suavemente um pedaço do prosencéfalo medindo ~0,3 mm de comprimento por 0,2 mm de largura, certificando-se de não incluir a endoderme subjacente deslizando a agulha abaixo do prosencéfalo para que a agulha fique paralela ao eixo do tubo neural.
4. Usando a pipeta de transferência de vidro, pegue o enxerto do embrião doador.
5. Transfira o enxerto para DMEM contendo Vermelho Neutro (0,01% em PBS, 23 °C) por 2 minutos para corá-lo e, em seguida, coloque o enxerto corado em DMEM que não contenha Vermelho Neutro até que esteja pronto para o enxerto.

2. Preparação do anfitrião

1. Incubar ovos fertilizados de galinha Leghorn branca (Gallus gallus) a 37 °C em câmara umidificada até HH7/8 ¹⁷.
2. Expor embriões (como mostrado em⁶).
3. Usando agulhas de tungstênio afiadas, prepare o local do enxerto cortando suavemente e, em seguida, removendo um pedaço de prosencéfalo basal de 0,3 mm por 0,2 mm do lado esquerdo para acomodar o enxerto, como foi feito para isolar o tecido doador.
4. Tome cuidado para evitar a ruptura excessiva da endoderme subjacente, que será evidente à medida que os grânulos de gema começarão a vazar através de qualquer lágrima que for feita. Isso exige prática e nem todas as tentativas serão bem-sucedidas.
5. Após transferência para o hospedeiro⁶, posicionar o enxerto para substituir o prosencéfalo basal extirpado do hospedeiro.
6. Coloque a fita adesiva firmemente sobre o orifício e devolva o embrião à incubadora a 37 °C durante o período de tempo adequado para análise.

Resultados

Avaliação do quimerismo e contaminação por transplantes
Para avaliar as quimeras, a extensão do quimerismo e a contaminação do enxerto com outros tipos celulares devem ser abordadas. A criação de quimeras através do transplante de tecidos de codornas em embriões de pintinhos permite esse tipo de análise. O uso do anticorpo QCPN células de codorna podem ser visualizadas e distinguidas dos tecidos do hospedeiro (Figura 1 C,D). Neste caso, apena...

Discussão

O método descrito permite examinar as interações teciduais entre o prosencéfalo basal e o ectoderma adjacente. Essa abordagem difere dos métodos anteriores de transplante de prosencéfalo, pois o tecido doador era restrito ao prosencéfalo ventral. Isso elimina o transplante das células da crista neural, que comprovadamente participam da padronização da morfologia^facial9,10. Assim, a restrição do enxerto ao prosencéfalo basal foi essencial para avaliar...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x PBS	TEK	TEKZR114
35x10 mm Petri dish	Falcon	1008
DMEM	Thermofisher	11965084
Needle holder	Fine Science Tools	26016-12
Neutral Red	Sigma	553-24-2
No. 5 Dumont forceps	Fine Science Tools	11252-20
Pasteur Pipets	Thermofisher	13-678-6B
QCPN antibody	Developmental Studies Hybridoma bank, Iowa University, Iowa, USA
Scissors	Fine Science Tools	14058-11
Tungsten Needle	Fine Science Tools	26000